INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE

INTRODUZIONE ALLA PARTE

SPERIMENTALE

La maggior parte del mio lavoro di Tesi di Laurea è stato dedicato ad un progetto di ricerca, avviato da alcuni anni in collaborazione con il Prof. Katzenellenbogen, dell’Università dell’Illinois, il cui scopo è quello di identificare nuovi ligandi per i recettori degli estrogeni, dove l’anello fenolico “A” dell’estradiolo (maggiore ormone steroideo endogeno ad azione estrogenica), sia sostituito con un suo appropriato bioisostero.

Estradiolo D C B A HO OH

L’ossidrile di tale anello risulta importante per la forte interazione polare che si instaura tra il ligando e il recettore. Questo ossidrile è infatti coinvolto in una rete di legami a idrogeno con Glu353(305), Arg394(346) e una molecola d’acqua situati nel sito di binding di ERα(β). Tale interazione risulta ad alta energiaed è responsabile dell’elevata affinità tra recettore e ligando. Un ulteriore legame a idrogeno va a formarsi fra l’ossidrile alcolico in posizione 17β dell’estradiolo ed il residuo His524(475) della cavità di binding di ERα(β)(Figura 13).

Alla luce di ciò, qualsiasi modello farmacoforico deve prevedere nella sua struttura un anello fenolico che mima l’anello “A” dell’estradiolo o un suo bioisostero.

Il primo modello farmacoforico (Figura 14) studiato per poter sintetizzare composti affini ad entrambi i sottotipi recettoriali estrogenici (α e β) era strutturalmente composto da:22

Un core centrale variabile, che può essere un fenile, un alchene o eterociclo;

Un anello fenolico A, legato al core centrale, indispensabile per la sua affinità recettoriale;

Un anello aromatico B, sempre legato al core centrale ma in posizione opposta all’anello fenolico A, che può essere sostituito in varie posizioni;
Uno o due sostituenti sul core centrale, uno dei quali può essere un anello

aromatico.

B

A

"core" centrale

sostituente

sostituente

(aromatico)

HO

R

Figura 14. Modello farmacoforico di un ligando estrogenico

Nel laboratorio di ricerca dove ho svolto la mia tesi, sono stati sintetizzati in passato composti 3,4-diarilsalicilaldossimici e 3,4-diarilantranilaldossimici, derivati strutturali dalla classe dei ligandi diarilnaftalenici (Figura 15), dove i raggruppamenti

salicilaldossimico ed antranilaldossimico rivestono il ruolo di bioisosteri del gruppo

fenolico, in quanto possiedono uno pseudo-anello (A') a sei termini, che si forma grazie ad uno stabile legame a idrogeno intramolecolare fra l’ossidrile fenolico (o l’NH del gruppo anilinico) e l'azoto ossimico.23

derivati diarilnaftalenici A' A' 3,4-diarilantranilaldossime N N H HO R O N H HO 3,4-diarilsalicilaldossime A' 3 4 3 4 HO Sostituente (aromatico) R' R'' R' R'' R'' Figura 15

Lo pseudo-anello “A’” dei due derivati e l’anello A fenolico mostrano numerose analogie:24

1. presentano lo stesso ingombro sterico;

2. sono formati da un sistema planare esagonale con coniugazione π (tale coniugazione è parziale nelle salicilaldossime) ;

3. la pKa dell’OH ossimico esociclico cade nel range di pKa dell’OH fenolico (9-10), quindi i due ossidrili hanno acidità simile;

4. la posizione dell’OH ossimico corrisponde alla posizione 3 dell’OH fenolico. Durante questi studi preliminari è stato verificato che la rimozione dell’OH ossimico o la sua metilazione, nonché l’eliminazione dello pseudo-ciclo, portano ad una diminuzione di affinità nei confronti di entrambi i sottotipi recettoriali α e β. 24

Derivati 3,4-diarilsalicilaldossimici

I più significativi derivati 3,4-diarilsalicilaldossimici che sono stati sintetizzati nel laboratorio di ricerca presso il quale ho svolto la mia attività di tesi negli anni precedenti sono i composti 1a-d rappresentati in Figura 16.25

RBA ERα = 0.92 % RBA ERβ = 0.35 % RBA ERα = 0.97 % RBA ERβ = 2.2 % RBA ERα = 2.6 % RBA ERβ = 1.4 % RBA ERα = 1.13 % RBA ERβ = 1.71 % OH OH O H N HO OH O H N HO OH O H N HO N HO O H Figura 16

L’affinità di binding recettoriale di questi composti è stata valutata attraverso saggi radiometrici di spiazzamento competitivo del [3H]estradiolo sui sottotipi recettoriali ERα ed ERβ umani ricombinanti purificati. I dati delle affinità relative di binding (RBA) sono rapportati all’estradiolo (Kd = 0.2 nM sull’ERα e 0.5 nM sull’ERβ) la cui affinità è normalizzata al 100 % su entrambi i sottotipi.33, 34

Il composto 1a, che non è sostituito, ha una discreta selettività per entrambi i sottotipi recettoriali α e β (Figura 16). Il composto 1b, che rispetto al composto 1a presenta un OH in posizione 4 dell’anello distale, ha un’affinità maggiore verso i recettori α (RBA su ERα = 2.6% e RBA su ERβ = 1.4%) (Figura 16). Caso contrario nel composto 1c, che avendo un OH in posizione 4 dell’anello prossimale, vede aumentata l’affinità per il recettore β (RBA su ERα = 0.97% e RBA su ERβ = 2.2%) (Figura 16). L’introduzione di due gruppi OH nella posizione 4 ciascuno rispettivamente negli anelli prossimale e distale porta ad una generica diminuzione di affinità, che risulta particolarmente evidente nei confronti del recettore β (Figura 16).

Derivati 3,4-diarilantranilaldossimici

Sostituendo l’atomo di ossigeno dello pseudo-ciclo dei derivati salicilaldossimici, con un atomo di azoto, sono stati sviluppati derivati antranilossimici. Nel laboratorio di ricerca dove ho svolto la tesi, in passato, erano stati sintetizzati una prima serie di derivati 3,4-diarilantranilaldossimici (2a-c, Figura 17).26

2c 2b 2a ERα = 0.47 % ERβ = 0.048 % ERα = 2.2 % ERβ = 2.8 % ERα = 3.7 % ERβ = 5.2 % A' N H N Et HO N H N H HO A' A' N H N Me HO Figura 17

Da saggi radiometrici di spiazzamento effettuati su questi composti risulta che il composto non sostituito sull’azoto anilinico 2a mostra un’affinità simile per entrambi i sottotipi recettoriali (RBA su ERα e ERβ, rispettivamente del 2.2 % and 2.8 %), mostrando un’attività di agonista per il recettore α e di parziale antagonista per il recettore β. L’aggiunta di un gruppo metilico sull’azoto anilinico, composto 2b, ha mostrato un aumento di affinità verso entrambi i sottotipi recettoriali, in particolare per il β (RBA ERα = 3.7 % e RBA ERβ = 5.2 % ) con attività agonista principalmente su ERα. L’introduzione di un gruppo alchilico più grosso come il gruppo etilico sullo stesso azoto (composto 2c), porta invece ad una drastica diminuizione di affinità verso entrambi i recettori rispetto all’analogo N-metil sostituito.

