Le osservazioni che hanno permesso di dare inizio a questo studio derivano dai risultati ottenuti in un precedente lavoro (Maggi et al., 2005), nel quale venivano esaminate le conseguenze dell’immunizzazione attiva sulla carica virale di TTV. I soggetti sottoposti a questo studio furono infatti vaccinati contro il virus dell’influenza e contro il virus dell’epatite B (HBV) per valutare se l’immunostimolazione potesse rappresentare un possibile meccanismo di attivazione della replicazione di TTV.
Le analisi dimostrarono che, in seguito alla vaccinazione, l’aumento della carica di TTV era in generale relativamente modesto ma più spiccato nei soggetti persistentemente infettati con il genogruppo 3 e immunizzati contro il virus dell’epatite B.
Valutando i risultati ottenuti, fu però riscontrato un significativo incremento della carica di TTV a seguito della vaccinazione contro HBV in uno degli individui in esame, incremento che era notevolmente maggiore rispetto agli altri soggetti e che quindi meritava di essere indagato più in dettaglio.
Oggetto di questo lavoro di tesi è stato quindi lo studio dell’andamento dell’infezione da TTV nel soggetto MON.
Come descritto nella sezione Materiali e Metodi, MON è stato monitorato a vari intervalli di tempo dopo le vaccinazioni contro epatite B ed influenza. Al giorno 0 è stato somministrato il vaccino anti - HBV e dopo 3, 7, 15, 30, 37, 45, 60 e 90 giorni è stato prelevato il sangue su cui valutare la presenza e la quantità di TTV. Al giorno 240 è stato somministrato il vaccino contro l’influenza ed il sangue è stato prelevato dopo gli stessi intervalli di tempo.
Le analisi sono state effettuate sia su plasma che su cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e la quantificazione della carica di TTV per tutti i campioni a disposizione è avvenuta utilizzando la real-time PCR, metodica quantitativa e “universale” perché in grado di amplificare con uguale efficienza tutti gli isolati di TTV ad oggi conosciuti. Come si evinceva dalle indagini quantitative molecolari, MON manifestava, al trentesimo giorno dopo la vaccinazione contro il virus dell’epatite B, un incremento della carica plasmatica di TTV di ben 3.75 logaritmi; ciò avveniva in concomitanza con lo sviluppo di una sintomatologia aspecifica simil-influenzale caratterizzata da tosse, raffreddore e malessere generale.
portava la carica di TTV prima a livelli inferiori e poi agli stessi valori di quelli osservati prima della vaccinazione (5.5 x 106 copie di DNA per ml).
La carica virale rimaneva poi stabile durante tutto il successivo periodo di osservazione, nonostante una seconda immunizzazione, al giorno 240, con il vaccino contro l’influenza.
La quantificazione della carica di TTV è stata effettuata anche nei PBMC, per valutare se a cambiamenti della viremia plasmatica corrispondessero simili variazioni a livello cellulare. I risultati ottenuti hanno dimostrato l’assenza di significative fluttuazioni della carica di TTV nei PBMC durante tutto il periodo di osservazione (fig. III.1).
0, 0 1, 0 2, 0 3, 0 4, 0 5, 0 6, 0 7, 0 8, 0 9, 0 10, 0 0 3 7 15 30 37 45 60 90 240 24 3 247 255 27 0 277 285 30 0 330
T
em
p
o
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i)
Cari
ca
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le
(lo
g
10cop
ie/
ml)
TTV n el p la sm a TTV n ei P B M C Vaccino HB V Figura III.1:Andamento nel tempo dei titoli di TTV nel plasma e nei PBMC del soggetto MON.
Vaccino influenz
SOGGETTO MON
2.1 IDENTIFICAZIONE E ANDAMENTO NEL
TEMPO DEI GENOGRUPPI DI TTV
Per cercare di spiegare i dati osservati, i campioni ottenuti da MON sono stati analizzati in modo più approfondito.
