Capitolo 4

Capitolo 4

SCOPO DELLA TESI

In base a quanto riportato nei capitoli precedenti, lo sviluppo di metodi sensibili ed accurati che consentano la determinazione degli S-nitrosotioli è di fondamentale interesse.

E’ necessario che il metodo consenta di differenziare i nitrosotioli nelle sue varie specie metaboliche e dalle varie sostanze interferenti, sfruttando proprio la reattività degli RSNO nelle condizioni di analisi adottate.92

Come già riportato, il legame S-N degli S-nitrosotioli può essere rotto eteroliticamente mediante uso di cloruro mercurico (HgCl2). Da questa reazione si forma Hg(GS)2 ed NO+, ed infine NO2- dall’idrolisi dello ione nitrosonio in soluzione acquosa.

Com’è noto, questa reazione è alla base del metodo di Saville per la misura della concentrazione di tioli in soluzione acquosa.157

L’utilizzo della sonda mercuriale p-idrossimercuribenzoato (PHMB, HO-Hg-(C6H4)-COO−Na+) come derivatizzante di gruppi tiolici di proteine e composti tiolici a basso peso molecolare, è stato ampiamente studiato negli ultimi 10 anni presso l’Istituto di Chimica Analitica Strumentale (I.C.A.S.) dell’Istituto per i Processi Chimico-Fisici (I.P.C.F) del CNR di Pisa.158-162

Il PHMB (Fig 4.1-1) appartiene alla classe dei composti mercuriali del benzene. Viene ottenuto per trattamento con NaOH dell’acido p-cloromercuribenzoico (PCMBA)163 e rispetto a quest’ultimo presenta il vantaggio di essere più solubile in ambiente acquoso. In seguito alla reazione di complessazione tra PHMB e gruppi –SH si osserva un sostanziale incremento dell’assorbimento a 254 nm, mentre, alla stessa lunghezza d’onda, il PHMB presenta un assorbimento trascurabile. La reazione, quindi, può essere seguita direttamente mediante uso di uno spettrofotometro UV.163

Il PHMB, essendo una sonda monofunzionale, reagisce con stechiometria 1:1 coi gruppi tiolici:

COO-_Na+

HgOH

Figura 4.1: Formula di struttura del PHMB (p-idrossimercuribenzoato di sodio).

È stato visto che anche nel caso di composti tiolici a basso peso molecolare (Cys, GSH) la reazione di complessazione del PHMB con i gruppi –SH è rapida, con tempo di reazione inferiore al minuto a pH 7.4.164 Infine il PHMB può essere eluito in cromatografia liquida a fase inversa in tempi ragionevolmente brevi (25-35 minuti).162

La tecnica di derivatizzazione con PHMB accoppiata alla tecnica ifenata di cromatografia liquida (RPC) e rivelazione di spettrometria di fluorescenza atomica (CVGAFS) è stata proposta di recente per la speciazione e determinazione dei composti tiolici nel sangue umano.165 L’utilizzo del PHMB in associazione con la tecnica di rivelazione CVGAFS richiede l’ossidazione del PHMB (libero o complessato) ad Hg(II) inorganico, e la riduzione di questo ad Hg0. Pertanto viene utilizzata una reazione di derivatizzazione on-line post-colonna dei tioli complessati con PHMB mediante bromo, generato in situ a partire da KBrO3/KBr in mezzo acido (HCl) per la conversione veloce

on-line del PHMB ad Hg(II) inorganico con rese del 100% (DS 2%). Hg(II) viene

quindi selettivamente rivelato mediante AFS come Hg0 in seguito a una reazione di riduzione on-line con sodioboroidruro.

Sulla base della ben nota reattività del cloruro mercurio nei confronti dell’atomo di zolfo dei nitrosotioli (reazione 1), abbiamo ipotizzato che il PHMB, come il mercurio tetracloruro, HgCl42- decomponga gli RSNO secondo il seguente schema:

RSNO + PHMB → RS-PHMB + HNO2 (1)