Tramite un’analisi computazionale su questi composti, è stato confermato quanto visto per i saggi di spiazzamento, infatti il docking sul composto 2b mostra come il gruppo “N-Me” s’inserisca in una tasca idrofobica delimitata dai residui aminoacidici Leu346, Leu349 e Ala350 (Figura 18), la quale è molto piccola e quindi non è in grado di accogliere il gruppo etilico dell’azoto del composto 2c. Infatti s’instaurano delle forze repulsive di Van der Waals in particolar modo tra il gruppo N-etilico ed il residuo Leu349.26

A B

Figura 18. A) Docking del composto 2c (“N-Et”); B) docking dei ligandi 2b e 2c

sovrapposti. Nel docking dei ligandi gli atomi di ossigeno e di azoto sono colorati rispettivamente di rosso e di blu.

Al composto N-metil sostituito sono state apportate in seguito varie modifiche riguardanti gli anelli aromatici legati nella posizione 3 e 4 del core centrale, dando origine ad una seconda serie di derivati 3,4-diarilantranilaldossimici (2b’, 2b’’, 2b’’’ , Figura 19).27 2b''' 2b'' 2b' ERα = 1.96 % ERβ = 0.14 % ERα = 5.38 % ERβ = 1.11 % ERα = 1.17 % ERβ = 0.72 % A' N H N Me HO OH OH N H N Me HO OH A' A' N H N Me HO OH Figura 19

Il composto 2b’, avente un gruppo OH in posizione 4 nell’anello distale presenta un aumento dell’affinità per ERα e una riduzione per l’isoforma beta. L’OH in posizione 4 dell’anello aromatico prossimale del composto 2b’’ provoca una riduzione di affinità per

entrambi i sottotipi recettoriali α e β. L’introduzione dei due gruppi OH ciascuno in posizione 4 dell’anello prossimale e distale del composto 2b’’’, determinano una drastica riduzione di affinità nei confronti di ERβ, mentre si mantiene una discreta affinità per ERα.

Sia i derivati 3,4-diarilsalicilaldossimici che i derivati 3,4-diarilantranilaldossimici sintetizzati non hanno mostrato soddisfacenti livelli di selettività, né verso il sottotipo recettoriale α né verso il β.

Derivati indazolici

Il recente sviluppo di nuovi e selettivi ligandi per ERβ è stato avviato grazie ad alcune osservazioni effettuate su prodotti naturali, in particolare sulla genisteina (Figura 20) (principale isoflavone estrogenico della soia) che presenta un’azione antiproliferativa a livello del tumore della ghiandola mammaria senza però avere gli effetti collaterali caratteristici degli antiestrogeni. Questa azione è attribuita ad una elevata affinità della genisteina nei confronti del recettore ERβ, confermata dai saggi di binding dove l’RBA su questo sottotipo recettoriale raggiunge il 7.4%. Inoltre la genisteina presenta anche una buona selettivà per ERβ (RBA β/α = 440).28 Tramite un’analisi di docking è stato ipotizzato che la differenza strutturale del sito di binding dei due sottotipi recettoriali α e β (vista nella parte dell’introduzione generale) possa spiegare il perché della maggiore affinità e selettività che la genisteina ha per ERβ. La presenza della Met421 in ERα crea una forza repulsiva, seppur debole, tra la parziale carica negativa dell’atomo di zolfo presente nella catena laterale di tale aminoacido e i gruppi elettronegativi presenti nel ligando, ovvero l’atomo di ossigeno chetonico ed il gruppo ossidrilico in posizione “peri” ad esso. Questo non accade nel recettore β poiché la Met421 è sostituita da Ile373, aminoacido con caratteristiche esclusivamente idrofobiche.29

Genisteina O OH HO OH O RBA ERα = 0.017% RBA ERβ = 7.4% β/α = 440 Figura 20

Questi dati sono stati la fonte di un aumentato interesse verso il sottotipo recettoriale β e hanno ispirato la ricerca di ligandi β-selettivi. Inoltre tenendo conto, che il volume della cavità di legame di ERβ è più piccolo rispetto a quello di ERα (vedi introduzione generale), è stato creato un nuovo modello farmacoforico con diminuito ingombro sterico, che vede la sostituzione dell’anello aromatico del core centrale, con un ciclo fuso all’anello fenolico e la contemporanea perdita del sostituente aromatico posto sulla porzione centrale (Figura 21). Sulla base di questo modello, dal gruppo di ricerca del Prof. Katzenellenbogen, è stato introdotto il nucleo indazolico come eterociclo del core centrale (Figura 21). Sono stati così sintetizzati alcuni derivati indazolici che si differenziano fra loro principalmente per i diversi sostituenti elettrofili di piccole dimensioni (es. R = CF3, Cl, CN, Figura 21) che portano in posizione 3 del nucleo indazolico. Questi sostituenti si sono rivelati molto efficaci nell’aumentare l’affinità recettoriale per il sottotipo β, in modo particolare si ottengono buoni risultati con la presenza di un atomo di cloro. Infatti, il derivato 3-cloro-sostituito, portante un gruppo OH in posizione 5 dell’indazolo è risultato il composto più affine per l’isoforma beta (RBA ERβ = 32.1%) con un fattore di selettività di oltre cento volte superiore rispetto all’isoforma alfa. 30

modello farmacoforico dei ligandi β-selettivi

N N R OH HO R = CF3, CN, Cl sostituenti Core Centrale OH HO sistema indazolico 1 2 3 4 5 6 7 1' 2' 3' 4' 5' 6' Figura 21

Derivati salicilaldossimici monoaril-sostituiti

In conformità al modello farmacoforico descritto in Figura 21 ed in base ai risultati osservati nelle precedenti esperienze di sintesi di ligandi estrogenici (in modo particolare per ligandi β-selettivi), sono stati sintetizzati, dal gruppo di ricerca con il quale ho svolto la mia attività di tesi, alcuni derivati salicilaldossimici monoaril-sostituiti,il cui capostipite è rappresentato dal composto 3 (Figura 22).31

modello farmacoforico dei ligandi β-selettivi

O OH N H HO sostituenti Core Centrale OH HO 3 ERα = 0.007 % ERβ = 0.553 % β/α = 79 Figura 22

Il composto 3 presenta come supporto centrale un anello aromatico, al quale è legato lo pseudo-ciclo tipico delle salicilaldossime che mima l’anello fenolico dei ligandi estrogenici ed un anello aromatico p-idrossisostituito in posizione 4. Esso si differenzia dagli analoghi salicilaldossimici precedentemente sintetizzati per la perdita del sostituente aromatico in posizione prossimale rispetto allo pseudo ciclo, come suggerito dal modello farmacoforico per ligandi β-selettivi. Da saggi di binding recettoriale si evidenzia che il composto 3 presenta un’ottima selettività per ERβ (β/α = 79), ma una scarsa affinità recettoriale per la stessa isoforma (RBA su ERβ = 0.553%).

