UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PISA
Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale
Direttore Prof. Corrado Blandizzi
CORSO DI LAUREA IN MEDICINA E CHIRURGIA
Utilizzo del progesterone come sostegno della fase luteale
nei cicli di procreazione medicalmente assistita.
RELATORE
Chiar.mo Paolo Giovanni Artini
CANDIDATO
Ilaria Bianchini
Riassunto
Le tecniche di procreazione medicalmente assistita, e in particolare il ricorso alla
stimolazione ovarica controllata interferiscono negativamente sulla fase luteale.
È stato chiaramente dimostrato che il supporto della fase luteale è in grado di
migliorare gli outcome riproduttivi. A causa del rischio di sindrome da
iperstimolazione ovarica associata all'uso di hCG, il progesterone è diventato il
trattamento di scelta per il supporto della fase luteale, tuttavia la migliore via di
somministrazione così come le dosi e i tempi di inizio e sospensione del
trattamento sono tuttora oggetto di discussione. Vengono discussi anche schemi
terapeutici alternativi per il sostegno luteale dopo l’utilizzo di GnRH-agonisti
per l’induzione della maturazione finale degli ovociti e la necessità di supporto
INDICE
1 Introduzione ... 1
1.1 Endocrinologia della funzione riproduttiva ... 1
1.2 Il rilascio del GnRH ... 2
1.3 Gonadotropine ... 2
1.3.1 Struttura ... 2
1.3.2 Effetti biologici delle gonadotropine ... 3
1.4 Steroidi ovarici ... 4
2. Azioni principali del progesterone a livello endometriale ... 6
3. Finestra d’impianto e marcatori di recettività endometriale ... 8
4. Fase luteale: luteinizzazione, steroidogenesi, luteolisi ... 9
4.1 Luteinizzazione ... 10
4.2 Steroidogenesi nel corpo luteo ... 11
4.3 Regolazione endocrina corpo luteo e luteolisi ... 12
5. Introduzione ART (Assisted reproductive technology) ... 14
5.1 Tecniche di I livello ... 15
5.2 Tecniche di II livello ... 15
5.3 Tecniche di III Livello ... 17
5.4 Prelievi testicolari ... 17
5.5 Stimolazione ovarica controllata ... 17
5.5.1 Induzione della crescita follicolare multipla ... 18
5.5.2 Prevenzione del picco prematuro endogeno di LH ... 19
5.5.3 Triggering ... 21
5.5.4 L’endometrio nella stimolazione ovarica controllata ... 22
6 . LPD (Luteal phase defect) ... 23
6.1 Cause di LPD ... 24
6.2 Diagnosi di LPD ... 25
7. Razionale Supporto Fase Luteale In ART ... 25
8. Supplementazione con progesterone ... 27
8.1 Progesterone intramuscolo ... 28
8.2.1 Progesterone naturale orale ... 28
8.2.2 Didrogesterone orale ... 29
8.3 Progesterone vaginale ... 30
8.5 Dosi ottimali ... 34
8.6 L'aggiunta di estradiolo al supporto luteale con progesterone ... 34
9. LPS dopo GnRHa triggering ... 36
9.1 Multipla somministrazione di hCG ... 37
9.2 LH ricombinante ... 38
9.3 Supporto intensivo con progesterone ed estradiolo ... 38
9.4 Tecnica del congelamento dopo GnRHa triggering ... 39
10. Timing del supporto luteale ... 40
11. LPS nelle tecniche di I livello ... 42
12. CONCLUSIONI ... 44
13. Bibliografia ... 45
1
1 Introduzione
1.1 Endocrinologia della funzione riproduttiva
Nel genere umano la funzione riproduttiva è controllata da correlazioni neuro-ormonali: il complesso neuroendocrino attraverso la trasmissione sinaptica e la secrezione ormonale, rappresenta un’unità funzionale integrata in grado di esercitare un’azione di controllo nel processo riproduttivo.1
La frazione peptidergica dell’ipotalamo produce ormoni polipeptidici indicati come Releasing Hormones in quanto stimolano l’ingresso nel circolo ematico degli ormoni ipofisari e Inhibiting Hormones con azione invece inibente.
I realising hormone sono rappresentati da:
-GnRH: realising hormone per le due gonadotropine ipofisarie (sia LH che FSH) -TRH: thyrotropin releasing hormone (ormone di rilascio per tireostimolina ipofisaria)
-GHRH : growth Hormone realising hormone (ormone di rilascio per l’ormone ipofisario della crescita)
-CRH : corticotropin realising hormone (ormone di rilascio dell’ACTH)
Gli inhibiting hormone sono rappresentati da: l’inibitore ipotalamico dell’ACTH, la dopamina (che inibisce la produzione ipofisaria di prolattina, la somatostatina (o growth hormone inhibitor factor)2
Sotto lo stimolo o l’inibizione dell’ipotalamo l’adenoipofisi produce una serie di ormoni (tropine) di natura proteica e altre sostanze di natura oppioide.
Gli ormoni ipofisari sono rappresentati da: le gonadotropine FSH e LH, la prolattina (PRL) , la tropina stimolante la tiroide TSH, l’ormone adrenocorticotropo ACTH e l’ormone della crescita GH.
L’ovaio sotto lo stimolo delle gonadotropine ipofisarie secerne gli ormoni steroidei (estrogeni, androgeni, progesterone e derivati) 3
L’ipotalamo è l’area funzionalmente più importante nel collegare le azioni dei vari neurotrasmettitori e neuromodulatori corticali e sovraipotalamici alle strutture sottoipotalamiche e ciò avviene attraverso le influenze ormonali che giungono per via ematica e che effettuano un’azione di feedback lungo negativo (quando il retrocontrollo è svolto dagli
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steroidi ovarici) o feedback corto negativo (quando il retrocontrollo è svolto da parte delle gonadotropine ipofisarie sulla produzione di GnRH)
L’intrecciarsi di stimoli e inibizioni a cascata tra ipotalamo, ipofisi e ovaio e di retroazioni, è caratteristico della donna e imprime una ciclicità alla funzione riproduttiva1
1.2 Il rilascio del GnRH
Il GnRH viene rilasciato con una modalità pulsatile. La secrezione pulsatile è di fondamentale importanza nell’influenzare secrezione e rilascio degli ormoni ipofisari. Infatti dopo il legame con il suo recettore pituitario, l’ormone stimola la secrezione di LH e FSH, regolando così la steroidogenesi gonadica in entrambi i sessi 4. Una serie di esperimenti ha evidenziato
l’importanza della pulsatilità ipotalamica per sostenere la secrezione gonadotropinica 5
Il rilascio pulsatile sembra essere una proprietà intrinseca dei neuroni secernenti GnRH e dipende dall’aumento del Ca2+ intracellulare .
Variazioni nell’ampiezza e nella frequenza di scarica del GnRH determinano importanti variazioni sui livelli plasmatici di gonadotropine e sul rapporto FSH/LH 6.
Nella donna l’ampiezza e la frequenza del pulse ipotalamico dipende dalla fase del ciclo mestruale. Durante la fase follicolare, un’alta frequenza dei pulse (ogni 60-90 minuti) favorisce la secrezione di LH rispetto all’FSH mentre una bassa frequenza dei pulses favorisce la secrezione di FSH nella fase luteale. L’importanza del diverso controllo di FSH e LH è evidenziato dai disordini associati all’alterato rilascio di questi ormoni, un esempio è dato dalla PCOS, in cui si ha un’accelerazione del pulse di GnRH con un aumento del rapporto LH/FSH
1.3 Gonadotropine
1.3.1 Struttura
LH e FSH sono ormoni glicoproteici con similitudini strutturali e chimiche. Sono infatti composti da due subunità chiamate alfa e beta. Mentre la subunità alfa è identica in LH, FSH, hCG e TSH ed è detta infatti anche common α-subunit (CGA), la subunità beta conferisce specificità ad ogni singolo ormone. Esiste un alto livello di omologia tra le subunità beta
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dell’LH e quelle dell’hCG (gonadotropina corionica umana, ormone prodotto dal trofoblasto, fondamentale per il mantenimento del corpo luteo gravidico) 7
La differente composizione di questi ormoni ne influenza l’attività biologica e la velocità di degradazione.
Le gonadotropine ipofisarie rappresentano un complesso di forme eterogenee con diverso peso molecolare, emivita circolante e diversa attività biologica. Durante un normale ciclo mestruale, almeno 10-30 isoforme delle gonadotropine sono presenti nel sangue circolante. L’attività complessiva delle gonadotropine è pertanto dovuta agli effetti di questo insieme di isoforme che raggiungono e si legano ai recettori nei tessuti bersaglio.1
Complessivamente l’emivitaa dell’LH è circa 20 minuti, quella dell’FSH di 3-4 h, mentre quella dell’hCG di 24 h.