In questo lavoro di tesi si è studiata la reattività della sonda mercuriale (PHMB, HO-Hg-(C6H4)-COO−Na+) nei confronti del GSNO in quanto esso rappresenta il nitrosotiolo a basso peso molecolare maggiormente presente in vivo, dei rispettivi tioli ridotti ed ossidati (GSH e GSSG), che possono potenzialmente dare lo stesso prodotto

di derivatizzazione GS-PHMB, e degli altri nitrosotioli (CysNO, HCysNO, CysGlyNO e la loro specie ossidata) potenzialmente rilevabili come complessi tiolo-PHMB. In primo luogo abbiamo studiato la reazione cinetica tramite le misure UV a 334 nm. In secondo luogo, abbiamo studiato la reattività del PHMB nei confronti del GSNO a concentrazione micromolare attraverso un sistema di rilevazione mercurio-specifico, composto dalla cromatografia in fase inversa (RPLC) dotata sia di rilevatore UV-VIS (DAD) e sia di spettroscopia di fluorescenza atomica con generatore di vapori di mercurio freddi (CVGAFS).214 Sono state effettuate anche misure ESI-MS per verificare i prodotti di reazione e validare l’ipotesi formulata sul meccanismo di reazione della sonda mercuriale . Il sistema DAD-CVGAFS permette di seguire la reazione (1): il rilevatore DAD consente di seguire il decadimento dell’assorbanza a 334 nm dovuto all’assorbimento del GSNO, mentre il sistema CVGAFS consente di rilevare la formazione di GS-PHMB grazie alla rilevazione specifica e sensibile del mercurio in spettroscopia atomica. La quantificazione della frazione di decomposizione di GSNO è stata basata sull’area del picco relativo al complesso GS-PHMB nel cromatogramma RPC-CVGAFS e sull’area del picco del GSNO nel cromatogramma di assorbimento in UV. La reattività del GSNO è stata studiata in funzione di vari parametri (concentrazione di PHMB, pH, temperatura e concentrazione nell'acido ascorbico, presenza di altri tioli ridotti ed ossidati).

Selezionando opportune condizioni di reazione, è stato possibile definire un metodo analitico privo di interferenze che consente la determinazione di GSNO a livelli nM. Il metodo è stato applicato alla determinazione di GSNO nel plasma deproteinizzato di volontari umani sani. Attraverso le analisi delle cinetiche di decomposizione UV a 334 nm, in opportune condizioni definite da un opportuno disegno sperimentale centrato, si è approfondito l’effetto simultaneo della concentrazione del PHMB e della concentrazione di ascorbato sulla decomposizione di CysNO, GSNO, HcysNO, CysGlyNO.

Sulla base dei risultati del disegno sperimentale, sono state definite nuove condizioni di reazione che hanno permesso:

a) di avvalersi di una procedura di decomposizione/determinazione semplificata; b) di determinare simultaneamente CysNO e GSNO con rese del 95 e del 103%

rispettivamente.

Sono stati riportati anche alcuni dati preliminari relativi all’applicazione di questa nuova procedura all’analisi del plasma umano e nel perfusato di cuore di ratto.

4.1 LA TECNICA DI GENERAZIONE DI VAPORI FREDDI DI

MERCURIO ACCOPPIATA ALLA SPETTROMETRIA DI

FLUORESCENZA ATOMICA NON DISPERSIVA CON

ATOMIZZAZIONE IN FIAMMA MINIATURIZZATA Ar/H

4.1.1 La generazione di vapori freddi di mercurio

La generazione di vapori freddi di mercurio, accoppiata alla spettroscopia atomica, rappresenta uno dei più importanti e sensibili metodi analitici per la determinazione di mercurio in campioni reali. Nei primi studi proposti per la determinazione del mercurio mediante tecniche di spettroscopia atomica, erano utilizzate fiamme supportate su sistemi nebulizzatore-atomizzatore per l’atomizzazione del mercurio stesso. La sensibilità di tale metodo, avendo un limite di rivelabilità di circa 100 ng/mL, era insufficiente per l’analisi in campioni ambientali e biologici.

In linea di principio, poiché il mercurio elementare ha un’apprezzabile tensione di vapore anche a temperatura ambiente e il vapore è monoatomico, non è necessaria una fiamma per ottenere atomi liberi nel caso in cui il mercurio, nel campione da analizzare, possa essere convertito allo stato elementare.166 É tuttavia importante sottolineare che in presenza di matrici particolari, quali soluzioni di urea 8 M, l’uso di una fiamma miniaturizzata Ar/H2 può risultare vantaggiosa non tanto per l’atomizzazione del mercurio, quanto per l’abbattimento di eventuali sostanze interferenti.