A tale composto sono state apportate numerose modifiche strutturali al fine di ottenere dei ligandi che mantenessero la sua selettività per ERβ, ma che al tempo stesso aumentassero l’affinità recettoriale per lo stesso sottotipo. La prima modifica effettuata sul composto 3 è stata quella di provare ad introdurre piccoli sostituenti (R= CH3, Cl, CN) in posizione 3 dell’anello aromatico centrale, come era stato fatto per i derivati indazolici. Il miglior risultato è stato ottenuto dal composto 4, contenente un atomo di cloro in posizione 3 (Figura 23); infatti tale composto migliora decisamente l’affinità per ERβ (RBA = 4.21%) e mantiene un elevato rapporto di selettivià rispetto all’altra isoforma.

111 111111111 O N H HO OH 3 O OH N H Cl HO 4 3 3 R RBA ERα = 0.007% RBA ERβ = 0.553% β/α = 79 RBA ERα = 0.065% RBA ERβ = 4.21% β/α = 65 Figura 23

Successivamente nel composto 4 sono state apportate altre modifiche strutturali nell’intento di migliorare ulteriormente la selettività per ERβ (Figura 24):32

a) è stato introdotto un atomo di fluoro in posizione 3’ dell’anello distale, per dare il composto 4a che ha mostrato un ulteriore miglioramento in affinità rispetto al composto 4, con un RBA per ERβ del 7.01% ed una β/α ratio pari a 62; inoltre è dotato di un carattere ERβ-agonista più marcato rispetto al composto

4;

b) è stato aggiunto un metile sul carbonio ossimico (composto 4b), come era già stato fatto nella serie dei derivati 3,4-diarilsalicilaldossimici, ma questa modifica non ha portato ad alcun effetto positivo in termini di affinità e selettività per il sottotipo recettoriale ERβ;

c) sono stati inseriti contemporaneamente un atomo di fluoro in posizione meta nell’anello distale e un metile sul carbonio ossimico (composto 4c), ma anche questa combinazione di sostituenti non ha portato alcun miglioramento né di affinità né di selettività.

111 111111111 O OH N H Cl HO 4 3 RBA ERα = 0.065% RBA ERβ = 4.21% β/α = 65 3' F CH3 111111111 O OH N H Cl HO F 4a 111111111 O OH N H Cl HO CH3 4b O OH N H Cl HO CH3 F 4c RBA ERα = 0.114% RBA ERβ = 7.01% β/α = 62 111111111 RBA ERα = 0.012% RBA ERβ = 0.123% β/α = 10 111111111 RBA ERα = 0.0o6% RBA ERβ = 0.077% β/α = 13 Figura 24

Un ulteriore modifica strutturale apportata al composto 3 è stata quella di provare ad

invertire la posizione della porzione ossimica con quella ossidrilica (composto 5, Figura

25).32 I risultati ottenuti sono stati gratificanti, poiché l’affinità per ERβ (RBA ERβ = 2.64%) è stata incrementata rispetto al composto 3, sebbene non abbia raggiunto i livelli del composto 4a.

111111111 O N H HO OH 3 O OH N H HO 5 RBA ERα = 0.007% RBA ERβ = 0.553% β/α = 79 RBA ERα = 0.064% RBA ERβ = 2.64% β/α = 41 Figura 25

Contrariamente a quanto visto nei derivati salicilaldossimici monoarilsostituiti discussi prima, l’introduzione nel composto 5 di un atomo di fluoro in posizione 3’ dell’anello distale (composto 5a) ha portato ad una riduzione d’affinità per il recettore β (RBA ERβ = 0.970%) (Figura 26).32 O OH N H HO 5 RBA ERα = 0.064% RBA ERβ = 2.64% β/α = 41 O OH N H HO F 5a RBA ERα = 0.021% RBA ERβ = 0.970% β/α = 46 F Figura 26

Parte del mio lavoro di tesi è stato dedicato a combinare due delle modifiche strutturali sopra citate che avevano portato a dei risultati positivi in termini di affinità selettiva per il recettore ERβ, ovvero mi sono occupata della sintesi del composto 6 (Figura 27) in cui vengono applicate simultaneamente l’inversione dei gruppi OH ed ossimico rispetto al capostipite 3, insieme all’inserimento di un atomo di cloro sullo scaffold centrale in posizione 3. O OH N H HO 3 O OH N H Cl HO 4 3 O OH N H HO 5 O OH N H HO Cl 6 Cl 3 Figura 27

La stessa via sintetica che ho seguito per la preparazione di 6, mi ha permesso di ottenere anche il derivato 7, che ha al posto dell’atomo di cloro un ulteriore anello aromatico para-idrossifenilico (Figura 28). Praticamente la sua struttura è quella delle 3,4-diarilsalicilaldossime, vista precedentemente, avente però il gruppo ossimico invertito con il gruppo ossidrilico. O OH N H HO OH 7 Figura 28

Un’altra parte della mia tesi è stata dedicata alla sintesi di derivati salicilaldossimici portanti sostituenti aromatici nelle posizioni 4 e 5 (composti 8 e 9, Figura 30). Questi due tipi di composti sono stati progettati in quanto studi di docking effettuati sul composto 5 nel recettore ERβ (Figura 29), hanno evidenziato le seguenti interazioni: l’ossidrile ossimico dello pseudo-ciclo interagice con Glu305, Arg346 e una molecola d’acqua, mimando quindi l’ossidrile dell’anello “A” dell’estradiolo. Invece lo shift dell’anello

p-fenolico dalla posizione 4 alla posizione 5 del supporto centrale, fa sì che l’ossidrile dello stesso anello stabilisca un legame ad idrogeno con la Thr299 anziché con l’His475 (come invece avviene con il gruppo 17β-OH dell’estradiolo). La formazione di questo nuovo legame è possibile perché in ERβ c’è abbastanza spazio per l’inserimento dell’anello fenolico nella tasca delimitata dalla Met336, aminoacido presente soltanto in ERβ (Figura 29).32

Figura 29. Analisi di docking nell’ERβ del composto 5

Si è pensato così di inserire un secondo anello p-OH-sostituito nella posizione 4 dello scaffold salicilaldossimico (in para rispetto all’ossima) in modo da tentare di ripristinare anche l’interazione con il residuo His475, oltre a quella con Thr299.