Per prima cosa si è cercato di identificare quali genogruppi di TTV fossero presenti nel plasma del soggetto alle diverse date. Questo studio è stato condotto utilizzando PCR gruppo-specifiche, realizzate grazie all’uso di primers appositamente disegnati per l’amplificazione selettiva dei 5 principali gruppi di TTV. Per i genogruppi 1, 2 e 3 la reazione di amplificazione ha come bersaglio regioni del gene ORF1, mentre per i genogruppi 4 e 5 sono stati disegnati primers dedotti dalla UTR (tab. II.1).
La classificazione degli isolati di TTV ottenuta mediante la PCR è stata sempre confermata dal successivo sequenziamento del prodotto amplificato (Maggi et. al., 2005a).
La tipizzazione dei campioni ottenuti dal plasma di MON prima e dopo la vaccinazione ha permesso quindi l’identificazione dei genogruppi virali presenti e la valutazione del loro andamento nel tempo.
Prima della vaccinazione contro il virus dell’epatite B, MON risultava infettata con tre diversi genogruppi di TTV: genogruppi 1, 3 e 4. Il sequenziamento degli amplificati ottenuti e l’allineamento delle sequenze con quelle omologhe presenti in banca dati hanno dimostrato, più in dettaglio, che il soggetto era infettato con:
•
il genotipo 6 appartenente al genogruppo 1 (80% di identità nucleotidica) ( fig. III.2)•
il genotipo 27 appartenente al genogruppo 3 (79% di identità nucleotidica) (fig. III.3)•
il genotipo 21 appartenente al genogruppo 4 (97% di identità nucleotidica) (fig. III.4).Figura III.2: Albero filogenetico costruito per il genogruppo 1 di TTV.
Figura III.3: Albero filogenetico costruito per il genogruppo 3 di TTV.
Figura III.4: Albero filogenetico costruito per il genogruppo 4 di TTV.
Le reazioni di PCR genogruppo – specifiche, effettuate sui campioni di sangue a disposizione, hanno dimostrato un andamento pressoché costante nel tempo della presenza dei tre genogruppi identificati (tab. III.1).
Mentre infatti i genogruppi 2 e 5 erano assenti nel plasma del soggetto a tutte le date analizzate, i genogruppi 1, 3 e 4 erano sempre presenti, eccetto che per occasionali e brevi periodi di negativizzazione dell’uno o dell’altro genogruppo. Non è stato infatti possibile rilevare il genogruppo 1 nel plasma di MON nei campioni prelevati dopo 45 e 60 giorni dal vaccino contro HBV, né 60 giorni dopo il vaccino contro l’influenza.
Il genogruppo 3 era invece assente dal plasma per due mesi e mezzo a cavallo del picco nella carica virale osservato al giorno 30, mentre il genogruppo 4 era sempre presente, ad eccezione del novantesimo giorno dopo la vaccinazione per l’epatite B. Questi cambiamenti rispecchiano probabilmente solo variazioni nelle rispettive cariche virali e vanno valutate considerando che la metodica di PCR utilizzata ha un limite inferiore di sensibilità di circa 4000 copie/ml, al di sotto delle quali risulta impossibile individuare la presenza di un particolare genogruppo.
PBMC: è stato così possibile dimostrare la presenza, anche in questo distretto, degli stessi isolati di TTV già identificati nel plasma.
Nei PBMC lo studio dell’andamento nel tempo dei vari genogruppi rispecchiava solo in parte quello osservato nel plasma: in particolare, l’assenza del genotipo 27 (gruppo 3) prima e dopo il picco osservato al giorno 30 durava meno rispetto a quanto riscontrato nel plasma (tabella III.1).