1.3.2 Effetti biologici delle gonadotropine
Le gonadotropine agiscono stimolando la maturazione e la funzione delle gonadi e regolano i processi di gametogenesi e steroidogenesi ovarica.
Sia i recettori per l’FSH (FSHR) che quelli perl’LH (LHR) sono recettori accoppiati alle proteine G8.
Mentre i recettori per l’FSH sono esclusivamente espressi sulle cellule della granulosa, i LHRs sono espressi costitutivamente a livello della teca interna e delle cellule interstiziali, ma anche sulle cellule della granulosa nel follicolo preovulatorio 9
L’FSH stimola la proliferazione delle cellule della granulosa, le quali, grazie all’aromatasi convertono gli androgeni prodotti dalla cellule tecali sotto stimolo dell’LH, in 17-beta estradiolo. Quest’ultimo a sua volta aumenta la responsività delle cellule della granulosa all’FSH. Il legame dell’FSH con i recettori follicolari ha anche la funzione di stimolare la produzione di inibina e indurre la comparsa dei recettori per l’LH a livello della granulosa. Agendo sinergicamente con l’estradiolo e l’LH, l’FSH stimola l’accrescimento follicolare e la maturazione del follicolo oltre lo stadio della formazione dell’antro. L’FSH svolge un ruolo determinante nella selezione del follicolo dominante
L’LH stimola la produzione di androgeni da parte della teca ovarica e quindi agisce sinergicamente con l’FSH nel promuovere la produzione di estrogeni da parte del follicolo.
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A livello della granulosa, verso la fine della fase follicolare, l’LH provoca una diminuzione del numero dei recettori per l’FSH e l’inizio della secrezione di progesterone, a cui segue l’inizio della luteinizzazione.
L’LH stimola anche la sintesi di prostaglandine, essenziali per la rottura del follicolo e nella fase luteale ha un ruolo fondamentale nel sostegno del corpo luteo.
1.4 Steroidi ovarici
Tutti gli steroidi, compresi anche quelli di origine corticosurrenalica e placentare, hanno una struttura di base comune detta ciclopentanoperidrofenantrene, un complesso a 17 atomi di carbonio. Da esso origina il colesterolo, che può essere sintetizzato ex-novo o captato dalle LDL. La prima tappa della biosintesi steroidea è la trasformazione del colesterolo in pregnenolone ed è una tappa comune a tutte le ghiandole a secrezione steroidea.
In base al numero di atomi di carbonio vengono distinti tre gruppi principali di steroidi ovarici: quello a 18 atomi di carbonio a cui appartengono gli estrogeni;
quello a 21 che comprende i corticoidi e i progestinici quello a 19 cui appartengono gli androgeni.
Gli estrogeni vengono sintetizzati in numerosi tessuti. Le sedi principali sono le cellule della granulosa del follicolo maturo in età feconda, il tessuto adiposo nelle donne in post-menopausa, il sinciziotrofoblasto della placenta nella donna gravida.
Gli estrogeni ovarici derivano dalla conversione di androgeni tecali, per opera dell’aromatasi; invece i precursori per la sintesi extraghiandolare degli estrogeni (per lo più da tessuto adiposo) derivano dal surrene.
L’estradiolo (E2) o 17beta estradiolo è l’estrogeno predominante nella donna in età fertile ed è prodotto soprattutto dai follicoli ovarici. L’estrone (E1) è prodotto soprattutto nel tessuto adiposo, a partire dall’androstenedione ed è predominante nell’età menopausale. L’estriolo (E3) è il più importante estrogeno urinario, prodotto dall’ovaio e dalla placenta.Gli estrogeni svolgono la loro attività biologica tramite due recettori ERα e ERβ , il primo più rappresentato a livello uterino e mammario, il secondo a livello osseo e cardiovascolare. Gli estrogeni sono responsabili della fase proliferativa del ciclo mestruale, della maturazione dell'endometrio , dell’azione di feedback sulle gonadotropine ipofisarie ( inibitorio se a basse concentrazioni, stimolatorio a concentrazioni elevate), dello sviluppo dei caratteri sessuali secondari in epoca puberale e, al di fuori della sfera riproduttiva, sono responsabili del trofismo delle mucose, della
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riduzione della secrezione sebacea, del mantenimento della massa ossea e ancora svolgono un’azione protettiva a livello cardiovascolare.
Il progesterone, isolato nel 1934 è il principale rappresentante degli steroidi progestativi. Il progesterone è secreto dall’ovaio e dalla corteccia surrenale per tutta la durata del ciclo mestruale. Durante la fase follicolare fino all’ovulazione ciascuna delle due ghiandole partecipa in parti uguali alla produzione totale, che è di circa 0,5 mg/die, e determina concentrazioni plasmatiche pari a 0,2 ng/ml in media. Una quota minima proviene invece dalla conversione periferica del pregnenolone
Poco prima del picco di LH, i livelli di progesterone aumentano e proseguono ad elevarsi rapidamente nel periodo luteinico fino a raggiungere intorno al 5°-8° giorno dopo l’ovulazione, concentrazioni massime comprese tra i 12 e 50 ng/mL.
Il progesterone entra nelle cellule mediante diffusione e si lega al suo recettore nucleare (PR). Due isoforme di PR, PR-A e PR-B, sono presenti nell'endometrio umano. Il contenuto cellulare dei PRs tipicamente dipende dalla precedente induzione estrogenica. Il progesterone agisce come un antiestrogeno riducendo l’espressione di ERα, diminuendo i livelli tissutali di estradiolo attraverso la sua conversione in estrone e aumentando l’inattivazione degli estrogeni mediante solfatazione.
Entrambe le isoforme recettoriali sono codificate dallo stesso gene e differiscono soltanto per il residuo N-terminale di PR-A, che ha 164 amminoacidi in meno. Il legame del progesterone con i recettori specifici porta a dimerizzazione, cambiamento conformazionale e regolazione della trascrizione genica. Entro uno o due minuti, il progesterone forma assieme ai recettori a livello nucleare, degli aggregati rilevabili, osservati in grandi quantità durante la fase secretiva endometriale di donne sane
Le principali azioni del progesterone a livello endometriale, vanno di pari passo con i livelli sierici crescenti di progesterone nella fase luteale. La quantità di PR endometriale raggiunge l’apice durante la fase proliferativa e si riduce drasticamente durante la fase luteale iniziale. Il progesterone permette la transizione dalla fase proliferativa endometriale a quella secretiva, favorisce l’annidamento della blastocisti ed è essenziale per il mantenimento della gravidanza. Queste caratteristiche ne spiegano l’etimologia del nome. Il progesterone ha un ruolo importante anche in altri tessuti come la ghiandola mammaria in preparazione all’allattamento, il sistema cardiovascolare, il SNC e il tessuto osseo.
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2. Azioni principali del progesterone a livello endometriale
L'endometrio risulta costituito da due strati: uno strato superficiale transiente e uno strato basale permanente, adiacente il miometrio.
-Lo strato superficiale (detto anche decidua funzionale) contiene epitelio ghiandolare e stroma, e durante la fase mestruale e il parto si sfalda completamente per poi rigenerarsi successivamente.
A sua volta può essere suddiviso in uno strato compatto più vicino alla superficie, e strato spongioso dove prevale la parte ghiandolare. Il termine funzionale deriva dalla caratteristica sensibilità all'azione ormonale steroidea.
-lo strato basale contiene la parte terminale delle ghiandole endometriali, è costituito da stroma densamente organizzato e non si sfalda durante il parto o le mestruazioni. Non è sensibile agli steroidi ovarici ed è lo strato a partire dal quale avviene la ciclica rigenerazione .
In ogni ciclo mestruale, se non si verifica l’impianto embrionale, lo strato funzionale dell'endometrio va incontro a sfaldamento ed entro 2 settimane viene ripristinato. Una volta che lo strato funzionale è stato ricostruito con successo, le azioni del progesterone trasformano l’endometrio indotto dagli estrogeni durante la fase proliferativa, in uno stato ricettivo 10
Il processo differenziativo si realizza fisiologicamente ogni ciclo mestruale fino allo stadio di predecidualizzazione ma solo con l'impianto dell'embrione prosegue fino alla decidualizzazione compiuta. Il progesterone è il determinante necessario a questa differenziazione ciclica.