I composti “target” 8 e 9 (Figura 30) differiscono fra loro per il fatto che il composto 8 presenta i due anelli para-idrossifenilici legati direttamente al supporto centrale, mentre nel composto 9 l’anello in posizione 4 del supporto centrale è legato ad esso mediante un gruppo chetonico, allo scopo di verificare l’eventuale importanza che ha l’inserimento di uno spaziatore, per poter avvicinare ulteriormente l’ossidrile fenolico del sostituente in 4 al residuo His475. O OH N H HO 5 9 N O OH H HO O OH N O OH OH H HO 8 OH O OH O H N OH 10 A + Figura 30

Purtroppo le vie sintetiche di entrambi i composti 8 e 9 si sono rivelate abbastanza complicate fin dai primi passaggi. Pertanto nell’ambito della presente tesi di Laurea sono riuscita a percorrere la prima parte della vie di sintesi prevista per l’ottenimento del composto 9, riuscendo a preparare un suo importante intermedio sintetico che potrà costituire la base di partenza per ulteriori ricerche volte a completare la sintesi di 9. La via sintetica da me iniziata potrà servire, come vedremo dalla discussione della sintesi, anche per l’ottenimento del derivato salicilaldossimico 10, che rappresenta un regioisomero del composto 9 (Figura 30).

Sintesi dei composti 6 e 7

La sintesi dei derivati salicilaldossimici 6 e 7 è mostrata nello Schema 1.

SCHEMA 1 Cl AcOCH2 MeO Cl BrCH2 MeO Cl HOCH2 MeO Cl CH3 MeO Cl MeO O Cl Br MeO O 18 19 20 2 metil-3 cloroanisolo 21 17 Cl MeO OMe O Cl HO OH O Cl O OH N H HO MeO OMe OMe O HO OH OH O O OH N H OH HO 22 24 23 25 7 6 a b c d e f g _h g h f Reagenti e condizioni:

a) NBS, Bz2O2, CCl4, riflusso 3h; b)AcONa, AcOH, riflusso 3h; c)THF, MeOH, NaOH al 20% aq., riflusso 3h; d) MnO2, toluene, riflusso 1h; e) Br2, AcOH, t. a., 2gg; f) acido 4-metossifenilboronico, aq. Na2CO3 2M, Pd(OAc)2, PPh3, toluene/etanolo 1:1, 100 °C, 24 h; g) BBr3, CH2Cl2 anidro, -78 °C→ t.a., 1h; h) NH2OH·HCl, etanolo, acqua, 50 °C, 1h.

Il 2-metil-3-cloroanisolo commerciale è stato sottoposto ad una reazione di bromurazione radicalica con N-bromosuccinimmide e perossido di benzoile in CCl4, ottenendo così il bromuro benzilico 17. Quest’ultimo è stato trattato con acetato di sodio in AcOH formando, mediante una sostituzione nucleofila bimolecolare, il composto 18. Successivamente il gruppo acetilico è stato rimosso mediante idrolisi alcalina usando NaOH acquoso al 20% in THF e MeOH, arrivando così al derivato alcolico 19. La reazione di ossidazione controllata eseguita sul gruppo alcolico primario di questo composto, è stata fatta con ossido di manganese in toluene, ottenendo così la benzaldeide corrispondente 20. Quest’ultima è stata fatta reagire con bromo (1.1 eq.) in AcOH dando origine al composto 21. Allo scopo di verificare che la reazione di monobromurazione avviene in modo regioselettivo sulla posizione para rispetto al gruppo metossilico, e non sulla posizione orto, sono stati effettuati degli esperimenti NOE-NMR, effettuati dalla Dr.ssa Federica Balzano del gruppo della Prof. Gloria Uccello-Barretta, presso il Dip. di Chimica e Chimica Industriale dell’Università di Pisa. Tali esperimenti hanno confermato l’effettivo attacco dell’atomo di bromo nella posizione desiderata, in quanto irraggiando una soluzione del composto 21 (Figura 31 A) in CDCl3 a 3.91 ppm (OMe), si osserva un aumento d’intensità a 6.89 ppm dovuta al picco di assorbimento del protone in posizione

orto al metossile (HA) (Figura 31 C). A riprova dell’effettiva vicinanza spaziale del metossile e del protone HA, è stato effettuato anche l’esperimento inverso: il composto 21 è stato irraggiato alla frequenza di 6.89 ppm (associata al protone HA in questione); anche in questo caso è stato notato l’incremento del picco a 3.91 ppm relativo al metossile, oltre che naturalmente del segnale dell’altro protone aromatico HB a 7.73 ppm (Figura 31D).

Figura 31. A) Struttura del composto 21; B)1HNMR del composto 21; C)-D) Spettro NOE del composto 21.

Il composto 21 è stato quindi sottoposto ad una reazione di cross-coupling nelle condizioni di Suzuki con acido 4-metossifenilboronico per dare il prodotto monoarilsostituito 22. Nel caso in cui il ciclo di reazione di cross-coupling sia ripetuto, nelle medesime condizioni, sull’intermedio 21, è stato legato all’anello aromatico anche un secondo anello p-metossifenilico al posto dell’atomo di cloro, ottenendo così il composto diarilsostituito 24. Su entrambi i prodotti 22 e 24 è stata eseguita la demetilazione con BBr3 in CH2Cl2 anidro per formare rispettivamente i composti 23 e 25 che a loro volta sono stati trasformati nelle rispettive nelle ossime 6 e 7 per reazione con idrossilammina cloridrato in EtOH. Cl Br MeO O HA HB H 21 B A C D CHO _HB HA OCH3 1 HNMR NOE NOE

Tentativo di sintesi del composto 8

Il tentativo di sintesi del derivato salicilaldossimico 8 è mostrato nello Schema 2.

SCHEMA 2 Cl Cl O HO Cl Cl HO H O O O HO OMe OMe N O OH OH H HO a 4,5 dicloro-2-idrossi-benzaldeide a' a a'' 8 26 28 27 HO H OMe OMe O O Reagenti e condizioni:

a) acido p-metossifenilboronico, Pd2(dba)3, tricicloesilfosfina (PCy3) al 20% toluene 88% di purezza, cesio carbonato (Cs2CO3), diossano, 80°C, 16h; a’)etilen glicole anidro, ac. P-toluensolfonico anidro, toluene anidro, riflusso con trappola di Dean- stark,130°C, 80h; a’’) HCl 1N, EtOH ass. 72h.