La tecnica di generazione di vapori freddi (cold vapor, CV) consiste di due fasi:

1) Hg(II) presente in soluzione acida viene ridotto a mercurio elementare (Hg0), volatile, e passa dalla fase liquida alla fase gassosa;

2) Hg0 liberato è trasferito per mezzo di un gas di trasporto inerte al sistema di rivelazione, oppure può essere manipolato in vari modi (ad esempio, può essere accumulato per attuare una preconcentrazione).

Bisogna sottolineare che, in generale, solo il mercurio inorganico è in grado di generare Hg0 volatile. Pertanto, tutti i composti organici del mercurio necessitano di una fase preliminare di mineralizzazione che sia in grado di convertirli a mercurio inorganico, prima di essere sottoposti alla fase di riduzione.

4.1.2 Formazione e rilascio di Hg

La conversione dell’Hg(II) in soluzione ad Hg0 viene realizzata mediante una reazione in fase liquida con un idoneo riducente, come SnCl2,167 o NaBH4.168,169 Le reazioni di riduzione possono essere così schematizzate:

Hg(II) + Sn(II) Hg0 + Sn(IV)

HgII + 2BH4- + 6H2O Hg0 + 7H2 + 2H3BO3

Attualmente il sistema boroidruro/acido è quello più impiegato poiché fornisce rese di riduzione più elevate,170,171 tempi di reazione più rapidi e minore contaminazione del reattivo. La reazione è condotta miscelando il campione acido, per acido cloridrico, con la soluzione acquosa di boroidruro (stabilizzata con NaOH). L’agente riducente è sempre impiegato in eccesso di molti ordini di grandezza rispetto all’analita. Nella riduzione in ambiente acido con boroidruro, l’eccesso di riducente è decomposto a idrogeno, il quale favorisce lo stripping di Hg0 dalla miscela di reazione supportando la funzione del gas di trasporto secondo la reazione:

BH4¯ + H+ + 3H2O H3BO3 + 4H2

Numerosi parametri influenzano l’efficienza di generazione di Hg0, e devono essere considerati nella valutazione delle prestazioni e nell’ottimizzazione di un certo sistema di generazione. Tra questi la concentrazione dell’acido e del riducente sono di primaria importanza.

4.1.3 Trasferimento di Hg

Il mercurio atomico rilasciato dalla soluzione di reazione è trasferito all’atomizzatore con un gas di trasporto inerte. Le perdite di analita per adsorbimento sulle superfici di vetro o di materiale plastico durante il trasferimento possono essere notevoli. Questo pregiudica l’efficienza di trasporto e quindi la sensibilità e la riproducibilità delle misure. Per evitare o ridurre le perdite, è stato proposto l’utilizzo di materiali inerti (vetro silanizzato, quarzo, teflon).172 Allo stesso scopo si può limitare l’interazione con

la superficie mediante l’impiego di opportuni flussi di gas di trasporto che consentano l’ottenimento di velocità lineari al di sopra di una soglia critica.

Il flusso del gas di trasporto deve, tuttavia, essere ottimizzato perché flussi troppo alti provocano trascinamento di spray (derivato dalla reazione effervescente tra acido e boroidruro) e successiva condensazione nella linea di trasferimento. Le minute goccioline comportano ulteriori perdite di analita e l’insorgenza di problemi di

scattering. Allo scopo di evitare questi fenomeni possono essere utili dispositivi

particolari, quali tubi essiccanti o membrane igroscopiche.

4.1.4 Sistemi di generazione del mercurio elementare

Esistono tre metodi principali di generazione del mercurio elementare: metodo discontinuo o discreto (citato anche come “batch”); metodo flow-injection; metodo in continuo; tra questi gli ultimi due sono oggi i più utilizzati.

Nel sistema “flow-injection” si miscelano in continuo un flusso costante di soluzione riducente, di bianco e del gas di trasporto. Impiegando una valvola dosatrice a sei vie, a un certo istante, si inietta nella linea di flusso del bianco un volume esattamente noto (0.1-0.5 mL) del campione. Una rappresentazione schematica del generatore di vapori freddi di mercurio con tecnica flow-injection è riportata in Figura 4.2.