A livello endometriale il progesterone:
· effettua un’ azione antiproliferativa antagonista a quella degli estrogeni: questa azione probabilmente è legata alla soppressione di hand2, un mediatore paracrino degli effetti mitogenici degli estrogeni a livello stromale. 11
-opera modificazioni in senso secretivo: la fase secretiva comincia circa 48 ore dopo l’ovulazione, prevede modifiche a livello ghiandolare, con vacuolizzazione delle cellule ghiandolari e inizio dell’attività di secrezione. Il picco dell’attività secretiva si raggiunge intorno al 7° giorno dopo il picco dell’LH e coincide con l’eventuale impianto della blastocisti. Nella fase secretiva intermedia (19°- 23°giorno), la superficie dell’endometrio presenta un aspetto ondulato, le ghiandole aumentano ulteriormente di volume e assumono un
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tipico aspetto “a cavaturacciolo”. Inizia a regredire l’edema stromale e le arteriole spiraliformi si ispessiscono e raggiungono un numero superiore rispetto le reali necessità nutritive
dell’endometrio, a significare che tutto è pronto ad accogliere un’eventuale gravidanza. -Il progesterone inoltre induce la recettività e la competenza endometriali anche agendo a livello del sistema immunitario, promuovendo la tolleranza immunitaria a livello
dell’interfaccia materno fetale: il progesterone stimola la produzione di PIBF (progesterone induced blocking factor, una proteina immunomodulatoria con diversi effetti antiabortivi) da parte dei linfociti e delle cellule deciduali CD56+ 11 ;Il PIBF promuove lo shift verso la produzione di citochine non infiammatorie da parte dei linfociti TH2 (IL4 e IL5); e inibisce l’attvità delle cellule natural killer. Il LIF (leukemia inhibiting factor), essenziale per
l’impianto embrionale è down-regolato dalle citochine prodotte dalle cellule Th1 (IL- 2, IFN-y e INF-α) , mentre è up-regolato dalle citochine prodotte dalle cellule Th2. Nelle donne con aborto ricorrente inspiegato vi è una ridotta produzione di LIF, IL-4 e IL-10 da parte delle cellule T deciduali
-Il progesterone migliora il flusso sanguigno locale e l’apporto di ossigeno incrementando la produzione di ossido nitrico 12
-Oltre alle numerose azioni a livello endometriale, il progesterone riduce la contrattilità uterina al momento dell’impianto.13 Le azioni tocolitiche del progesterone si estrinsecano
mediante riduzione della quantità di recettori miometrali dell’ossitocina, in contrapposizione all’azione degli estrogeni. Un secondo meccanismo prevede il legame con recettori di membrana che, una volta attivati, modulano direttamente la concentrazione intracellulare di Calcio e la riduzione della contrattilità miometriale. L’importanza dell’effetto rilassante del progesterone sulla muscolatura uterina ai fini della gravidanza è stata dimostrata in studi sulla valutazione computerizzata della frequenza delle contrazioni miometriali al momento del transfert in donne che si sottoponevano a cicli FIVET: la supplementazione precoce della fase luteale con progesterone vaginale si dimostrava in grado di ridurre la contrattilità miometriale, responsabile della prematura espulsione degli embrioni e di ridotti tassi di impianto 14
Il progesterone ha un ruolo fondamentale nel sostegno della prima fase della gravidanza. Concentrazioni di progesterone insufficienti al momento dell’impianto embrionale e nelle prime fasi della gravidanza, possono causare aborto precoce.
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3. Finestra d’impianto e marcatori di recettività
endometriale
L'endometrio è normalmente un ambiente non ricettivo per un embrione, tranne che durante la finestra di impianto: una finestra temporale che normalmente ricade nei 6-10 giorni dopo il picco di LH. Il riconoscimento della finestra d’impianto è fondamentale per identificare il miglior timing per l’Embryo Transfert durante i cicli ART.
Perché l’impianto embrionale avvenga con successo devono essere soddisfatte numerose condizioni. La riuscita dell’impianto richiede un endometrio ricettivo, un embrione normale e funzionale allo stadio di blastocisti e un sincronismo tra tessuti materni ed embrionali.
Nella donna, la recettività endometriale, in un ciclo mestruale regolare, è compresa tra i giorni 20 e 24 (6-10 giorni doopo il picco di LH). 15
La recettività è il risultato di svariati processi che coinvolgono una serie di citochine, fattori di trascrizione, azione di steroidi. Questo ristretto arco temporale è definito come “finestra di impianto”, durante il quale esistono le condizioni endometriali favorevoli.
I marcatori biochimici della recettività endometriale.
Una varietà di marcatori, in particolare quelli espressi durante la finestra di impianto, sono stati identificati nel tentativo di studiare la recettività endometriale. Potenziali biomarkers sono rappresentati da: uterine natural killer cells, pinopodi, molecole di adesione endometriali (ad esempio integrine), molecole anti-adesione endometriali (ad esempio mucina 1), citochine, fattori di crescita, calcitonina, homeobox genes e altri ancora.
Le Uterine natural killer (uNK) sono cellule del sistema immunitario che proliferano durante il ciclo mestruale e costituiscono il 70% dei linfociti endometriali al momento dell’impianto. Queste cellule esprimono una varietà di fattori angiogenetici che facilitano il rimodellamento vascolare e l’invasione del trofoblasto durante lo sviluppo placentare. I Pinopodi sono protrusioni sulla superficie apicale dell'epitelio endometriale aggettanti per diversi micrometri nel lume uterino, riscontrate durante un breve periodo di tempo (massimo 2 giorni, dal giorno 19 al giorno 21) ipoteticamente corrispondente alla finestra temporale
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d’impianto. Alcuni studi hanno rilevato che i pinopodi sono presenti in tutta la fase secretiva medio tardiva, mostrando cambiamenti morfologici nel corso del ciclo. Ciò suggerisce quanto sia importante la morfologia dei pinopodi, piuttosto che la presenza o assenza degli stessi. Il diverso pattern di espressione dei pinopodi durante il ciclo mestruale sostiene il loro uso come marcatori di impianto. La rilevazione di pinopodi durante la fase secretiva intermedia può essere estremamente utile per una valutazione della recettività endometriale allo scopo di ottimizzare i tassi di impianto. I pinopodi assorbono liquido e macromolecole per endocitosi; così facendo avvicinano la parete uterina alla blastocisti. Così, il periodo di attività dei pinociti potrebbe ulteriormente definire con precisione la finestra temporale di impianto. I pinopodi continuano ad assorbire fluidi, e rimuovere la maggior parte di esso durante le prime fasi di impianto. Lo sviluppo dei pinopodi è progesterone-dipendente. La microscopia elettronica è il principale strumento utilizzato per osservare queste strutture.
Le integrine sono molecole di adesione cellulare, coinvolte in una vasta varietà di processi cellulari. Tre integrine (A1B1, A4b1 e avb3) sono ritenute importanti per la recettività endometriale, dato che sono espresse durante la finestra di impianto. Il loro ruolo esatto rimane controverso 16. La misurazione dell’integrina è stata proposta come test clinico per la
valutazione della recettività endometriale, tuttavia la sua espressione è molto variabile tra ciclo e ciclo
Il LIF (Leukemia inhibitory factor) è una citochina della famiglia gp130, ed è la prima citochina che sembrava essere criticamente coinvolta nello sviluppo embrionale e nell'impianto (L’impianto fallisce nei topi knockout per il gene LIF, ma le loro blastocisti possono essere impiantate con successo in modelli wild-type )17
Nell’uomo l’espressione ciclica di LIF a livello endometriale e l’associazione tra carenza di LIF e infertilità può suggerire un’importante ruolo di LIF nell’impianto. 18
4. Fase luteale: luteinizzazione, steroidogenesi, luteolisi
La fase luteale, definita come la fase compresa tra l’ovulazione e l’inizio delle mestruazioni, è la fase fisiologicamente regolata dall’attività del corpo luteo. Il corpo luteo, che si sviluppa
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dopo la rottura del follicolo, è una ghiandola endocrina temporanea secernente ormoni steroidei, soprattutto progesterone ed è fondamentale nella fase iniziale della gravidanza: una luteectomia prima della VII settimana è in grado di causare calo drastico di progesterone e aborto. 19
L’attività endocrina del corpo luteo è modulata mediante un controllo di tipo centrale operato dall’ipofisi e mediante un controllo di tipo locale operato da sostanze secrete dallo stesso corpo luteo.
L’LH gioco un ruolo di sostegno per tutta la durata della fase luteinica, fino alla dimissione del corpo luteo. In caso di gravidanza, l’attività steroidogenica sarà mantenuta dall’hCG prodotto dal sincizio trofoblasto, il quale supporterà la produzione di progesterone fino allo shift luteoplacentare.