Genogruppo di TTV a Giorni dopo la vaccinazione 1 2 3 4 5 0 + / + b - / - + / + + / + - / - 7 + / + - / - + / + + / + - / - 15 + / + - / - - / + + / + - / - 30 + / + - / - - / + + / + - / - 45 - / + - / - - / - + / + - / - 60 - / + - / - - / - + / + - / - 90 + / + - / - - / + - / + - / - 240 + / + - / - + / + + / + - / - 247 + / + - / - + / + + / + / -255 + / + - / - + / + + / + - / - 270 + / + - / - + / + + / + - / - 285 + / + - / - + / + + / + / -300 - / + - / - + / + + / + - / - 330 - / + - / - + / + + / + - / -
Tabella III.1: Genogruppi di TTV identificati nel plasma e nei PBMC del soggetto MON a diversi giorni dopo la vaccinazione contro HBV (giorno 0) e influenza (giorno 240).
a Tutti i campioni sono stati esaminati in doppio mediante PCR
genogruppo specifiche.
Le analisi molecolari condotte per identificare i genogruppi di TTV presenti in MON, essendo di tipo qualitativo, non hanno permesso la quantificazione della carica virale dei singoli genogruppi. Ciò appariva invece molto importante per spiegare l’incremento della carica totale di TTV osservato al trentesimo giorno dopo la vaccinazione contro HBV e per capire se esso poteva essere attribuito all’aumento della viremia di uno o più dei genotipi di TTV presenti nel soggetto. A questo scopo sono state effettuate delle analisi semiquantitative, utilizzando diluizioni scalari del plasma di MON prima e intorno al picco del giorno 30. I campioni di plasma al tempo 0, 15, 30, 45 e 60 sono stati diluiti in rapporti scalari da 1:10 fino a 1:100.000 con soluzione salina sterile. Ciascuna diluizione è stata poi estratta e sottoposta in quadruplo alle reazioni di genotipizzazione. Le reazioni di PCR sono state effettuate solo per i genogruppi 1 e 4 dal momento che il genogruppo 3 si era rivelato assente proprio durante quello specifico intervallo di tempo; i genogruppi 2 e 5 non sono stati presi in considerazione data la loro assenza nel plasma di MON durante tutto il periodo di osservazione.
Le analisi semiquantitative ci hanno permesso di valutare l’andamento nel tempo della viremia dei singoli genogruppi di TTV e di verificarne l’eventuale incremento.
Dai risultati ottenuti è emerso che la carica del genotipo 6 (gruppo 1) era aumentata, durante il periodo analizzato, solo di un logaritmo, mentre quella del genotipo 21 (gruppo 4) era rimasta pressoché invariata ( fig. III.5).
Questi dati hanno quindi dimostrato che il picco nella carica virale totale, osservato trenta giorni dopo la prima vaccinazione, non poteva essere attribuito a un incremento nella carica di uno dei genogruppi di TTV già presente in MON.
10-5
Diluizioni del plasma di MON
10-4 10-3 TTV gruppo 1 TTV gruppo 4 10-2 10-1 100 0 15 30 45 60 Giorni
Figura III.5: Risultato delle analisi semiquantitative per i gruppi 1 e 4 di TTV effettuate sui campioni di plasma a diverse date.
Gruppo 1 e 4 di TTV nel plasma di MON alla diluizione: Giorno 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 0 ++++ ++++ +++- ++++ ---- ---- ---- ---- ---- ---- 15 ++++ ++++ +++- ++++ ---- ---- ---- ---- ---- ---- 30 ++++ ++++ ++++ +++- ++-- ---- ---- ---- ---- ---- 45 ---- ++++ ---- +++- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 60 ---- ++++ ---- ++-- ---- ---- ---- ---- ---- ---- Tabella III.2: Risultati delle reazioni di PCR effettuate in quadruplo sulle diluizioni del plasma di MON a diverse date per i genogruppi 1 e 4.
2.3 STUDIO DEL TTV LEGATO AD ANTICORPI
TIPO IgG
I campioni del plasma di MON a tutte le date disponibili sono stati anche analizzati, tramite immunoprecipitazione, per esaminare se il virus fosse o meno associato ad immunocomplessi ( Itoh et al., 2000).
La metodica, descritta nella sezione II, ha permesso di quantificare sia la percentuale di virus legato agli anticorpi che quella di virus libero durante tutto il periodo di osservazione.