La reazione di cross-coupling in condizioni riporate originariamente dal Prof. Gerg FU dell’MIT33 con acido p-metossifenilboronico sulla 4,5-dicloro-2-idrossi-benzaldeide commerciale è stata provata più volte e in modalità diverse. La prima volta il prodotto di partenza è stato sottoposto a due cicli di cross-coupling, allo scopo di attaccare due para-metossifenili, ma la reazione ci ha portato ad una miscela complessa di sottoprodotti da cui non è stato possibile recuperare il prodotto desiderato (composto 26). Temendo che la presenza della porzione salicilaldeidica potesse nuocere all’efficacia del sistema catalitico, è stato deciso di provare a proteggere il gruppo aldeidico con un acetale ciclico (composto

27), quindi la 4,5-dicloro-2-idrossi-benzaldeide commerciale è stata sottoposta a reazione

con etilenglicole anidro e acido p-toluensolfonico anidro (catalizzatore) in toluene distillato. Per la reazione è stata usata la trappola di Dean-Stark che raccoglie l’acqua che si forma durante le reazione. È stato poi effettuato un tentativo di cross-coupling in condizioni di FU con acido p-metossifenilboronico, sul prodotto 27, ripetendo due cicli. Purtroppo neanche in questo caso siamo riusciti ad ottenere l’intermedio diarilsostituito.

Tentativo di sintesi dei composti 9 e 10

Il tentativo di sintesi dei derivati salicilaldossimici 9 e 10 è mostrato nello Schema 3.

SCHEMA 3 Br MeO OH O Br HO OH O Br HO O OMe a b c Br O O OMe Br HO O OMe Br HO O OMe Br HO O OMe Br HO O OMe Br HO O OMe O N O OH H HO O OH OH O OH O H N OH 10 d d e e f 29 30 31 32 33 34 35 36

acido 2-bromo-5metossi- benzoico

9

Reagenti e condizioni:

a) BBr3, CH2Cl2 anidro, -78 °C→ t.a., 1 h; b) grafite, anisolo, MeSO3H, 80 °C, 2 h; c) allil bromuro, K2CO3, CH3CN, 80 °C, 3 h; d) N-metilanilina distillata, 180 °C, 4-5 h; e) t-BuOK, DMSO, 55 °C, 12 h; f) NaIO4, OsO4,t-BuOH, acqua, diossano, t.a., 2 h.

L’acido 2-bromo-5-metossibenzoico commerciale è stato sottoposto a reazione di deprotezione con BBr3 in CH2Cl2 anidro ottenendo il composto 29. Quest’ultimo è stato trattato con grafite e anisolo in acido metansolfonico per dare una reazione di acilazione di Fridel-Crafts che ha portato all’ottenimento del composto 30, il quale a sua volta ha subito una O-allilazione utilizzando allil-bromuro e potassio carbonato in acetonitrile. Il prodotto

31 così ottenuto è stato sottoposto ad una trasposizione di Claisen in N-metilanilina a 180

°C, che ha condotto ai due intermedi regio isomeri 32 e 34 in rapporto 3:7. In questo passaggio è stato fondamentale mettere a punto il tempo di reazione della trasposizione. Infatti se tale reazione è portata avanti per 18 ore, come fatto in precedenza per analoghi schemi sintetici su substrati diversi, si ottengono miscele complesse di difficile risoluzione. Quindi abbiamo iniziato a controllare la reazione da un punto di vista temporale, arrivando a concludere che per ottenere in modo ottimale i prodotti riarrangiati 32 e 34 erano necessarie 4 - 5 ore, sebbene la reazione non giunga a completezza, allo scopo di evitare decomposizioni dei prodotti.

Su questi due composti, opportunamente separati e purificati, è stata effettuata una reazione di isomerizzazione del doppio legame con t-BuOK in DMSO, ottenendo così i prodotti stilbenici 33 e 35, rispettivamente. Sul composto 35 è stata fatta la scissione ossidativa con sodio periodato, acqua e una soluzione al 2.5% di OsO4 in tert-butanolo e diossano, per ottenere il composto 36. In questo schema di sintesi mi sono fermata ai composti 33 e 35, che attualmente costituiscono dei preziosi intermedi per proseguire gli studi sintetici volti alla preparazione di questa classe di composti.

Saggi di binding recettoriale

I composti sintetizzati sono stati sottoposti a prove di binding recettoriale mediante saggi radiometrici di spiazzamento competitivo del [3H]estradiolo sui sottotipi recettoriali ERα ed ERβ umani ricombinanti purificati. I dati delle affinità sono rapportati a quelli dell’estradiolo (Kd = 0.3 nM per ERα e 0.5 nM per ERβ) la cui affinità è considerata pari al 100% (Tabella 1). La Tabella 1 riporta i dati di affinità recettoriale ottenuti con i due nuovi composti sintetizzati nella presente Tesi (6 e 7), insieme a quelli precedentemente riportati per i composti di riferimento 3-5.

Tabella 1 Struttura ERαααα umano- RBA (%) ERββββ umano- RBA (%) ββββ/αααα estradiolo (100) (100) 1 O OH N H HO 3 0.007 ±0.001 0.553±0.110 79 O OH N H Cl HO 4 3 0.065 ± 0.016 4.21 ± 0.66 65 O OH N H Cl HO F 4a 0.114 ± 0.030 7.01 ± 1.00 62

O OH N H HO 5 0.064 ± 0.001 2.64 ± 0.62 41 O OH N H HO Cl 6 4.46 ± 0.6 130.3 ± 25 30 O OH N H HO OH 7 88.4 ± 18 100.7 ± 2 1

Come si osserva dalla Tabella 1, il composto 6 mostra un’eccezionale affinità recettoriale per ERβ, maggiore finora rispetto a tutti gli altri composti appartenenti a questa classe strutturale mai sintetizzati finora. Si passa infatti ad un RBA di ERβ= 7.01% del miglior composto sintetizzato in precedenza (composto 4a) ad un RBA di ERβ= 130.3% del composto 6, corrispondente ad un valore di binding assoluto pari ad una Ki di 0.38 nM. Nonostante il composto 6 mostri una notevole affinità per ERβ, possiede però una selettività ridotta (β/α= 30) rispetto ai composti 3-5 di riferimento.

Il composto 7 mostra invece un’alta affinità recettoriale per entrambi i sottotipi α e β con un RBA di ERβ= 100.7% e un RBA di ERα= 88.4%. Per questo motivo la sua selettività è molto bassa (β/α= 1) ed è inferiore a quella di tutti i composti riportati in Tabella 1.

Molecular Modeling.

Per esplorare le interazioni tra i nuovi composti sintetizzati e i siti di legame ERα e ERβ, ci siamo avvalsi della collaborazione con il Dr. Tiziano Tuccinardi e il gruppo di ricerca del Prof. Adriano Martinelli che hanno realizzato gli studi di docking.