Il sistema di “flow-injection” richiede l’ottimizzazione del volume iniettato e di molteplici parametri comuni al sistema a flusso continuo (dimensione dei tubi di trasferimento, flusso del gas di trasporto, disegno del separatore gas-liquido), ma consente di ottenere limiti di rivelabilità migliori degli altri sistemi di generazione, oltre a presentare un’elevata resistenza a fenomeni di interferenza. Si ottengono segnali transienti, ma con buona riproducibilità (deviazione standard relativa migliore del 1%, con un numero di prove pari a 5).

L’uso del sistema a flusso continuo è attualmente il metodo più impiegato per la generazione di vapori freddi di mercurio. La Figura 4.3 rappresenta lo schema generale di un generatore a flusso continuo. In esso sono evidenziati i componenti più importati comuni ai sistemi disponibili commercialmente e ai più numerosi apparati realizzati da ciascun laboratorio.

Figura 4.2: Rappresentazione schematica del generatore di vapori freddi di mercurio mediante tecnica flow-injection

Figura 4.3: Rappresentazione schematica di un generatore di vapori freddi di mercurio in continuo

Una descrizione completa delle caratteristiche e del funzionamento del sistema saranno forniti nella parte sperimentale. Un flusso costante di soluzione del campione (o del bianco) è miscelato con un flusso costante della soluzione del riducente e del gas di trasporto, che contribuisce allo stripping del mercurio volatile dalla miscela di reazione. Il separatore gas-liquido permette il trasferimento del vapore e degli altri gas all’atomizzatore, mentre la miscela di reazione è inviata allo scarico. Il sistema continuo fornisce segnali stazionari con riproducibilità paragonabili a quelle del sistema

flow-injection (RSD 1%, n=5). Il vapore freddo di mercurio, una volta generato con i

metodi descritti viene trasferito direttamente all’atomizzatore con rivelazione in tempo reale.

4.2 Metodi di rivelazione per il mercurio

Il mercurio atomico, ottenuto per riduzione mediante la tecnica CVG, è

convenientemente rivelato e quantificato on-line, mediante tecniche di spettrometria atomica quali AAS, AES, ICP-MS e AFS. La tecnica mediante fluorescenza atomica sfrutta la fluorescenza di risonanza a 253.7 nm ed è particolarmente sensibile al

mercurio. Quantità assolute dell’ordine di 1 pg possono essere rivelate agevolmente con semplici sistemi in grado di fornire limiti di rivelabiltà dell’ordine di 0.02 pg. Inoltre la tecnica AFS presenta un alto intervallo di linearità; sono infatti normalmente ottenibili curve di calibrazione lineari su cinque-sei decadi di concentrazione. Tali prestazioni sono ottenibili con semplici sistemi di tipo non-dispersivo; per questo motivo esistono oggi in commercio rivelatori AFS dedicati alla determinazione del mercurio.

I problemi presentati dall’uso di rivelatori di tipo AFS e dovuti a fenomeni di

quenching e scattering saranno trattati nelle sezioni dedicate ai fenomeni di interferenza.

4.2.1 Problemi di interferenza nella tecnica CVG-AFS

Le interferenze riportate nella determinazione del mercurio mediante CVG-AFS possono essere suddivise in interferenze che si producono in fase liquida, durante il processo di riduzione, e in interferenze che si manifestano in fase gassosa durante il processo di rivelazione.

4.2.2 Interferenze in fase liquida

Ioni di metalli di transizione presenti nel campione, possono interferire già a concentrazioni di poche parti per milione. Sono state riportate in letteratura interferenze depressive di metalli nobili come Au, Pt, Pd e Ag.173,174 Alcune sostanze che producono complessi molto stabili con gli ioni mercurio (bromuri, 175 ioduri, 176 cisteina,176 tiosolfato,176 solfuri176 e Se(IV) 176,177), interferiscono con la riduzione di tali ioni alla forma elementare, se i complessi non vengono decomposti prima del processo di riduzione. La gravità dei fenomeni di interferenza dipende dal tipo di riducente usato, per cui è conveniente usare SnCl2 o NaBH4 a seconda del tipo di campione in esame.

