INTRODUZIONE PARTE
SPERIMENTALE
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Negli ultimi anni la ricerca si è focalizzata sullo studio di una delle principali proteine trasportatrici presenti nell’organismo umano: la glicoproteina-P (P-gp).
La P-gp è una proteina di estrusione ATP-asica, appartenente alla famiglia di proteine transmembranali ATP-binding cassette (trasportatori ABC) e costituisce l'esponente più importante di questa famiglia espresso a livello della barriera emato-encefalica (BEE).
Il suo ruolo principale consiste nel limitare o prevenire l'ingresso nel sistema nervoso centrale di svariati agenti quali chemioterapici, peptidi, antibiotici, inibitori delle HIV proteasi e farmaci antidepressivi. E' una proteina transmembranale specifica, altamente espressa sulla superficie luminale dell'endotelio vascolare cerebrale e nel plesso coroideo dove è implicata nel trasporto di numerosi substrati andando a costituire uno dei principali fattori implicati nell’insorgenza del fenomeno della MDR (multidrug resistance). L’ampia ed omogenea distribuzione della P-gp nel SNC mostra come questo trasportatore di membrana possa, però, essere essenziale per la protezione da sostanze xenobiotiche.
Alcuni studi hanno dimostrato che nella fase iniziale di alcune patologie quali AD e Parkinson, la P-gp può risultare scarsamente attiva o espressa in modo inadeguato a livello cerebrale. Tale condizione potrebbe aggravare il quadro patologico neurodegenerativo a causa di un aumentato accumulo di aggregati β-amiloidi nel SNC come nel soggetto affetto da AD o di tossine ambientali come nel malato di Parkinson. Al contrario, nella fase avanzata della patologia neurodegenerativa (AD e Parkinson) vengono attivati vari meccanismi di feedback in seguito all’accumulo di sostanze xenobiotiche nel sistema nervoso centrale. Tale attivazione è caratterizzata dall’iper-espressione della P-gp e dalla conseguente insorgenza della resistenza alle terapie farmacologiche.
38 Figura 17. BEE , P-gp nell’Alzheimer
Alla luce di queste considerazioni la P-gp potrebbe rappresentare un bersaglio innovativo per lo sviluppo di strategie terapeutiche più efficaci e preventive per le patologie neurodegenerative.
Ad oggi sono stati caratterizzati numerosi agenti capaci di modulare la P-gp come ad esempio il verapamile (un bloccante dei canali del calcio), la ciclosporina A ed alcuni antagonisti della calmodulina.
Struttura Ciclosporina A
Struttura Verapamile
Questi composti producono però dei risultati contrastanti in vivo a causa della loro bassa affinità di legame alla P-gp che quindi richiede la somministrazione di dosi elevate con conseguente comparsa di effetti tossici. È inoltre importante sottolineare il fatto che questi agenti sono
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substrati oltre che della P-gp anche per altri trasportatori e sistemi enzimatici e possono quindi presentare imprevedibili interazioni farmacocinetiche se somministrati in associazione a chemioterapici. Il verapamile, ad esempio, a causa della bassa selettività per la P-gp e della sua attività intrinseca calcio-antagonista, è risultato esser cardiotossico alle dosi efficaci come P-gp inibitore, mentre la ciclosporina A è risultata nefrotossica. Per superare questi limiti è stata successivamente sviluppata una seconda generazione di modulatori della P-gp che comprende farmaci come il dexverapamile ((+)-verapamile) ed il biricodar.
Biricodar
I farmaci appartenenti a questa famiglia di modulatori sono più potenti e meno tossici dei loro predecessori, ma influenzano in modo significativo il metabolismo e l’eliminazione dei farmaci chemioterapici provocando quindi una marcata tossicità che costringe ad una drastica riduzione del dosaggio del chemioterapico. Inoltre, molti modulatori appartenenti alla seconda generazione agiscono come substrati per altri trasportatori, soprattutto per quelli appartenenti alla famiglia delle proteine ABC; la loro inibizione potrebbe pertanto diminuire la capacità delle cellule sane e dei tessuti di proteggersi dagli agenti citotossici.
Successivamente, in seguito a studi di SAR è stata sviluppata una terza generazione di inibitori della P-gp. Alcuni di questi composti sono attualmente in fase clinica e comprendono derivati antranilammidici come il tariquidar e l’elacridar. Quest’ultima generazione di composti presenta un’elevata potenza ed affinità per il trasportatore P-gp ma anche per la proteina BCRP (proteina resistente al cancro della mammella).
40 Tariquidar Elacridar
Presso il laboratorio in cui è stata svolta questa tesi di laurea sono stati sintetizzati alcuni derivati ariletilfenilici di tipo A che in test preliminari condotti su linee cellulari tumorali che sovraesprimono la P-gp (cellule Caco-2, carcinoma umano del colon, e cellule MCF7/Adr, carcinoma umano della mammella resistente all’adriamicina) hanno mostrato una buona attività inibitoria su questo trasportatore71,72.
X= O; N; S R= H; OMe R1= H; OMe
A
Tra i composti di tipo A studiati, il derivato etereo 1 e l’analogo amminico 2 hanno dato buoni risultati nei saggi di inibizione della P-gp. In particolare il derivato 1 ha mostrato un’ EC50=17.2 μM del tutto paragonabile a quella del
farmaco di riferimento (verapamil), mentre l’analogo amminico 2 è risultato circa 40 volte più potente del verapamil ( EC50=0.48 μM,Vs EC50=20 μM,
rispettivamente).