Il prodotto 6 derivante dalla contemporanea inversione della posizione del gruppo ossimico con quello fenolico insieme all’inserimento di un atomo di cloro sul supporto centrale del composto 3, mostra rispetto a quest’ultimo un incremento notevole in affinità su ERβ. La Figura 32 A mostra i risultati di docking effettuati sul ligando 6 nel sito di binding di ERβ: il sistema pseudo-ciclico/ossimico interagisce con il sistema Glu305/Arg346/acqua; lo spostamento del gruppo fenolico dalla posizione 4 a quella 5 dell’anello centrale determina la perdita del legame a idrogeno con Gly472 e His475 e la formazione di un nuovo legame ad idrogeno con Thr299, infine l’atomo di cloro è inserito in una tasca lipofila delimitata da Ala302, Trp335, Met336 e Leu339. Tali interazioni, sono molto simili a quelle riportate per il composto 5 (Figura 29),32 da cui il composto 6

differisce per la presenza di un atomo di cloro in posizione 6. In precedenza era stato visto che la forte interazione esistente tra l’OH dell’anello fenolico del composto 5 e la Thr299 era possibile soltanto in ERβ, perché solamente in questa isoforma c’è abbastanza spazio per l‘inserimento dell’anello fenolico nella tasca delimitata dalla Met336 (aminoacido presente soltanto in ERβ). Infatti in ERα, la Met336 è sostituita da Leu384 e ciò causa una differente disposizione del composto 6 all’interno della cavità di legame di ERα (Figura 32B): il sistema pseudo-ciclico/ossimico interagisce con Gly521 e His524 e l’OH dell’anello fenolico forma una rete di legami con Glu353/Arg394/acqua. L’ulteriore incremento di affinità del ligando 6 per l’isoforma β, rispetto al composto 5, può essere spiegato, almeno in parte, grazie all’interazione idrofobica aggiuntiva che l’atomo di cloro, inserito sul supporto centrale, può instaurare con i residui amminoacidici delimitanti la suddetta tasca lipofila (Ala302, Trp335, Met336 e Leu339).

Figura 32. Analisi di docking di 6 in ERβ (A) e in ERα (B).

La Figura 33 mostra il docking risultante del composto 7 in ERα (Figura 33 A) e ERβ (Figura 33 B). Il prodotto 7 derivante dalla contemporanea inversione della posizione del gruppo ossimico con quello fenolico insieme all’inserimento di un anello p-idrossifenilico sul supporto centrale del composto 5, mostra rispetto a quest’ultimo un aumento d’affinità per entrambe le isoforme α e β. Tale ligando, infatti, si inserisce nelle cavità di binding di ERα e di ERβ nello stesso modo, dando quindi le medesime interazioni: il sistema pseudo-ciclico/ossimico forma un legame ad idrogeno con His524; il gruppo fenolico, dell’anello in posizione 4 del supporto centrale, è coinvolto in una rete di legami ad idrogeno con Glu353 (305), Arg394 (346) e acqua, ed infine l’OH del fenolo in posizione 5 dell’anello aromatico centrale, dà un legame ad idrogeno con la Thr299 (347).

Figura 33. Analisi di docking di 7 in ERα (A) e in ERβ (B).

ERαααα

A

ERββββ

B

In conclusione, in questa parte del mio lavoro di tesi, ho apportato delle modifiche strutturali al composto 3, considerato essere il capostipite dei derivati salicilaldossimici. Tali modifiche sono state ispirate dai risultati ottenuti nelle precedenti esperienze di sintesi di ligandi estrogenici. L’inversione della porzione ossimica con quella ossidrilica nello pseudociclo (composto 5), aveva già portato, in precedenza, ad un aumento di affinità verso ERβ. La simultanea introduzione di un atomo di cloro in posizione sei dell’anello aromatico centrale mi ha permesso di ottenere il composto 6, la cui affinità per la stessa isoforma è aumentata notevolmente. In questo caso, si ha però una diminuzione di selettività per il sottotipo recettoriale beta. Studi di docking evidenziano le caratteristiche del composto 6 fondamentali per la sua elevata affinità per ERβ. Nel composto 7 (recante un p-idrossifenile al posto dell’atomo di cloro del composto 6), invece si ha una notevole affinità per entrambi ERα e ERβ, ne consegue però una drastica diminuzione di selettività verso l’isoforma beta. Anche in questo caso, studi di docking sul composto 7 confermano ciò che è emerso dai saggi di binding recettoriale.

Sono in corso studi nel tentativo di approfondire altri tipi di evoluzioni strutturali, nonché altre possibili combinazioni delle modifiche applicate nel presente lavoro, nel tentativo di trovare composti che mostrano miglioramenti nella loro affinità e selettività per ERβ .

La mia attività di tesi è stata dedicata in parte anche ad un altro progetto in collaborazione con i Proff. M. Frotscher e R. W. Hartmann dell’università tedesca di Saarbrücken , il cui obbiettivo è di trovare composti non steroidei che inibiscono l’enzima 17β-HSD1 (vedi introduzione generale della 17β-HSD1), ma che allo stesso tempo non siano agonisti dei recettori estrogenici. Questo perché sia l’enzima che i recettori estrogenici legano l’estradiolo che quindi rappresenta per entrambi un modello su cui lavorare per trovare ligandi non steroidei che ne mimino la struttura. Fortunatamente i pochi prodotti scoperti come inibitori della 17β-HSD1 sembrano avere soltanto una leggera azione agonista a livello dei recettori estrogenici se usati in grosse quantità.

Negli anni ’50, furono sintetizzati inibitori steroidei della 17β-HSD1, che portavano modificazioni strutturali legate allo scaffold dell’estradiolo. In seguito furono sintetizzati altri composti steroidei e non come “inibitori suicidi”, così chiamati perché di per sé non presentavano alcuna attività, ma si attivavano soltanto dopo una trasformazione effettuata dallo stesso enzima. Furono poi sintetizzati composti dichetonici (gruppi chetonici in posizione 17 e 18 del nucleo dell’estradiolo), ed infine furono provati su tale enzima i classici composti antiestrogenici non steroidei come, per esempio, il tamoxifene. Tutta questa serie di prove portò a risultati non molto soddisfacenti in termini di efficacia inibitoria e di selettività nei confronti di tale enzima. Dati più incoraggianti si ebbero con alcuni flavonoidi naturali, in modo particolare con il coumestrolo, e con la sintesi di inibitori ibridi formati da una parte idrofoba, che interagisce con una tasca idrofobica del sito attivo dell’enzima, da una parte idrofila che interagisce con il cofattore, e da uno “spaziatore” rappresentato da una catena alchilica di lunghezza variabile, interposto tra le prime due.19

Studi recenti, tendo conto delle caratteristiche del sito attivo della 17β-HSD1 (vedi introduzione generale), hanno identificato in alcune strutture come quella del

feniltetralone, del fenilnaftalene, della fenilchinolina e del fenilindolo (Figura 34) dei

potenziali scaffolds su cui apportare delle modifiche per ottenere inibitori non steroidei della 17β-HSD1. 21

O N N feniltetralone fenilnaftalene fenilchinolina fenilindolo Figura 34

I dati dei saggi biologici che verranno riportati per ciascun derivato descritto, sono riferiti alla percentuale di inibizione della 17β-HSD1 che si ottiene introducendo il derivato in questione in concentrazioni di 100nM e di 1µM, nel complesso enzima-estrone-NADPH (l’enzima viene ricavato dalla placenta umana, ricombinato e purificato). 34

Derivati del feniltetralone

In realtà è stato finora riportato in letteratura21 un solo derivato del feniltetralone (composto 11, Figura 35) poiché si è visto avere una scarsa attività (23 % a 1 µM).

