morfologia, inducono modifiche rilevanti sui moduli meccanici della struttura

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Conclusioni

In questo lavoro di tesi l’attenzione è stata rivolta alle problematiche inerenti la realizzazione di strutture bioispirate in grado di riprodurre le grandezze meccaniche e la topologia caratteristica della matrice extracellulare. In particolare questo aspetto è dimostrato essere di fondamentale importanza nei processi di trasmissione degli stimoli a livello cellulare. È noto infatti che le attività svolte dalle cellule siano guidate da diversi meccanismi di comunicazione, tra cui il più conosciuto è sicuramente quello chimico. Opportuni gradienti di concentrazione di specifiche molecole infatti possono promuovere fenomeni quali chemiotassi, metabolismo, differenziamento e regolazione del fenotipo. L’altro meccanismo di comunicazione cellulare, sicuramente meno noto del signalling chimico, ma non meno importante è la trasmissione di forze meccaniche e sforzi di taglio. Le cellule che popolano ogni organismo vivente sono organizzate nello spazio al fine di minimizzare la trasmissione delle forze interne e dell’energia. Per riuscire in questo obiettivo vengono promossi processi di riorganizzazione spaziale delle strutture di sostegno, che coinvolgono principalmente il citoscheletro e la membrana cellulare.

La ridistribuzione spaziale di tali elementi, nonché la conseguente variazione di

morfologia, inducono modifiche rilevanti sui moduli meccanici della struttura

cellulare. In questo lavoro di tesi pertanto si è cercato di riprodurre un ambiente

bioispirato, in grado di promuovere una comunicazione meccanica opportuna alle

cellule al fine di ottenere una organizzazione spaziale in-vitro sempre più

verosimigliante a quella presente in-vivo. Le cellule in coltura standard

bidimensionale infatti sono “costrette” ad adattarsi ad un ambiente relativamente

rigido, senza alcuna possibilità di disporsi nello spazio secondo una propria

organizzazione. Durante questo lavoro è stata pertanto analizzata la possibilità dei

realizzare delle strutture tridimensionali con caratteristiche chimico-fisiche e

meccaniche prossime a quelle della matrice extracellulare. Per rendere possibile

questa realizzazione sono state analizzate le diverse tecniche di microfabbricazione

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106 attualmente utilizzate, focalizzando l’attenzione sulle metodiche in grado di rispondere alle specifiche dello studio. Le tecniche in grado di realizzare delle strutture micrometriche utilizzando dei materiali geliformi selezionate sono la Pressure Activated Microsyringe e la Piston Syringe. In particolare la Piston Syringe è una tecnica in grado di esercitare pressioni sufficientemente elevate e costanti, consentendo l’estrusione di materiali relativamente viscosi con un andamento omogeneo. Pertanto è stato necessario condurre una modellazione delle tecniche di microfabbricazione selezionate, permettendo di identificare i valori di grandezze caratteristiche dei materiali da utilizzare per ottenere delle strutture micrometriche.

Il lavoro è stato poi rivolto alla scelta del biomateriale che riunisse in sé

caratteristiche reologiche e meccaniche similari a quelle della matrice

extracellulare, e potesse essere utilizzato con la metodologia di microfabbricazione

prescelta. La scelta è ricaduta sull’alginato, un biopolimero naturale presente in

molti organismi biologici. L’alginato ha una struttura altamente idrofilica che

conferisce un comportamento geliforme quando il polimero si trova in ambiente

acquoso. Le estremità polari presenti nelle catene di alginato in soluzione inducono

la formazione di interazioni polari con specie ioniche di varia natura, in particolare

dall’interazione con gli ioni bipolari positivi calcio, bario e stronzio, è possibile

stabilizzare la struttura dell’alginato nello spazio. Tale interazione è nota come

reazione di reticolazione, comportando la generazione di una struttura stabile per

formazione di legami polari tra diverse catene polimeriche. In questo lavoro è stato

deciso di utilizzare lo ione calcio come agente reticolante, in quanto la sua

interazione con le catene polimeriche risulta sufficientemente elevata per garantire

stabilità spaziale e temporale all’idrogel, ma non tale da realizzare delle strutture

con proprietà meccaniche prossime ai polimeri solidi. Per determinare le

caratteristiche chimico-fisiche e meccaniche dell’alginato sono stati condotti diversi

esperimenti che hanno permesso di quantificare grandezze concorrenti alla

determinazione di un protocollo opportuno per la realizzazione di un materiale

bioispirato e riproducente la matrice extracellulare. La progettazione di tale

protocollo ha consentito la realizzazione di una struttura geliforme con superfici

ben delineate e stabile nello spazio.