I dati ottenuti hanno mostrato che, prima della vaccinazione contro HBV, la percentuale di TTV immunocomplessato era compresa tra l’8 e il 10%; al momento del picco nella carica virale totale, la percentuale scendeva allo 0.3%, per poi risalire a livelli intorno al 4% al sessantesimo giorno dalla vaccinazione. Nelle date successive i livelli di virus immunocomplessato si stabilizzavano intorno al 4-5% (fig. III.6).
Questi risultati dimostrano che, al trentesimo giorno dalla vaccinazione, la maggior parte del TTV infettante MON era virus libero, non legato ad anticorpi.
dovuto a una transitoria superinfezione da parte di un nuovo isolato del virus, nei confronti del quale il soggetto era sprovvisto di anticorpi. 0 2 4 6 8 10 12 0 15 30 45 60 240 330 Tempo (giorni) T T V i m mu no co mp le ss at o ( % )
Vaccino HBV Vaccino influenza
Figura III.6: Andamento nel tempo della percentuale di TTV immunocomplessato.
3. IDENTIFICAZIONE DI UN NUOVO
ISOLATO DI TTV
Tutti i risultati fin qui ottenuti suggerivano che la causa dell’incremento della carica virale, osservato al trentesimo giorno, potesse essere attribuibile ad una transitoria superinfezione da parte di un nuovo isolato di TTV.
Le analisi condotte avevano infatti dimostrato che:
¾ A trenta giorni dalla vaccinazione, la carica totale di TTV aumentava significativamente;
¾ Questo incremento non era dovuto all’aumento della viremia di uno dei tre isolati di TTV già presenti nel soggetto;
¾ Al momento del picco, la percentuale di TTV libero, non immunocomplessato, aumentava sensibilmente.
La spiegazione di queste osservazioni poteva essere che il soggetto fosse stato infettato da un nuovo isolato di TTV, amplificato dalla PCR universale, ma non dalle PCR gruppo-specifiche.
poi sequenziato il TTV dominante nel plasma al momento del picco, utilizzando primers appositamente costruiti per questo scopo.
L’isolato è stato amplificato utilizzando i primers CLONS, P1AS, UNIVS e P3AS in una prima reazione di PCR e successivamente i primers MONS1, MONAS2, MONS3 e MONAS4.
Il sequenziamento dell’amplificato ottenuto è stato condotto inizialmente utilizzando i primers UNIVS e P3AS, grazie ai quali sono stati sequenziati i primi circa 400 nucleotidi a partire dal sito di innesco di ciascuno dei due primers. Successivamente sono stati studiati e costruiti altri primers che hanno permesso, con la tecnica del chromosome walking, di completare la parte di genoma compresa tra i siti iniziali di appaiamento di UNIVS e P3AS. La parte rimanente del genoma, comprendente anche il tratto ricco in dinucleotidi GC, è stata infine sequenziata tramite PCR inversa. I primers utilizzati per il sequenziamento del nuovo isolato di TTV sono riportati in tabella III.3.
Primer Sequenza (5'-3') Posizione (nt)a UNIVS TCAAGGGGCAATTCGGGCT 205-223 P3AS CTTACGCTCGGAGTGCTTAGTG 3063-3083 MONSEQ1 CTGGAGATGGTGGTGGAGACGC 617-638 MONSEQ2 GCTTTCTTCTTCTGAGGTTTGCC 2626-2648 MONSEQ3 AAAGACACTCAAATAACAAG 1149-1168 MONSEQ4 AAATCTAAAGACTATGGGT 2174-2192 MONS3 GACTGGAAAGAGGAACAGGATG 2870-2891 MONAS4 TTGGGAGCGGGCAGAGCGGG 550-569 MONS5 CGTCACGGCAGCCATTTTA 3407-3425 MONAS6 TACAGCCCAGGAAATGAATC 54-73
Tabella III.3: Primers utilizzati nel sequenziamento dell’isolato ViPi04 di MON.
a La posizione nucleotidica si riferisce all’isolato ViPi04
I risultati ottenuti hanno dunque confermato la presenza di una superinfezione da parte di un nuovo isolato di TTV.