O feniltetralone O OH 11 % di inibizione 17

β

µ

Derivati del fenilnaftalene

Su tale scaffold sono state effettuate numerose modifiche per verificare l’importanza della posizione dei sostituenti al fine di ottenere una buona percentuale di inibizione (Figura 36) ed i composti più attivi sono riportati in Tabella 2.21

fenilnaftalene (CH)n V Z 12 n= 0 o 1 V= CH, S, N Z= CH, S R1 R2 1 2 3 6 2' 3' 4' Figura 36 Tabella 2 composti R1 R2 n V Z % inib. [100nM] % inib. [1µµµµM]

12a 2-OH 3’-OH 1 CH CH 91 94

12b 2-OH 3’-COOH 1 CH CH 36 76

12c 2-OH 3’-OH 1 N CH 30 58

I composti che presentano attività inibitoria maggiore sono quelli che hanno degli ossidrili in posizione 2 (R1 = OH) ed in posizione 3’ (R2 = OH). Sono state fatte altre prove per vedere in quale posizione e quale sostituente, avente un certo grado di polarità e combinato all’OH in posizione 2 del naftalene, potesse essere aggiunto al fenile per fornire buoni risultati di attività inibitoria. Sono stati provati diversi sostituenti più o meno polari (R2 = NH2, NO2, CH2OH, NHCOCH3, OH, COOH) in diverse posizioni, ma si è visto che soltanto il composto avente R2= OH in posizione 3’ del fenile (composto 12a) forniva buoni risultati; infatti già con R2 = COOH (composto 12b) l’attività inibitoria diminuisce sensibilmente (Tabella 2). Si è notato inoltre che l’OH in questa posizione è indispensabile per avere un minimo di attività inibitoria per la 17β-HSD1. Questo è stato ulteriormente

confermato quando è stato provato ad inserire un eterociclo al posto del fenile distale (Figura 36): il composto risultante 12c, pur presentando un ossidrile in posizione 3’ (R2= OH), ha una diminuita azione inibitoria. Questo indica che un atomo di azoto in quella posizione non è ben tollerato.

Una volta stabilita la posizione dei due ossidrili all’interno dello scaffold del fenilnaftalene che porta ad un incremento dell’attività inibitoria, sono stati provati vari sostituenti in differenti posizioni, sia sulla porzione naftolica sia su quella fenolica. Il miglior risultato lo si è ottenuto quando in posizione 1 del naftalene è stato introdotto un fenile (composto 12d, Figura 37),34 nonostante il composto risultante sia meno attivo rispetto al capostipite 12a.

HO OH 12a (6-(3-idrossifenil)-2naftolo) HO OH 2 1 1 2 12d % di inibizione 17β-HSD1: [100nM]= 76 [1µM]= 89 Figura37

Derivati fenilchinolinici e fenilindolici

Sullo scaffold della fenilchinolina (Figura 38) sono stati fatti alcuni tentativi di variazione sia di sostituenti sia della posizione degli stessi (Tabella 3), mentre per quanto riguarda la struttura del fenilindolo (Figura 38) è stata effettuata una sola modifica (composto 14), poiché nonostante sia stato messo un ossidrile in posizione 3’ del fenile (come visto precedentemente posizione più favorita per una buona attività inibitoria) il suo potere inibitorio è risultato praticamente nullo (Tabella 3).21

N N fenilchinolina fenilindolo Y (CH)n X R1 13 n= 0 o 1 X= CH, N Z= CH, N 3' 4' R₂ 2 Figura 38 Tabella 3 composti R1 R2 n X Y % inib. [100nM] % inib. [1µµµµM] 13a H 3’-OH 1 N CH n.d. 18 13b OH 3’-OH 1 N CH 24 57 13c OH 3’-OH 1 CH N 14 63 14 OH 3’-OH 0 CH N n.d. n.d.

Come si può notare dalla tabella, nonostante tutti i composti abbiano un ossidrile in posizione 3’, risultano inibitori più deboli rispetto al derivato fenilnaftalenico 12a. Ciò conferma che la presenza di un eterociclo nella porzione biciclica dello scaffold non migliora l’attività inibitoria nei confronti della 17β-HSD1. Comunque anche in questa serie limitata di composti si conferma l’importanza dell’ossidrile in posizione 2 della porzione chinolinica, la cui assenza ha portato ad una drastica riduzione del potere inibitorio del composto risultante (13a), in accordo con i dati ottenuti per i derivati fenilnaftalenici.

Alcune caratteristiche farmacoforiche che sembrano emergere da questa serie di derivati non steroidei è stata espressa nei seguenti punti:

una conformazione planare simile agli steroidi;

due zone polari che mimano rispettivamente l’OH fenolico dell’anello A e l’OH alcolico in posizione 17β dell’anello D dell’estradiolo;

Si è dovuto tenere conto del fatto che i composti saggiati potrebbero in teoria interagire con i recettori estrogenici e ciò potrebbe nuocere all’azione terapeutica voluta. Per questo su alcuni composti risultati più attivi (12a, 12c e 12d) sono stati fatti anche saggi di radiometrico affinità recettoriale sui recettori ERα e ERβ (Tabella 4).

Tabella 4 Composti 17ββββ-HSD1 IC50 (nM) ERαααα umano-RBA (%) ERββββ umano-RBA (%) 12a 116 0.2 0.8 12c 1232 0.01<RBA>0.1 1 12d 20 0.01<RBA>0.1 0.01<RBA>0.1

Dai risultati riportati in Tabella 4, si nota che questi composti mostrano un’affinità recettoriale quasi nulla per entrambi i sottotipi α e β, mentre mantengono un’apprezzabile potenza inibitoria nei confronti della 17β-HSD1.

Tramite alcuni studi di molecular modeling sono state fatte due ipotesi su come i ligandi più attivi, come per esempio il composto 12a, possano interagire con il recettore:21

a) l’OH in posizione 2 della porzione naftalenica del composto 12a può mimare l’OH fenolico dell’anello A dell’estradiolo e ad interagire con l’His221 e il Glu282 (una delle aree polari del sito attivo) e, quindi, l’OH in posizione 3’ del fenile di 12a andrebbe a sovrapporsi all’OH in posizione 17β dell’estradiolo che va ad instaurare invece legami ad idrogeno con l’altra area polare del sito catalitico, contenente i residui Ser142 e Tyr155 (Figura 39 A);

b) al contrario, potrebbe verificarsi una situazione inversa in cui l’ OH in posizione 2 della parte naftalenica e l’OH in posizione 3’ del fenile del composto 12a mimino, rispettivamente, l’OH alcolico dell’anello D e l’OH fenolico dell’estradiolo (Figura 39 B).