4.1 Luteinizzazione
Il processo di luteinizzazione coinvolge cambiamenti nell’espressione di molecole di adesione della matrice extracellulare. In seguito all’ovulazione, si ha la degradazione della membrana di slaviansky, la quale separava le cellule della granulosa (compartimento avascolare) dalle cellule tecali (compartimento vascolarizzato). Ciò favorisce l’invasione di numerosi tipi cellulari come cellule tecali, fibroblasti e cellule endoteliali.
Il processo di luteinizzazione comporta cambiamenti ultrastrutturali nella granulosa, che consentono l’acquisizione di capacità steroidogenetica. Riarrangiamenti cellulari consentono alla cellula l’accesso al colesterolo e il passaggio degli steroidi al Golgi.
La trasformazione delle cellule della granulosa in grandi cellule luteiniche è accompagnata dalla formazione di nuovi vasi. Cambiamenti nella microarchitettura vascolare tecale iniziano immediatamente dopo il picco di LH. Lo sviluppo del corpo luteo è strettamente legato al VEGF: Il VEGF induce la proliferazione delle cellule endoteliali (l’attività mitotitca del corpo luteo è limitata grandemente alle sole cellule endoteliali, che rappresentano il 30-40% della popolazione cellulare del corpo luteo ) il risultato è la creazione di una ricca rete capillare.
La formazione di nuovi vasi, favorisce il supporto luteale, la messa in circolo dei prodotti e permette al corpo luteo di diventare uno degli organi più riccamente vascolarizzati del corpo umano.
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4.2 Steroidogenesi nel corpo luteo
La steroidogenesi è la principale funzione del corpo luteo e il progesterone ne costituisce il principale prodotto. Vengono prodotti fino a 40mg di progesterone al giorno, oltre ad una significativa quantità di androgeni ed estradiolo.
Il corpo luteo è composto sia da cellule steroidogeniche (grandi e piccole cellule luteiniche) e non steroidogeniche( cellule endoteliali, cellule del sistema immunitario, fibroblasti..). Entrambe queste popolazioni sono essenziali per la secrezione di steroidi. La produzione di steroidi dipende fondamentalmente dall’azione dell’LH, il quale attraverso l’aumento di cAMP, regola l’espressione dei geni essenziali per la sintesi ormonale
All’interno del corpo luteo umano sono stati identificati due tipi di cellule steroidogeniche: grandi cellule luteali, derivate dalle cellule della granulosa, che producono grandi quantità di progesterone in modo tonico basale, e piccole cellule luteali derivate da cellule tecali che rispondono all’LH nella seconda metà della fase luteale e sono responsabili delle variazioni pulsatili dei livelli di progesterone circolante 19
Mentre nella fase follicolare le cellule della granulosa non sono in grado di utilizzare il colesterolo per la steroidogenesi de novo (contrariamente alle cellule tecali), nella fase luteale sia le grandi che le piccole cellule luteiniche possiedono questa capacità. La luteinizzazione delle cellule della granulosa infatti, si accompagna ad un netto incremento nell’espressione dei geni coinvolti nel trasporto del colesterolo, nella conversione da colesterolo a pregnenolone (p-450scc, 3-beta-idrossisteroido deidrogenasi 3b-HSD) e in generale della sintesi di progesterone. Allo stesso tempo l’espressione dei geni dell’aromatasi CYp119a1 è stata silenziata dal picco di LH 20
Il colesterolo per la steroidogenesi è fornito dalle lipoproteine plasmatiche HDL e LDL che si legano ai recettori LDLr e SR-B1. Il colesterolo può anche essere sintetizzato dalla cellula stessa. Il complesso viene internalizzato e il colesterolo può essere immagazzinato sottoforma di esteri del colesterolo in lipid droplets o utilizzato per la steroidogenesi. Quando necessario per la steroidogenesi viene trasportato da proteine carrier verso la membrana mitocondriale esterna, qui la proteina STAR 1 lo trasferisce alla membrana mitocondriale interna, dove il citocromo p450scc opera il taglio della catena laterale e lo trasforma in pregnenolone.
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Il pregnenolone viene convertito in progesterone grazie all’azione della 3betaidrossisteroido deidrogenasi presente sia nei mitocondri, sia nel reticolo endoplasmatico.
4.3 Regolazione endocrina corpo luteo e luteolisi
Il ruolo dell’LH nel sostenere il corpo luteo è ampiamente dimostrato e complessivamente la funzione del corpo luteo è strettamente dipendente dall’LH 20
L’LH è fondamentale per i passaggi della steroidosintesi ( aumenta l’espressione di LDLr, proteine STAR e P450scc
Durante la prima metà della fase luteale, la maggior parte di estradiolo e progesterone sono secreti principalmente dalle grandi cellule della granulosa luteinica, senza alcuna correlazione temporale con l’ LH. Durante la seconda metà della fase luteale, estradiolo e progesterone nel sangue oscillano in concomitanza con i pulses di LH presumibilmente a causa della secrezione episodica delle piccole cellule luteiniche 21
In questa fase la risposta secretoria di progesterone al hCG esogeno è massima. Allo stesso tempo gli aumenti transitori LH-dipendenti di progesterone diventano più pronunciati, e la secrezione basale è proporzionalmente meno importante. Questo incremento della risposta secretoria a LH e hCG in vitro può riflettere una predominanza funzionale delle piccole cellule luteali e predice la responsività all’hCG che sarà richiesta al corpo luteo in caso di concepimento e impianto.
Il corpo luteo continua a dipendere dall’ LH (o hCG) per tutta la sua durata e il progesterone a sua volta modula la secrezione delle gonadotropine, dimunendo la frequenza dei pulses di gonadotropine nel corso della fase luteale. Questo effetto può essere attribuito all’aumento dei livelli di oppiodi a livello dell’ipotalamo medio-basale e del pulse-generator, mediato dal progesterone.
Al 10-11 giorno dall’ovulazione, la secrezione di progesterone inizia a calare nonostante l’LH. In questa fase diminuisce la frequenza dei pulses di LH e inizia la luteolisi funzionale, cioè la progressiva riduzione della capacità di rispondere all’LH da parte del corpo luteo.
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La luteolisi è un processo inevitabile in assenza di concepimento, infatti solo l’instaurarsi di una gravidanza garantirebbe il supporto trofico dell’hCG. La regressione del corpo luteo è essenziale perché permette la maturazione di nuovi follicoli e la rigenerazione endometriale.
Nei modelli animali con lesioni ipotalamiche, il mantenimento di livelli adeguati di LH, indotto tramite la somministrazione di GnRH alla frequenza tipica della fase luteale iniziale, non previene la luteolisi 22
Altri studi dimostrano che un corpo luteo ormai in fase di regressione non torna a produrre progesterone neanche con alte dosi di hCG esogeno.
Tuttavia bloccando il rilascio di LH mediante la somministrazione di GnRH antagonisti, si ottiene una rapida diminuzione di progesterone nelle 24h. Tutto ciò suggerisce che l’LH è essenziale nello sviluppo e nel sostegno del corpo luteo, ma che la regressione del corpo luteo non è dovuta a variazioni di frequenza e ampiezza dei pulse di LH. Questo conferma come la refrattarietà del corpo luteo all’LH sia l’elemento fondamentale per la luteolisi.
Dal punto di vista istologico la regressione comporta una progressiva vacuolizzazione delle cellule, la perdita dell’apparato enzimatico preposto alla steroidogenesi, la disorganizzazione di reticolo endoplasmatico e Golgi, inclusioni lipidiche, fino alla ialinizzazione finale e alla trasformazione in corpo albicante
La secrezione di progesterone da parte del corpo luteo diminuisce sempre più, la frequenza dei pulses di LH è sempre più bassa, la secrezione basale è ormai trascurabile: i livelli di progesterone cadono a valori preovulatori
Questa diminuzione di ormoni steroidei, assieme alla diminuzione della secrezione peptidica da parte del corpo luteo, porta ad un aumento della frequenza dei pulses di GnRH e ad un aumento della secrezione di FSH, consentendo l’inizio del ciclo successivo.
Studi in vitro evidenziamo una riduzione dei recettori dell’LH, e una diminuzione dell’espressione della proteina STAR la cui riduzione è ritenuta fondamentale nel declino del corpo luteo.