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107 Successivamente è stato utilizzato un prototipo di un sistema di microfabbricazione (PAM

²

) realizzato al Centro Interdipartimentale di Ricerca “E. Piaggio”, costituito da un modulo per la movimentazione nello spazio appartenente alla Pressure Activated Microsyringe e da un modulo per l’estrusione che utilizza un motore stepper già presente in laboratorio. L’integrazione di questi due elementi ha reso possibile lo studio di fattibilità per la realizzazione di strutture geliformi micrometriche presentanti una topologia definita. In particolare il sistema robotico per la microfabbricazione consente di realizzare strutture attraverso un processo produttivo CAD/CAM. La quantizzazione dei valori da assegnare alle grandezze di controllo per il funzionamento del sistema robotico, combinate con le caratteristiche meccaniche dell’alginato ha consentito la realizzazione di strutture micrometriche con specifica topologia. Sempre mossi dall’obiettivo di promuovere una organizzazione spaziale bioispirata alle cellule in coltura, lo studio è stato rivolto sulla fattibilità di inglobare specifiche linee cellulari all’interno della struttura in alginato. Sono pertanto stati condotti dei test statici per verificare quale concentrazione percentuale di alginato garantisse un corretto mantenimento delle funzionalità delle cellule inglobate. Nello studio è stata utilizzata una linea cellulare epatica, HepG2, nota da letteratura la propensione di tali cellule ad organizzarsi con una logica precisa nello spazio. La scelta di una linea epatica consente inoltre di verificare la funzionalità metabolica e catabolica con relativa semplicità. Eseguendo un’analisi spettrofotometrica del terreno di coltura è possibile identificare composti caratteristici del metabolismo e del catabolismo, quali rispettivamente glucosio ed urea. Analizzato l’andamento temporale del consumo di glucosio e della produzione di urea, è stato possibile verificare che la concentrazione percentuale di alginato non influenzi significativamente l’attività metabolica della linea cellulare in studio.

Dai risultati pervenuti è stato possibile progettare un sistema in grado di realizzare

delle strutture inglobanti cellule, decidendo di utilizzare il prototipo presente al

Centro Interdipartimentale di Ricerca “E. Piaggio”. Da uno studio delle grandezze

meccaniche in gioco è stato possibile scegliere la concentrazione di alginato da

utilizzare nella sospensione da estrudere, cercando di non indurre danni rilevanti

alle cellule presenti. Dall’analisi dei dati della viscosità e della distribuzione di

pressione e sforzi di taglio, è stato scelto di utilizzare una percentuale di alginato del

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108 6% per la realizzazione della sospensione con HepG2. Tale scelta trova riscontri quantitativi anche in altri studi ritrovati in letteratura. A questo punto è stata definita la procedura da utilizzare per la realizzazione di strutture inglobanti cellule.

La realizzazione di strutture con topologia desiderata, superfici definite e proprietà

meccaniche bioispirate, nonché inglobanti cellule HepG2 è stata validata sia con

studi morfologici, sia con studi metabolici. Utilizzata la procedura definita sono

state realizzate strutture miniaturizzate a griglia, contenenti cellule HepG2 ad

elevata concentrazione. Dopo l’estrusione della sospensione, la promozione della

reazione di reticolazione per fissare la topologia nello spazio e nel tempo, le

strutture sono state poste in incubatore. Contemporaneamente è stata messa in

coltura una sospensione, utilizzando il protocollo per gli studi in statico, al fine di

avere un controllo confrontabile. Il prelievo di campioni di terreno di coltura nel

tempo ha permesso di monitorare l’attività metabolica, monitorando il consumo di

glucosio e la produzione di urea nel tempo. Inoltre alcuni campioni sono stati fissati

contemporaneamente ai prelievi di terreno, permettendo di monitorare la

morfologia sia della membrana che del nucleo cellulare. Con la semplice

osservazione al microscopio è stato possibile controllare la definizione della

membrana cellulare, verificando che il processo di estrusione non alterasse la

morfologia cellulare. Dall’osservazione è stato possibile concludere che le cellule in

coltura statica e quelle estruse ed inglobate nelle strutture geliformi definite non

presentavano variazioni di forma. Successivamente con una colorazione

fluorescente intercalante il DNA del nucleo cellulare, è stato possibile osservare la

morfologia del nucleo cellulare. Anch’esso non ha mostrato variazioni di forma tra

le cellule estruse e quelle di controllo. Con l’analisi a fluorescenza è stato inoltre

possibile apprezzare la diversa disposizione spaziale delle cellule all’interno della

struttura estrusa. Pertanto è possibile concludere che lo studio effettuato ha

permesso la realizzazione di strutture geliformi bioispirate topologicamente definite

ed inglobanti cellule. In base ai risultati ottenuti è possibile ipotizzare che i

protocolli sviluppati possano essere utilizzati per monitorare l’organizzazione

spaziale delle cellule inglobate nel tempo, al fine di indurre la riproduzione di un

tessuto sempre più similare a quello presente negli organismi viventi.

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109 La realizzazione del progetto di un nuovo sistema per la prototipazione rapida

sempre più bioispirata, consentirà la produzione di microstrutture con

caratteristiche chimico-fisiche e topologiche utili allo studio delle interazioni

cellulari a livello sia chimico che meccanico.