Figura 39 A e B. Le due possibili orientazioni delle sovrapposizioni dell’estradiolo

(rosso) con il composto 12a (verde).

Per poter stabilire quale delle due ipotesi possa essere la più verosimile, è stato analizzato in dettaglio lo spazio che circonda il composto 12a all’interno del sito attivo enzimatico. Come si può vedere dalla Figura 40, se il ligando interagisse nel recettore secondo la prima ipotesi (binding mode A, Figura 40) potrebbe portare gruppi abbastanza ingombrati nelle posizioni 4’ della porzione fenolica e 1 della porzione naftalenica (frecce verdi), mentre l’introduzione di sostituenti, anche piccoli, nelle posizioni 5’, 6’, 3, 4 o 7 (frecce rosse) non sono tollerati poiché non c’è abbastanza spazio in corrispondenza di queste porzioni della cavità enzimatica, quindi ligandi portanti sostituenti nelle posizioni suddette dovrebbero risultare inattivi. Invece in base alla seconda ipotesi (binding mode B, Figura 40), sostituenti in posizione 2’ del fenolo e 1 della parte naftalenica (frecce verdi) sono ben accolti nella tasca recettoriale poiché c’è abbastanza spazio; al contrario sostituenti nelle posizioni 4’e 6’del fenolo (frecce rosse) non sono ben accetti a causa del piccolo spazio che l’enzima riserverebbe loro.34

Figura 40. Le due modalità di binding dell’inibitore 12a nel sito catalitico dell’enzima

17β-HSD1. Le frecce verdi indicano zone in cui c’è abbastanza spazio per sostituenti ingombranti, le frecce arancioni indicano che c’è spazio soltanto per piccoli sostituenti,

infine le frecce rosse indicano che non c’è spazio per nessun tipo di sostituente.

I risultati biologici finora ottenuti, corredati da opportuni studi di docking, sembrano indicare che i ligandi si dispongono nella tasca recettoriale come descritto nella seconda ipotesi di sovrapposizione (binding mode B, Figura 40).

Inoltre studi basati sulle relazioni struttura-attività (SAR) suggeriscono l’opportunità di avere uno scaffold caratterizzato da una struttura piuttosto rigida affinché il ligando possa interagire con le sue due estremità polari (ovvero i due gruppi ossidilici presenti su tutti gli inibitori attivi) nelle aree del sito di binding coinvolte in tali interazioni (His221e Glu282 da una parte e Ser142e Tyr155 dall’altra).

Derivati tioamidici

Nel gruppo di ricerca dei Proff. M. Frotscher e R. W. Hartmann dell’Università di Saarbrücken sono stati così testati sulla 17β-HSD1 composti, sintetizzati in precedenza dai ricercatori del laboratorio presso il quale ho svolto la mia attività di tesi, contenenti un gruppo tioamidico centrale al posto di uno dei due anelli dello scaffold naftalenico. Infatti tale gruppo presenta caratteristiche di planarità e rigidità simili ad un anello aromatico. Il composto risultato più attivo (inibizione pari al 66% alla concentrazione di 1 µM) tra quelli provati è stato il composto 15 che oltre al guppo tioamidico presenta due gruppi ossidrilici nelle posizioni 2 e 4 di uno dei due anelli fenilici, insieme ad un altro ossidrile in posizione 4’ dell’altro anello (Figura 41).

N S HO OH H OH fenilnaftalene 15 % di inibizione 17β-HSD1: [1µM]= 66.5 ± 1.4 Figura 41

Il mio contributo nell’ambito di questa linea di ricerca è stato quello di apportare una modifica al composto 15 (Figura 42) sulla base di quanto osservato negli inibitori di tipo naftalenico, ossia spostare l’ossidrile fenolico dalla posizione para-sostituita alla

meta-sostituita dello stesso anello (composto 16), in modo da generare una sorta di

HO OH N S HO OH H OH N S HO OH H OH 12a 15 16 Figura 42

Sintesi del composto 16

La sintesi del derivato tioamidico 16 è mostrata nello Schema 4.

SCHEMA 4 NH2 OMe MeO Cl OMe O + N O OMe OMe MeO H N S OMe OMe MeO H N S OH HO OH H a b c 16 37 38 2,4-dimetossi-anilina 3-metossi-benzoilcloruro Reagenti e condizioni:

a) N,N-dietilmetilanilina, DMAP, CH2Cl2 anidro, 24h; b) Reattivo di Lawesson, clorobenzene, 130 °C, 3h c) BBr3, CH2Cl2 anidro, microonde.

Per la formazione dell’ammide 37, è stata fatta reagire la 2,4-dimetossi-anilina commerciale con il 3-metossi-benzoilcloruro commerciale in presenza di N,N-dietilmetilanilina, DMAP e CH2Cl2 anidro. L’ammide così formata è stata trattata con il reattivo di Lawesson in clorobenzene, ottenendo così la tioamide 38. Quest’ultima è stata deprotetta con BBr3 in CH2Cl2 anidro, ottenendo così il composto 16. È importante notare che in quest’ultimo passaggio, che normalmente avviene a basse temperature, è stato necessario far ricorso all’ausilio delle microonde, altrimenti si otteneva esclusivamente la rimozione di soltanto due gruppi metilici, mentre il metossile in posizione para rispetto all’atomo di azoto ammidico rimaneva intatto.

Saggi biologici

I dati dei saggi biologici (Tabella 5) sono riferiti alla percentuale di inibizione dell’attività enzimatica del 17β-HSD1 che si ottiene aggiungendo il prodotto in questione in concentrazioni di 100nM e di 1µM, al complesso enzima-estrone-NADPH. L’enzima viene ricavato dalla placenta umana, ricombinato e purificato.

Tabella 5 Composti % inib. [100nM] % inib. [1µµµµM] HO OH 12a 91 94 N S HO OH H OH 15 66.5 ± 1.4 N S OH HO OH H 16 20 ± 1.2

Come si può vedere dalla Tabella 5, i derivati tioamidici presentano un’attività inibitoria minore rispetto ai derivati fenilnaftalenici. Il composto 16 mostra il 20% di inibizione alla concentrazione di 1 µM, che è il dato più basso tra quelli riportati in tabella. Si può quindi concludere che lo spostamento dell’ossidrile dalla posizione para a quella meta dell’anello fenolico del derivato tioamidico, a differenza di quanto previsto in fase di

progettazione molecolare (Figura 42) comporta un decremento del potere inibitorio del composto 16 sull’enzima 17β-HSD1 rispetto al composto 15.