Un'altra componente importante nella luteolisi sembra essere la prostaglandina PGF2α, la quale sarebbe in grado di abolire la produzione di cAMP LH-indotta. A differenza delle prostaglandine (PG) I2 ed E2, che supportano lo sviluppo e mantengono il corpo luteo, la prostaglandina F2a induce una marcata diminuzione della secrezione di progesterone da parte
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del corpo luteo, in molti non-primati è addirittura definita luteolisina. Nei primati il trattamento con PGF2a diminuisce le concentrazioni di mRNA che codifica per LHr, LDLr, STAR e 3b-HSD, mentre l’mRNA che codifica per i recettori di HDL e P450scc non sono alterati in maniera significativa. La PGF2α stimola l’endotelina-1, sopprime i livelli basali di StAR e e stimola l'espressione del DAX-1, un fattore di trascrizione negativo che riduce StAR . Il trattamento con la prostaglandina F2a riduce anche l’apporto ematico al corpo luteo, induce la frammentazione del DNA e un aumento di calcio libero intracellulare con conseguente apoptosi. L'iniziazione di apoptosi non è evidente fino a diverse ore dopo l'inizio del declino del progesterone plasmatico (luteolisi funzionale) e aumenta in modo significativo durante la fase luteale tardiva.
Il corpo luteo può essere sottratto alla luteolisi e continuare a produrre progesterone se avviene l’impianto embrionale e il trofoblasto inizia a produrre hCG. Come è vero che l’inizio della gravidanza previene la luteolisi, così è vero che la funzionalità del corpo luteo è fondamentale per la prima fase della gravidanza: la luteectomia eseguita prima delle 7 settimane di gestazione, conduce all’aborto. Se la luteectomia viene effettuata tra la VII e la IX settimana, si riscontrano alcuni casi di aborto, mentre la luteectomia dopo la IX settimana non influenza la prosecuzione della gravidanza. Inoltre, la gravidanza può procedere anche in caso di luteectomia mediante somministrazione di progesterone. 23 Questi studi evidenziano l’importanza del progesterone
prodotto dal corpo luteo per l’instaurazione e il mantenimento della gravidanza
5. Introduzione ART (Assisted reproductive technology)
Per tecniche di procreazione medicalmente assistita si intendono tutti quei procedimenti che comportano il trattamento di oociti umani, di spermatozoi o embrioni nell'ambito di un progetto finalizzato a realizzare una gravidanza
La riproduzione assistita è possibile, quindi, mediante una gamma di opzioni terapeutiche, a diverso grado di invasività. Nel nostro paese sono state suddivise, tenendo conto della loro complessità e necessità o meno di anestesia, in:
tecniche di I livello tecniche di II e III livello.
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5.1 Tecniche di I livello
Inseminazione Intrauterina (IUI)
È una tecnica che prevede la deposizione direttamente all’interno della cavità uterina di spermatozoi adeguatamente preparati, sincronizzando tale deposizione con l’ovulazione. La IUI può essere eseguita su ciclo spontaneo o in seguito ad induzione della crescita follicolare multipla (ICFM)
L’efficacia della IUI su ciclo con ICFM è maggiore rispetto a quella della IUI su ciclo spontaneo. 24
Le indicazioni della IUI comprendono:
-infertilità maschile da disturbi dell’eiaculazione o da alterazione dei parametri del liquido seminale di grado lieve-moderato
-endometriosi minimo o moderata -infertilità idiopatica
-precedente fallimento di ICFM associata a rapporti sessuali mirati -coppie sierodiscordanti fertili
La IUI comprende le seguenti fasi:
1) induzione o meno dell’ovulazione o della crescita follicolare multipla 2) monitoraggio dell’ovulazione spontanea o indotta, o della ICFM 3) separazione nemaspermatica
4) IUI propriamente detta, in cui si depongono spermatozoi adeguatamente preparati in cavità uterina per via transcervicale. Il corretto timing viene valutato mediante ecografia transvaginale, la metodica d’elezione che consente il monitoraggio della crescita follicolare e la conferma dell’avvenuta ovulazione.
5.2 Tecniche di II livello
Tecniche di II Livello (procedure eseguibili in anestesia locale e/o sedazione profonda) comprendono :
-la fecondazione in vitro con transfert embrionario (FIVET)
- la iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo con trasferimento degli embrioni nella cavità uterina (ICSI).
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- prelievo testicolare dei gameti (prelievo percutaneo o biopsia testicolare);
- eventuale crioconservazione di gameti maschili e femminili ed embrioni (nei limiti delle normative vigenti);
Le tecniche FIVET e ICSI possono essere effettuate su:
o “cicli a fresco”, quando nella procedura vengono utilizzati embrioni, che sono stati appena fecondati
o “cicli da scongelamento” se gli embrioni o gli ovociti sono stati precedentemente crioconservati e sono stati scongelati per effettuare quel ciclo di trattamento.
FIVET( fecondazione in vitro embryo transfert)
La FIVET consiste nella fertilizzazione in vitro degli ovociti e nel trasferimento in utero degli embrioni ottenuti in vitro.
Le principali indicazioni alla FIVET includono: fattore tubarico-pelvico; fattore maschile di grado lieve/moderato; endometriosi; infertilità idiopatica con fallimento delle tecniche di I livello
La tecnica FIVET prevede una serie di passaggi:
o Stimolazione farmacologica dell’ovaio, con monitoraggio ecografico e ormonale o Prelievo chirurgico ecoguidato degli ovociti prodotti (pick-up)
o Separazione nemaspermatica
o Inseminazione degli ovociti in laboratorio o Fecondazione degli ovociti
o Coltura degli embrioni
o Embryo Transfert (ET) (trasferimento ecoguidato degli embrioni in cavità uterina) o Sostegno della fase luteale
ICSI (iniezione intracitoplasmatica di un singolo spermatozoo).
Tecnica introdotta nel 1992 dal ricercatore Italiano Giampiero Palermo; prevede gli stessi passaggi della Fivet, fino al momento della fecondazione, che avviene tramite iniezione diretta
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di un singolo spermatozoo all’interno del citoplasma dell’ovocita maturo. Risultò rivoluzionaria soprattutto nei confronti del fattore maschile.
Le principali indicazioni alla ICSI includono: fattore maschile di grado severo/severissimo; azoospermia ostruttiva e non ostruttiva; mancata fertilizzazione o fertilizzazione di un numero di ovociti inferiore al 20% dopo FIVET; impiego di ovociti o spermatozoi crioconservati
5.3 Tecniche di III Livello
(procedure che necessitano di anestesia generale con intubazione):- prelievo microchirurgico di gameti dal testicolo;
- prelievo degli ovociti per via laparoscopica;
- trasferimento intratubarico dei gameti maschili e femminili (GIFT) per via laparoscopica
GIFT (gamete intrafallopian transfer) è una tecnica ormai poco utilizzata, che prevede,
attraverso una piccola incisione sull’addome, il trasferimento degli ovociti non fertilizzati e del liquido seminale nelle tube di Falloppio, tramite catetere
5.4 Prelievi testicolari
: tecniche che prevedono il prelievo testicolare di spermatozoi incaso di azoospermia ostruttiva e non ostruttiva, aneiaculazione, eiaculazione retrograda o Aspirazione Percutanea di Spermatozoi per via Testicolare (TESA)
o Estrazione di Spermatozoi per via Testicolare (TESE)
o Aspirazione Microchirurgica di Spermatozoi dall’Epididimo (MESA) o Aspirazione Percutanea di Spermatozoi dall’Epididimo (PESA).
5.5 Stimolazione ovarica controllata
Al fine di prelevare il maggior numero di ovociti maturi, ridurre la crescita asincrona dei follicoli, correggere eventuali problemi anovulatori e quindi aumentare le probabilità di concepimento, si ricorre alla stimolazione ovarica controllata.
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La stimolazione ovarica controllata si basa sull’utilizzo di diverse categorie di farmaci con lo scopo di :
1) indurre la crescita follicolare multipla 2) prevenire il picco prematuro di LH
3) triggering (induzione e completamento della maturazione follicolare e ovocitaria)
5.5.1 Induzione della crescita follicolare multipla
I farmaci utilizzati per la crescita follicolare multipla comprendono:
I farmaci antiestrogeni: agiscono a livello ipofisario in modo competitivo sui recettori per gli
estrogeni, impedendo così il feedback negativo da parte degli estrogeni sul rilascio di GnRH e inducendo produzione endogena di FSH da parte dell’ipofisi stessa; la conseguenza è uno sviluppo ovarico mono o plurifollicolare. Sono farmaci efficaci, somministrabili per via orale e trovano ampio utilizzo in donne giovani, oligo-anoovulatorie e con indicazione a IUI. Il più utilizzato di questa categoria è il clomifene citrato (CC).
