2
ACRONIMI
5
RIASSUNTO
8
CAPITOLO 1
PARTE INTRODUTTIVA
11
1.1 Importanza del monossido di azoto in vivo: 11 1.2 Proprietà chimiche e fisiche del monossido d’azoto 15 1.3 La sintesi del monossido di azoto in vivo: le NOS 17 1.4 Meccanismo di azione del monossido d’azoto in vivo: attivazione della guanilato ciclasi. 20
1.4.1 : Azione vasodilatatrice, antiaggregante e neurotrasmettitrice del NO: 22
1.4.2 : Attività citotossica dei macrofagi: 23
1.4.3 : Inibizione della proliferazione cellulare: 24
1.4.4 : Mutazione genica: 24
1.5 Il monossido di azoto come agente patologico 25
CAPITOLO 2
L’IMPORTANZA DEGLI S-NITROSOTIOLI
29
2.1 Ruolo degli S-nitrosotioli 29
2.2 La decomposizione degli S-nitrosotioli in vitro ed in vivo 35
2.2.1 L’effetto degli ioni rame sulla decomposizione degli RSNO 35
2.2.2 Decomposizione degli S-nitrosotioli per via enzimatica 36
2.2.3 Decomposizione ad opera di reazioni di transnitrosilazione 38
2.2.4 Decomposizione termica e fotochimica 40
2.2.5 Il ruolo dell’ascorbato (vitamina C) nella decomposizione degli RSNO 40
2.2.6 Considerazioni sulla decomposizione degli RSNO in vivo 45
2.3 Altri nitroderivati e loro impiego in farmacologia 47
CAPITOLO 3
ANALISI DEI NITROSOTIOLI NEI FLUIDI BIOLOGICI
50
3.1 Premessa 50
3.2 Metodi diretti per la determinazione degli S-nitrosotioli 54
3.2.1 Determinazione degli S-nitrosotioli tramite spettrofotometria UV 54
3.2.2 Determinazione degli S-nitrosotioli mediante tecniche ifenate: HPLC o CZE con rivelatore
UV/visibile o ESI-MS. 54
3.2.3 Determinazione degli S-nitrosotioli mediante sensore amperometrico. 55
3.2.4 Determinazione degli RSNO mediante spettrometria di massa accoppiata a ionizzazione electrospray
(ESI-MS). 57
3.3 Metodi indiretti per la determinazione degli S-nitrosotioli: determinazione del NO 59
3.3.1 Premessa 59
3.3.2 Determinazione del NO mediante chemiluminescenza 61
3.3.3 Determinazione del monossido di azoto mediante metodi elettrochimici 62
3.3.4 Determinazione degli RSNO tramite determinazione dell’NO con ESR. 65
3.4 Metodi indiretti per la determinazione degli S-nitrosotioli: determinazione dei nitriti 66
3.4.1 Premessa 66
3.4.2 Determinazione dei nitriti mediante il metodo di Griess 68
3.4.3 Determinazione dei nitriti mediante spettrofluorimetria. 70
3.4.4 Determinazione degli RSNO mediante gas cromatografia accoppiata a spettrometria di massa
3
3.4.5 Determinazione degli RSNO mediante determinazione del tiolo-derivato. 74
3.5 Considerazioni conclusive: 76
CAPITOLO 4
SCOPO DELLA TESI
78
4.1 LA TECNICA DI GENERAZIONE DI VAPORI FREDDI DI MERCURIO ACCOPPIATA ALLA SPETTROMETRIA DI FLUORESCENZA ATOMICA NON DISPERSIVA CON
ATOMIZZAZIONE IN FIAMMA MINIATURIZZATA Ar/H2 81
4.1.1 La generazione di vapori freddi di mercurio 81
4.1.2 Formazione e rilascio di Hg0 82
4.1.3 Trasferimento di Hg0 82
4.1.4 Sistemi di generazione del mercurio elementare 83
4.2 Metodi di rivelazione per il mercurio 85
4.2.1 Problemi di interferenza nella tecnica CVG-AFS 85
4.2.2 Interferenze in fase liquida 85
4.2.3 Interferenze in fase gassosa 86
4.3 METODI PER LA DIGESTIONE DEL MERCURIO ORGANICO. LA MISCELA BrO3¯/Br¯ 87
CAPITOLO 5
STRUMENTAZIONE, MATERIALI E METODI
90
5.1 Generatore in flusso continuo per CVG-AFS di Hg(II) 90 5.2 Generatore in flusso continuo per CVGT-AFS con sistema di digestione on-line per mercurio
organico (PHMB) 92
5.3 Interfacciamento con HPLC 94
5.3.1 Il sistema di rivelazione AFS 94
5.3.2 Lampada a scarica senza elettrodo 96
5.3.3 Strumentazione e colonne HPLC 98
5.4 ESI-MS 99
5.5 Analisi spettrofotometrica UV-visibile 100
5.6 Reagenti, soluzioni e procedure 100
5.6.1 Reagenti e soluzioni standard 100
5.7 Procedura per studiare la reazione di decomposizione dei nitrosotioli. 102 5.8 Procedura per la preparazione e derivatizzazione di RSNO nel plasma 103 5.9 Procedura per la preparazione dei perfusati di cuore di ratto. 105
5.9.1 Procedura di derivatizzazione dei perfusati. 105
5.10 Calibrazioni 106
CAPITOLO 6
REATTIVITÀ DEL GSNO NEI CONFRONTI DEL PHMB: STUDIO
DELLE CINETICHE MEDIANTE SPETTROFOTOMETRIA UV-VISIBILE A 334NM.
108
4
CAPITOLO 7
REATTIVITÀ DEI NITROSOTIOLI (RSNO) CON IL PHMB: MISURE
IN RPLC-CVGAFS.
117
7.1 Premessa. 117
7.2 Reattivita’ del GSNO nei confronti del PHMB 119 7.3 Effetto della N-etilmaleimmide (NEM) sulla reazione tra GSNO e PHMB: ipotesi sul meccanismo
di reazione. 122
7.4 Esperimenti ESI-MS (electrospray ionization mass-spectrometry) per la caratterizzazione dei
complessi GS-PHMB e GS-NEM. 123
7.5 Effetto del pH e della temperatura sulla reazione GSNO-PHMB. 132 7.6 Effetto dell’ascorbato sulla reazione GSNO-PHMB. 137
7.6.1 Effetto del tiolo ridotto (GSH) e ossidato (GSSG) sulla reazione GSNO-PHMB. 139
7.6.2 Impiego del PHMB per la determinazione analitica del GSNO. 143
7.7 Reattivita’ di altri S-nitrosotioli con il PHMB: CysNO ed S-nitrosoacetilpenicilammina (SNAP). 144
CAPITOLO 8
SVILUPPO DI UNA METODOLOGIA ANALITICA PER LA
DETERMINAZIONE DEL GSNO, CON APPLICAZIONE AL PLASMA
149
8.1 Determinazione del GSNO. Applicazione al plasma umano. 151
CAPITOLO 9
DETERMINAZIONE SIMULTANEA DI GSNO, CYSNO, HCYSNO,
CYSGLYNO NEL PLASMA UMANO.
155
9.1 Premessa 155
9.2 Impiego del disegno sperimentale per l’ottimizzazione delle condizioni analitiche per la
determinazione dei nitrosotioli (GSNO, CysNO, CysGlyNO e HCysNO) 157
