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Capitolo 3: Conclusioni
In questa tesi è stata studiata l’immobilizzazione dell’enzima MAO-A mediante legame non covalente su un supporto cromatografico contenente una membrana artificiale, impaccato in una colonna per HPLC. La resa di immobilizzazione è stata determinata mediante misure spettrofotometriche.
Le proprietà catalitiche del bioreattore così ottenuto sono state quindi valutate utilizzando un saggio standard per l’attività di questo enzima, che consiste nella deamminazione ossidativa della chinuramina.
Per seguire la conversione nelle prove catalitiche è stato messo a punto un metodo cromatografico che ha permesso la determinazione rapida della concentrazione del substrato e del prodotto mediante HPLC con rivelatore UV/VIS e fluorimetrico.
E’ stata valutata la stabilità dell’enzima nel tempo ed è stato osservato che l’enzima immobilizzato risulta più stabile rispetto all’enzima in soluzione, permettendo l’uso ripetuto dello stesso campione di enzima per numerose prove catalitiche.
E’ stato studiato l’andamento cinetico nel saggio standard e sono stati determinati quantitativamente i parametri cinetici sia per l’enzima libero che per l’enzima immobilizzato; dal confronto dei dati ottenuti è risultato un andamento in accordo con quanto già riportato per enzimi supportati sullo stesso tipo di fase stazionaria.
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ossidativa dell’adrenalina sia in forma racema che in forma enantiomericamente pura; sono state valutate sia la variazione di substrato nel tempo che la velocità in funzione della concentrazione di substrato. I dati sono stati confrontati con quanto ottenuto nella stessa reazione con l’enzima libero.
Infine è stato messo a punto un sistema accoppiato bioreattore-rivelatore fluorimetrico per la valutazione “on line” di fenomeni di inibizione dell’enzima MAO-A in presenza di composti di varia struttura. I risultati ottenuti hanno confermato che con questo sistema è possibile valutare l’attività inibitoria, anche quantitativamente, utilizzando lo stesso campione di enzima e che tale strategia può essere applicata allo “screening” di composti con proprietà di substrato/inibitore in miscele complesse.