Gonadotropine esogene: agiscono direttamente a livello ovarico determimando una selezione
follicolare multipla e un’aumentata produzione di ovociti. Le gonadotropine sono state introdotte in commercio a partire dagli anni’ 60. Le prime gonadotropine introdotte erano unicamente di origine estrattiva, provenienti sia da donne gravide che da donna in menopausa. Con il tempo sono state introdotte gonadotropine sottoposte a processi di purificazione, con lo scopo di eliminare non solo la quantità di composti potenziamente allergenici, ma anche di ridurre la presenza di LH/hCG. Grazie al miglioramento delle tecniche analitiche e di produzione, si sono prodotte gonadotropine con una purezza progressivamente superiore e quindi con una ridotta presenza di ormone luteinizzante LH e minore contaminazione proteica, fino ad arrivare alle hpFSH e hphMG che possono essere somministrate sottocute senza alcuna allergia locale o ipersensibilità.
Infine la tecnologia del DNA ricombinante ha permesso lo sviluppo di rFSH con elevata purezza, elevata biodisponibilità e una maggiore e clearance plasmatica, con una produzione
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illimitata ed indipendente dalla raccolta urinaria. In base alla catena sintetizzata sono disponibili due tipologie di r-FSH (r-FSH beta e r-FSH alfa)
L’rLH è disponibile in commercio sia come forma a sé stante sia come associazione con r-FSH (2:1). L’hCG esogeno è disponibile in commercio nelle sue forme urinaria (u-hCG) e ricombinante (r-hCG)
5.5.2 Prevenzione del picco prematuro endogeno di LH
L’impiego dei GnRH-analoghi ha lo scopo di sopprimere la produzione di LH ed FSH da parte dell’asse ipotalamo-ipofisario, in quanto un picco prematuro di LH implicherebbe un’ovulazione prematura. Ne risulta la possibilità di un controllo ottimale del ciclo, poiché la crescita dei follicoli, tramite FSH esogeno, può essere protratta sino al punto desiderato.
Il picco prematuro di LH causa luteinizzazione precoce dei follicoli ed ovulazione prematura, prima che si possa procedere al prelievo ovocitario. Per convenzione si parla di picco prematuro di LH con livelli di LH ≥ 10 mIU/mL, e di progesterone ≥1.0 ng/mL prima della somministrazione di hCG. 25
L’utilizzo di questi farmaci (agonisti o antagonisti) avviene secondo determinati protocolli di somministrazione, che cambiano a seconda dei casi.
Azioni del GnRH e GnRH analoghi
Dopo il legame con i recettori sulla membrana plasmatica della cellula ipofisaria che induce il rapido rilascio di granuli secretori contenenti LH e FSH, il complesso ormone-recettore subisce una degradazione nei lisosomi e una frazione dei recettori viene riportata sulla membrana plasmatica, partecipando così ad un riciclo e dando luogo a quel fenomeno di “up-regulation” dei recettori su stimolo del GnRH.
Il self-priming del GnRH gioca un ruolo determinante nell’ovulazione in quanto, l’aumentata sensibilizzazione ipofisaria, è responsabile del picco preovulatorio di gonadotropine. Tuttavia elevate concentrazioni di GnRH per un tempo sufficientemente lungo porta ad una desensiblizzazione dei recettori e ad una riduzione del numero degli stessi dando luogo ad un fenomeno di down-regulation.
Questo fenomeno venne già evidenziato mediante esperimenti su primati, in cui la somministrazione continua di GnRH esogeno era in grado di sopprimere la secrezione sia di
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FSH che di LH, mentre il ritorno alla stimolazione pulsatile era in grado di ripristinare la secrezione gonadotropinica.26 .
La down-regulation dipende da un rapido disaccoppiamento del recettore dalle proteine G e dal loro sequestro dalla membrana plasmatica, seguito da un’internalizzazione e degradazione. Il fenomeno di down-regulation è ampiamente sfruttato e ha permesso il largo utilizzo clinico di GnRH analoghi in varie situazioni cliniche come il trattamento dell’endometriosi, della fibromatosi uterina, di alcuni tumori ormono-dipendenti e in numerose condizioni patologiche nella medicina della riproduzione. Gli analoghi sono ampiamente utilizzati nei cicli di riproduzione assistita, sia nella prevenzione del picco prematuro endogeno dell’LH, sia nel triggering della maturazione follicolare e ovocitaria.
Nella pratica clinica sono impiegate due classi di analoghi: i GnRH agonisti (GnRH-a) e gli antagonisti (GnRH-an)
Mentre la somministrazione di GnRH agonisti è associata ad un iniziale effetto flare-up, con rilascio acuto di LH e FSH dose-correlato e una down regulation dopo stimolazione continua; gli antagonisti bloccano in maniera acuta il rilascio di gonadotropine ipofisarie senza l’effetto flare-up, e il loro effetto è prontamente reversibile.
Per quanto riguarda l’utilizzo degli analoghi esistono vari tipi di protocolli, i principali possono essere così schematizzati:
• PROTOCOLLI LUNGHI: La ICFM mediante gonadotropine inizia dopo avere ottenuto la desensibilizzazione ipofisaria. La somministrazione del GnRH-a può iniziare in fase luteale media-tardiva o follicolare precoce
• PROTOCOLLI BREVI o flare-up: la somministrazione inizia contemporaneamente a quella di gonadotropine e dura sino al giorno dell’hCG
• PROTOCOLLI ULTRA-BREVI: prevedono la somministrazione dell’analogo negli ultimi tre giorni della fase follicolare precoce.
Per quanto riguarda gli antagonisti del GnRH, il protocollo di utilizzo prevede la somministrazione delle gonadotropine dai primi giorni del ciclo con aggiunta dell’antagonista nella fase finale della stimolazione, quando i follicoli sono quasi maturi, e può avvenire tramite singola dose o dosi giornaliere
21
I cicli con GnRH antagonisti sono associati ad un più basso rischio di sindrome da iperstimolazione ovarica e sono il protocollo consigliato nelle pazienti ad alto rischio di svilupparla
La sindrome da iperstimolazione ovarica è la complicanza più temuta nell’induzione dell’ovulazione ed è potenzialmente pericolosa per la vita. È caratterizzata da un ingrandimento ovarico e rapido passaggio di fluido dal compartimento vascolare al terzo spazio. Il fattore scatenante è l’hCG endogena o esogena in pazienti con un grande numero di follicoli in entrambe le ovaie (≥20) e concentrazioni di E2 ≥3000 pg/ml
5.5.3 Triggering
Si utilizzano farmaci in grado di completare la maturazione follicolare e ovocitaria. Essi comprendono: hCG (urinario o ricombinante); r-LH e GnRHag.
L’adeguato timing del triggering si basa sul rilievo ecografico di uno o più follicoli con diametro maggiore di 17 mm.
Il monitoraggio della risposta ovarica durante la stimolazione permette inoltre di modificare la posologia delle gonadotropine a seconda della risposta ovarica e di individuare pazienti a rischio di sindrome da iperstimolazione ovarica.
Triggering con hCG e r-LH
La tecnologia ricombinante ha permesso la produzione di due farmaci che possono essere utilizzati per lo stesso scopo ossia mimare il picco naturale di LH. Questo ha consentito ai produttori di adeguare la produzione alle esigenze del mercato e rimuovere tutti i contaminanti urinari, facilitando la sicurezza del paziente durante la somministrazione del farmaco e la standardizzazione dei lotti. Una meta-analisi recente ha evidenziato però che non ci sono differenze tra r-hCG e u-hCG in termini di gravidanze e in termini di effetti collaterali (come la sindrome da iperstimolazione ovarica) 27
L’u-HCG è stato per decenni il farmaco più comunemente usato per indurre la maturazione finale degli ovociti di cicli di FIVET e ICSI. A causa della sua analogie biologiche e strutturali, hCG e LH legano ed attivano lo stesso recettore.
22
In genere un bolo di u-hCG (5000-10000 UI) o rHCG (250mcg) è somministrato 36h prima del pick up ovocitario. Diversamente dal fisiologico picco gonadotropinico, che termina 48h dal suo inizio, il picco indotto da hCG espande l’attività LH per diversi giorni dopo, andando a coprire la fase luteale. Un’attività LH sovrafisiologica stimola i multipli corpi lutei, portando ad elevate concentrazioni di progesterone ed estradiolo, che si traducono in un’inibizione della secrezione dell’LH endogeno 28
Triggering con agonisti del GnRH
Il cotrattamento con GnRH antagonisti durante la stimolazione ovarica controllata permette l’induzione della maturazione tramite somministrazione di un bolo di GnRHa, dato che i GnRHa spiazzano il legame degli antagonisti dall’ipofisi e in un primo momento attivano il recettore del GnRH. Questa attivazione, con effetto flare-up, induce un picco gonadotropinico più simile al picco fisiologico.