4.2.3 Interferenze in fase gassosa

Le interferenze in fase gassosa sono rappresentate principalmente da processi di

quenching sulla fluorescenza del mercurio. Sebbene Hg0 sia essenzialmente inerte nei confronti dell’ossigeno a temperatura ambiente, l’ingresso di tale gas nella zona di rivelazione porta a fenomeni di quenching e quindi a un abbattimento della radiazione di fluorescenza. Gli atomi di mercurio eccitati per radiazione si diseccitano per via collisionale in presenza di molecole biatomiche o poliatomiche. Le rese quantiche più alte si hanno operando in atmosfera di gas inerte monoatomico (elio o argon), mentre, operando in atmosfera di gas quali idrogeno od ossigeno, l’effetto di quenching può essere valutato nell’ordine di centinaia-migliaia di volte.178 Per evitare l’ingresso di gas atmosferici (essenzialmente azoto e ossigeno) nella zona di rivelazione, si opera in presenza di schermi gassosi di argon oppure si racchiude la zona di rivelazione in una camera operante in atmosfera inerte (generalmente argon).178,179 In alternativa può essere utilizzata una fiamma miniaturizzata Ar/H2.

4.3 METODI PER LA DIGESTIONE DEL MERCURIO ORGANICO. LA

MISCELA BrO3

_¯

/Br

_¯

Il requisito essenziale per la determinazione del mercurio mediante CV-AFS è la sua presenza nel campione come Hg(II) che poi deve essere ridotto ad Hg0 per mezzo del riducente. I composti organici del mercurio (come anche il PHMB), tranne qualche raro caso,180 non possono essere ridotti ad Hg0 dai comuni agenti impiegati, (quali SnCl2 e NaBH4), e devono essere sottoposti a un trattamento di mineralizzazione preliminare all’analisi.

Il processo di digestione, in generale, deve rispondere ad alcuni requisiti fondamentali: garanzia di una sufficiente ossidazione della matrice organica per liberare l'analita dai suoi legami chimici;

stabilità delle soluzioni dei reattivi e dei prodotti di reazione nel tempo, compatibile con le tecniche di determinazione utilizzate;

generazione quantitativa di un'unica specie labile dell'analita stesso, che possa poi essere facilmente ridotta per la determinazione spettrofotometrica.

Data l’alta tensione di vapore di Hg0, nel caso del mercurio in particolare, devono essere minimizzati i rischi di perdita dovuti alla sua volatilità.

Inoltre, soprattutto se la digestione dei campioni deve avvenire in linea tra un sistema di separazione e il sistema di rivelazione, si richiedono tempi rapidi di reazione.

Sono state studiate in letteratura diverse tecniche di digestione del mercurio organico, che si differenziano sia per la miscela di reagenti di attacco, sia per la temperatura richiesta, sia per i tempi di reazione.

Come agenti ossidanti sono stati sperimentati sia acidi forti e loro miscele, sia, nelle opportune condizioni e combinazioni, reagenti come KMnO4, H2O2, K2S2O8, KBrO3/KBr. In alcuni casi viene effettuata una irradiazione UV o un trattamento con microonde.

L’uso della miscela di BrO3¯/Br¯, in cui l'aggiunta di HCl determina la formazione di

bromo direttamente in situ, è stato proposto per la prima volta da Farey et al.181 per la determinazione di diversi composti di mercurio organico in campioni reali di acqua mediante CV-AFS, ottenendo recuperi di oltre il 95%. Anche altri Autori in seguito hanno sperimentato questo metodo di digestione per la determinazione off-line di mercurio in urine182 e in campioni ambientali, confermandone l'efficacia.

Il bromo distrugge rapidamente i legami del mercurio nella matrice organica, e Hg(II) è inoltre convertito nel complesso HgBr42¯, estremamente stabile, secondo la reazione:

R-Hg+ _{+ 3Br¯ + Br}2 R-Br + HgBr42¯

Poiché dalla reazione si genera bromo, questa deve essere eseguita seguendo le opportune norme di sicurezza. Per la rapidità con cui si realizza il processo ossidativo, questa procedura è particolarmente indicata per applicazioni on-line. Anche in questo caso sono necessarie quantità appropriate di NH2OH o idrazina per distruggere il bromo in eccesso prima che il campione passi al successivo stadio di riduzione.

È stato infatti dimostrato che, qualora il bromo raggiunga il detector, si verifica una riduzione del picco AFS, dovuta con molta probabilità al quenching prodotto dalla molecola biatomica di bromo.169,183 Questo si verifica sia aumentando la concentrazione della miscela bromato/bromuro (che porta a maggior sviluppo di bromo), sia aumentando la concentrazione della soluzione di NH2OH o idrazina che, aumentando la viscosità della fase liquida, impedisce un opportuno mescolamento per la completa riduzione del bromo.