R
X
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1 2
Malgrado la buona attività P-gp inibitrice mostrata dai due composti (1 e 2), le loro proprietà drug-like e in particolare la lipofilicità (Tabella 1) non risultano ottimali per garantire una buona biodisponibilità e quindi un loro potenziale sviluppo clinico.
Tabella 1
Composto Inibizione del trasporto della
[3H]-vinblastina EC50 (µM) Attivazione ATPasi LogP 1 17.2 Nc 5.9 2 0.48 N 5.5 Verapamile 20 Y /
Le osservazioni sopra riportate e i buoni risultati ottenuti con i composti 1 e 2 hanno indicato che in generale i composti di tipo A potevano costituire uno scaffold interessante su cui apportare modifiche strutturali per ottenere derivati con migliori proprietà drug-like.
In questo lavoro di tesi è stata progettata la sintesi delle molecole 3-5a,b,c, in cui l’anello c di A è stato sostituito con un imidazolo.
OMe O OMe OMe N H OMe
42 OMe N H N H N NH N H N H N 3 (LogP: 3) 4 (LogP: 1.8) O N H N H N 5a (LogP:2.2) 5b: R=H (LogP: 2.8) 5c: R=Me (LogP: 3.1) O N H N N R
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Inoltre i derivati 4 e 5a-c presentano un’ulteriore modifica strutturale: in 4 un metilene della catena etilica tra a e b di A è stato sostituito con un gruppo amminico, mentre nei derivati 5a-c l’eteroatomo inserito nel linker presente tra i due anelli a e b è un ossigeno.
L’inserimento di eteroatomi e la sostituzione di un arile con un imidazolo dovrebbe consentire di ottenere composti ancora attivi ma con una ridotta lipofilicità73,74,75.
44 OMe Cl P + (Ph3)Cl -OMe NO2 OMe NH2 I II III OMe N H N H N
+
PPh3+
N H N CHO 6 7 8 9 NO2 10 E/Z 11 IV 3+
Reagenti e condizioni I : CH3CN, reflusso, 12h;
II : CH3CN, DBU, reflusso, 12h;
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Il composto 3 è stato ottenuto seguendo la procedura descritta nello schema 1.
Il sale di fosfonio 8 è stato ottenuto dal 3-metossibenzilcloruro 6 per reazione con PPh3 in CH3CN; la reazione di Wittig con la
2-nitrobenzaldeide 9 ha fornito la miscela E/Z del derivato stilbenico 10 che è stato utilizzato come tale nella reazione di idrogenazione catalitica in presenza di Pd/C 10% per dare la corrispondente ammina satura 11 la quale è stata sottoposta a reazione di amminazione riduttiva con la 4-imidazol-carbossialdeide commerciale a dare il rispettivo composto 3.
46 NH2 CHO NO2
+
NO2 N NO2 NH NH2 NH N H N CHO+
NH N N H N NH N H N H N 12 9 13 E/Z 14 15 16 E/Z 4 I II III IV VReagenti e condizioni: I : EtOH, reflusso, 24h;
II : NaBH4 , MeOH/H2O, t.a., 3h;
III : H2 , Pd/C, EtOHass., t.a., 12h
IV : EtOH, riflusso, 24h;
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Il composto 4 è stato ottenuto seguendo la procedura descritta nello schema 2.
Il composto 14 è stato ottenuto sottoponendo ad amminazione riduttiva l’anilina 12 e la 2-nitro-benzaldeide 9. Successivamente, la miscela E/Z di immina 13 ottenuta è stata ridotta utilizzando una soluzione acquosa di NaBH4 in MeOH. Il gruppo nitro del composto 14 è stato successivamente
ridotto a gruppo amminico attraverso idrogenazione catalitica in presenza di Pd/C 10% in EtOHass. È stato cosi ottenuto il composto 15 che sottoposto ad un’ulteriore amminazione riduttiva con la 4-imidazol-carbossialdeide ha fornito la miscela imminica E/Z 16. L’immina ottenuta è stata ridotta con NaBH4 per dare il rispettivo composto 4.
48 OH
+
Br I O NO2 O NH2 O N H N H N O N H N N R II 17 18 19 20 5a 5b, 5c 5b: R=H 5c: R=MeReagenti e condizioni I: t-BuOH, reflusso, 24h.
II: NH2-NH2, FeCl3,C,MeOH, N2, 24h
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I composti 5a-c sono stati ottenuti seguendo la procedura dello schema 3. Il nitroetere 19 è stato ottenuto per reazione del 2-nitrofenolo 17 con il benzilbromuro commerciale 18 in presenza di KOHe t-BuOH. Tale derivato è stato sottoposto a reazione di riduzione in presenza di idrazina, cloruro di ferro e carbone attivato a dare la corrispondente ammina 20. La successiva reazione, di amminazione riduttiva, dell’intermedio 20 con le appropriate aldeidi commerciali,4-imidazol carbossialdeide, 2-imidazol carbossialdeide e 1metil-2imidazol carbossialdeide ha condotto ai prodotti finali 5a, 5b, 5c rispettivamente.