5.5.4 L’endometrio nella stimolazione ovarica controllata
La stimolazione ovarica controllata si associa ad alti livelli di steroidi, i quali possono minare la recettività endometriale andando a interrompere la sincronia embrio-endometriale e/o a promuovere uno sviluppo patologico dell’endometrio.
È già noto in letteratura come alti livelli di progesterone sierico, durante i cicli di fecondazione assistita, poco prima della somministrazione di hCG possano alterare la recettività dell’endometrio e comportare un basso tasso di gravidanze . Una meta analisi ha evidenziato che non c’è associazione tra l’elevazione di progesterone hCG-day nei cicli a fresco e il tasso di gravidanze nei cicli in cui erano stati utilizzati quegli embrioni crioconservati. Similmente le donne che ricevevano ovociti da donatori con elevazione del progesterone hCG-day non avevano una riduzione del tasso di gravidanze, rispetto a coloro che ricevevano ovociti da cicli con normali livelli di progesterone 29
Tali dati suggeriscono come nei casi di luteinizzazione precoce la riduzione delle percentuali di gravidanza sia probabilmente dovuta ad una asincronia tra endometrio e blastocisti e non ad un “danno” degli ovociti e degli embrioni ottenuti
23
Numerose alterazioni sono state riscontrate nell’endometrio sottoposto a stimolazione ovarica controllata.
Pinopodi: Secondo i primi dati sull’espressione dei pinopodi durante stimolazione ovarica, i pinopodi durante i regimi di stimolazione con CC e hMG/hCG erano diminuiti o assenti. Nella stimolazione con GnRH agonisti e somministrazione di gonadotropine esogene, è stata individuata una più precoce espressione di pinopodi (circa 1- 2 giorni prima del giorno atteso) rispetto ai cicli naturali. Queste osservazioni hanno condotto all'ipotesi di un possibile shift della finestra di impianto nei cicli ART. Tuttavia, uno studio successivo non ha trovato alcuna differenza di espressione dei pinopodi. 30
Integrine: Nei cicli di fecondazione in vitro, 2 giorni dopo il recupero degli ovociti, è stata individuata la prematura espressione della subunità delle integrine A1 e A4, in linea con la fase secretiva avanzata Alcuni studi che hanno valutato i cicli stimolati di donatrici di ovociti (situazioni in cui non viene fornito in modo sistematico un supporto luteale) hanno evidenziato una ridotta espressione di integrina ghiandolare avb3, correlata con un ritardo nella maturazione morfologica ghiandolare. Nell’endometrio con uno sviluppo ghiandolare più avanzato, è stata rilevata una maggiore espressione delle integrine 30
LIF : Per quanto riguarda i cicli FIVET, è stato trovato un incremento dell’espressione di LIF, nel giorno 7 della fase luteale 31
Le analisi di alcune biopsie endometriali hanno evidenziato negli endometri analizzati, un avanzamento di più di 2 giorni rispetto ai cicli naturali 32.
Le biopsie hanno rilevato la comparsa di vacuoli subnucleolari ghiandolari, una diminuzione dei recettori per il progesterone sia nelle ghiandole che nello stroma e una riduzione delle mitosi. Solo alcuni endometri mostravano un avanzamento pronunciato (più di 3 giorni) con assenza di mitosi sia a livello stromale che ghiandolare ed edema stromale (caratteristiche che normalmente non sono presenti prima del giorno 4-5 della fase luteale).
6 . LPD (Luteal phase defect)
Il deficit di fase luteale originariamente descritto nel 1949 da Jones è una condizione in cui si ha un’inadeguata trasformazione secretiva dell’endometrio necessaria per il normale impianto
24
e crescita embrionali. Analizzando la fase luteale di donne infertili, Jones riscontrò nei soggetti reclutati una temperatura basale ridotta, una diminuita escrezione urinaria di pregnandiolo nelle 48 ore e biopsie endometriali dimostranti inadeguati cambiamenti in senso secretivo.
6.1 Cause di LPD
Tra i meccanismi ipotizzati nelle eziopatogenesi della insufficienza della fase luteale ci sono: -una riduzione della funzione del corpo luteo risultante in un’insufficiente produzione di progesterone ed estradiolo. La causa di ciò potrebbe essere un inadeguato sviluppo del follicolo dominante destinato a diventare corpo luteo o un’aberrante stimolazione di un follicolo normalmente sviluppato.
-la seconda teoria suggerisce un’incapacità dell'endometrio di rispondere ad appropriate concentrazioni di estradiolo e progesterone.
-Secondo la prima teoria, poiché il corpo luteo origina dal follicolo dominante sarebbe logico concludere che un anormale sviluppo del follicolo dominante possa risultare in un’anormale funzionalità del corpo luteo. Alcuni studi hanno messo in relazione i bassi livelli di FSH con bassi livelli di P, mentre altri studi hanno però riportato un normale profilo FSH durante il deficit d fase luteale. Anche un’anormale pulsatilità della LH è stata implicata come una potenziale causa di LPD. Gli esperimenti di Souls e colleghi hanno trovato che alcune donne con LPD avevano un aumento della frequenza dei pulses di LH nella fase follicolare precoce comparata rispetto alle donne con normale funzione luteale, le quali dimostrano un’accelerazione dei pulses solo vicino all’ovulazione. Dunque è stato ipotizzato che un incremento troppo precoce dei pulses di LH potesse portare ad una diminuita attività del LH nella fase luteale, diminuendo la secrezione di progesterone.
-Secondo un’altra teoria, un'altra possibile causa di LPD è un’ anormale risposta endometriale ad adeguati livelli di progesterone. Questa possibilità venne suggerita da uno studio in cui alcuni soggetti sottoposti a una down-regulation con agonista del GnRH, estradiolo in fase follicolare e insufficiente supplementazione di progesterone hanno prodotto un endometrio del tutto normale alla valutazione istologica, dunque potrebbero esistere altri meccanismi molecolari in grado di influenzare la anormale risposta al progesterone e quindi lo sviluppo anormale della recettività endometriale
25
6.2 Diagnosi di LPD
Jones inizialmente propose diversi criteri: uno clinico (fase luteale accorciata) uno laboratoristico (diminuzione del pregnandiolo urinario) e uno istologico (biopsia endometriale). Tuttavia secondo il Comitato ASRM non esiste un criterio diagnostico standard riproducibile nella pratica clinica e fisiologicamente rilevante per diagnosticare la LPD e distinguere le donne fertili da quelle non fertili. 33
L’accorciamento della fase luteale (che normalmente è di 11 -17 giorni) al di sotto dei 9 giorni può infatti verificarsi nel 5% delle donne fertili
L’utilizzo del dosaggio sierico di progesterone come metodo diagnostico invece, nonostante sia di fatto ancora utilizzato, è gravato dalla secrezione pulsatile e dalla grande variabilità di questo ormone, che può variare anche di 8 volte in 90 minuti. Nell’arco di 24h può andare da 2 ng/ml a 40 ng/ml, dunque una sola valutazione non può diagnosticare né escludere la LPD. Per aumentare la specificità è stato proposto di effettuare 3 prelievi da 3 distretti differenti, durante la fase luteale intermedia.
La biopsia endometriale invece, un tempo considerata il gold standard, ha rivelato dei limiti, in quanto alcuni studi hanno evidenziato la scarsa correlazione tra il giorno del ciclo post-ovulazione (stabilito tramite rilevazione del picco di LH mediante misurazione urinaria) e l’istologia endometriale. La biopsia endometriale si è rivelata uno strumento poco utile per distinguere la fase luteale di donne infertili da quella di donne fertili.
7. Razionale Supporto Fase Luteale In ART
Il deficit di fase luteale nei cicli ART è una condizione nota da tempo.
Nelle donne che ricevono embrioni congelati, per preparare l’endometrio all’impianto, appare ovvia la necessità di supportare correttamente i cicli anovulatori, mediante supplementazione di estradiolo per indurre la proliferazione endometriale seguita dalla somministrazione di progesterone per mimare la fase luteale assente.
Nelle tecniche che prevedono stimolazione ovarica controllata, invece, vi sono diverse ipotesi sull’origine di tale deficit e la questione è tuttora controversa.
26
Una delle prime ipotesi fu che la rimozione di una certa quantità di cellule della granulosa durante il pick-up ovocitario potesse rimuovere un’importante fonte di progesterone. Questa ipotesi fu smentita quando si osservò che dopo l’aspirazione di un singolo follicolo maturo in un ciclo naturale, non vi erano alterazioni dei livelli sierici di progesterone. 34
Alcuni studi avevano già dimostrato che la somministrazione di hCG per il triggering ovulatorio era in grado di sopprimere la sintesi endogena di LH tramite un feedback negativo corto . 35 Tuttavia quando l’hCG veniva somministrato nei cicli naturali non vi erano differenze significative in termini di secrezione di LH
I ricercatori si sono soffermati anche nel sostenere un possibile coinvolgimento dei GnRH analoghi come causa di LPD. L’impiego di agonisti, (GnRH-a) a cui fa seguito la necessità di supporto luteale dà origine ad una soppressione duratura dell’ LH (circa 2-3 settimane) che potrebbe compromettere l’attività endocrina del corpo luteo per tutta la fase luteale. 36
Con l’introduzione dei GnRH-ant e la loro capacità di inibizione pituitaria senza flare-up effect e non a lungo termine, (quindi con rapido ripristino della secrezione gonadotropinica dopo sospensione), è stata ipotizzata la possibilità di evitare il sostegno luteale 37.
Uno studio randomizzato bicentrico ha studiato la fase luteale di donne trattate con antagonisti del GnRH e tre diversi approcci per l'induzione della maturazione finale: r-hCG, r-LH, o bolo di GnRH agonista. In tutti e 3 i gruppi non si verifica un rapido ripristino del rilascio di LH e la fase luteale non supplementata era insufficiente. Nei pazienti trattati con r-hCG, la fase luteale era meno disturbata, rispetto ad entrambi gli altri gruppi, presumibilmente a causa della clearance prolungata dell’hCG risultante in una estensione del supporto del corpo luteo. Nonostante le alte concentrazioni di P ed E2 durante la fase luteale precoce, in tutti e tre i gruppi, la luteolisi è iniziata prematuramente, presumibilmente a causa di una eccessivo feedback sull’asse ipotalamo-ipofisario. Infatti livelli sovrafisiologici di steroidi secreti dai multipli corpi lutei nella fase luteale precoce, eserciterebbero un feedback negativo sulla secrezione di LH. 38
27
8. Supplementazione con progesterone
La supplementazione con progesterone si è affermata su altri tipi di sostegno luteale che hanno dato origine a controversie. Una della alternative al sostegno con progesterone, ampiamente studiata è l’utilizzo di hCG .
L’hCG esogeno è in grado di superare il deficit luteale nei cicli stimolati con gonadotropine agendo indirettamente come una forma di supporto del corpo luteo; aumenta le concentrazioni di estrogeni e progesterone e ha effetti diretti anche a livello endometriale, aumentando le concentrazioni di proteina placentare e integrine coinvolte nell’impianto embrionale. In una meta-analisi del 2005 comprendente 18 studi randomizzati controllati, il confronto tra hCG e progesterone come sostegno della fase luteale, ha mostrato superiorità dell’hCG in termini di tassi di gravidanze (n = 438, OR-1.71, 95% IC 1.06-2.76). 39 Tuttavia diversi studi hanno dimostrato che l’utilizzo di hCG nel supporto luteale era associato ad un più alto rischio di sindrome da iperstimolazione ovarica.
Nella Cochrane review di Van der Linden del 2015, la meta-analisi di 16 RCT ha evidenziato una differenza non significativa in termini di gravidanze evolutive e tassi di nati vivi tra i regimi di sostegno con hCG e quelli con progesterone. (OR 0.95, 95% IC 0.65 to 1.38, cinque RCTs, 833 donne, I2 = 0%,evidenze di bassa qualità ). Tuttavia i regimi con progesterone erano associati ad un più basso rischio di sindrome da iperstimolazione ovarica. (OR 0.46, 95% IC 0.30 to 0.71, 5 RCTs, 1293 donne, I2=48%). Nella stessa review, van der Linden et al , confrontando i dati di 8 studi randomizzati controllati ha dimostrato che il supporto con progesterone è associato ad un più alto tasso di nati vivi e di gravidanze rispetto al placebo40
Il progesterone nella supplementazione luteale può essere assunto secondo diverse vie di somministrazione: Orale, intramuscolo,vaginale, sottocutaneo, rettale
28
8.1 Progesterone intramuscolo
Il progesterone intramuscolo fu il primo farmaco utilizzato per la supplementazione nei cicli ART. Le somministrazioni intramuscolo possono essere a base di progesterone naturale o 17 alfa idrossi progesterone caproato, un derivato del 17idrossiprogesterone, che grazie all’esterificazione con caproato, possiede un’alta attività progestinica e un lento rilascio in circolo.
Nel 1985 Leeton et al. dimostrarono per primi l’estensione della fase luteale dei cicli FIVET trattati con 50 mg im di progesterone. La formulazione di progesterone naturale in soluzione oleosa viene rilasciata lentamente e raggiunge alte concentrazioni plasmatiche. 41
Giornalmente possono essere somministrati dai 25 ai 100 mg di progesterone senza significative differenze nell’outcome clinico 42
Considerata una formulazione molto efficace, l’utilizzo del progesterone intramuscolo è gravato da effetti collaterali soprattutto a livello locale. Sono stati registrati: dolore e arrossamento nel sito di iniezione reazioni allergiche agli eccipienti, ascessi sterili. 43 Sono stati anche riportati casi di polmonite eosinofila acuta 4445
Un altro svantaggio è che l’utilizzo di progesterone intramuscolo spesso richiede l’aiuto di una seconda persona per la somministrazione
Sulla base di ciò, molti studi si sono concentrati sulla ricerca di altre forme di progesterone che potessero essere ugualmente efficaci ma meglio tollerate
8.2.1 Progesterone naturale orale
Fin dagli anni ‘80, il progesterone naturale micronizzato (P4) somministrato oralmente è stato ampiamente usato. La micronizzazione del progesterone, riducendo le dimensioni delle particelle, migliora l’assorbimento del composto. Le preparazioni orali di progesterone micronizzato, convenienti e di facile somministrazione, si sono dimostrate poco efficaci in termini di tassi di gravidanze. 46
La problematica relativa a questo tipo di somministrazione è legata alla biodisponibilità del composto: dopo l’assorbimento intestinale e l’effetto di primo passaggio epatico, viene escreto per via renale. La biodisponibilità del P4 risulta essere circa il 10% rispetto alle
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somministrazioni intramuscolo .47 I livelli sierici raggiungono il picco in 2-4 ore e rimangono significativamente elevati per sole 6-7 ore richiedendo somministrazioni più frequenti. Uno studio randomizzato dimostrò come il gruppo che utilizzava progesterone aveva un tasso di impianto significativamente ridotto rispetto al gruppo che aveva utilizzato progesterone intramuscolo. 46
La ridotta biodisponibilità del composto, con conseguente necessità di elevazione del dosaggio per raggiungere la dose terapeutica, può aumentare l’incidenza di effetti collaterali come vampate, nausea, ritenzione idrica e sedazione, correlati ai suoi metaboliti 48
Dato l’interesse verso la somministrazione orale, sono state studiate altre formulazioni nel tentativo di sostituire il progesterone micronizzato orale con un’altra formulazione orale (per es didrogesterone orale)
8.2.2 Didrogesterone orale
Il didrogesterone è un isomero ottico del progesterone in cui il gruppo metile del carbonio 10 è in posizione alfa, a differenza del progesterone naturale che invece è in posizione beta. È presente inoltre un doppio legame aggiuntivo tra il carbonio 6 e 7. Questa modifica rende il didrogesterone più stabile, aumentandone la biodisponibilità. 48 La somministrazione di didrogesterone ha pochi effetti collaterali (solo alcuni casi di sonnolenza e nausea 49 )e ha riportato un tasso di gravidanze evolutive su cicli FIVET del 31 % 50
Il didrogesterone (DG) non ha effetti androgenici sul feto e non inibisce la produzione di progesterone da parte della placenta.
Nelle pazienti con LPD il didrogesterone si è dimostrato efficace nell’indurre la normale maturazione endometriale. È stato ipotizzato che il didrogesterone, attraverso la sua preferenziale affinità per il recettore PR-A, inducesse una maggior produzione di ossido nitrico sintetasi, incrementando quindi la vascolarizzazione endometriale. È stato inoltre suggerito che il didrogesterone fosse in grado di ripristinare le normali concentrazioni di PIBF (progesterone induced blocking factor ) nei linfociti T e nelle cellule endometriali, inducendo situazione immunologica favorevole all’impianto. 50
In uno studio prospettico randomizzato Chakravarty et al. compararono l’efficacia, la sicurezza e la tollerabilità del DG orale (10 mg due volte al giorno) con quelle del progesterone