L’inserimento in banca dati della sequenza ottenuta e l’allineamento con le altre sequenze hanno infatti dimostrato che il soggetto era stato infettato da un genotipo di TTV fino a quel momento sconosciuto.
Questo isolato apparteneva al gruppo 2 di TTV, ma differiva del 35-39% a livello nucleotidico dagli altri virus appartenenti allo stesso gruppo (tab. III.4).
Il nuovo genotipo identificato è stato denominato ViPi04 e rappresenta il primo membro di un nuovo e distinto genotipo
un’organizzazione genetica – lunghezza dell’UTR, presenza di motivi conservati, numero di ORF – simile a quella riportata per gli altri genotipi del gruppo 2 (Hallett et al., 2000).
Identità genetica con l’isolato ViPi04 Genogruppo N° di isolati esaminati Media Range 1 31 0,49 0,35 – 0,54 2 10 0,63 0,61 – 0,66 3 29 0,43 0,39 – 0,49 4 13 0,45 0,44 – 0,46 5 16 0,51 0,43 – 0,54
Tabella III.4: Media e range dell’identità genetica tra l’isolato ViPi04 (3774 nucleotidi) e 99 isolati classificati nei genogruppi 1-5 di TTV.
Figura III.7: Albero filogenetico di TTV. In rosso è riportata la posizione del nuovo isolato ViPi04. L’albero è stato disegnato utilizzando il programma Treeview (versione 1.6.6). I numeri intorno all’albero indicano i genogruppi di TTV. In tabella è descritta l’identità genetica fra ViPi04 e gli altri isolati di
2 - SPECIFICA
Tenendo conto della nuova sequenza identificata, è stato a questo punto possibile, mediante lo studio di nuovi primers, realizzare una nuova reazione di PCR per il genogruppo 2 (tab. III.5).
I primers sono stati costruiti in modo tale che la PCR potesse amplificare, con la stessa efficienza, sia il nuovo isolato ViPi04 che gli altri genotipi appartenenti allo stesso gruppo.
Primer Sequenza (5'-3') Posizione (nt)a
G2new1 TAGACGCCCCAGAGTAAGGAGA 719-740
G2new2 AGTTTTGTTGGTGAAATATGC 2206-2226
G2tth2 GTGAAATAGGCAGATGTACCA 2196-2216
G2new3 CCTGCGGTTTCCGTTCTG 1361-1378 Tabella III.5: Primers costruiti sulla base dell’isolato ViPi04 e
utilizzati nelle PCR specifiche per il genogruppo 2. Nel primo step sono utilizzati G2new1, G2new2 e G2tth2, nel secondo step G2new2, G2new3 e G2tth2.
Tutti i campioni di plasma di MON sono stati quindi ritestati, utilizzando i nuovi primers appositamente costruiti sulla base della sequenza ViPi04: l’unico campione di plasma positivo è risultato essere quello al picco del giorno 30 (tab. III.6).
Questi risultati indicano perciò che, al trentesimo giorno dopo la vaccinazione, il soggetto era stato infettato con il nuovo isolato di TTV e che quest’ultimo persisteva solo per brevissimo tempo nel sangue dell’individuo.
La stessa reazione di PCR è stata utilizzata anche per riesaminare i PBMC di MON a tutte le date disponibili.
Anche in questo caso il campione prelevato al giorno 30 risultava positivo per la presenza dell’isolato ViPi04, che tuttavia appariva essere presente anche nei campioni di PBMC prelevati al giorno 45 e 60.
Questi dati indicano quindi che il virus è in grado di persistere nelle cellule mononucleate più a lungo rispetto al sangue.
Giorni dopo la
vaccinazione b
Risultato della ricerca dell’isolato ViPi04 0 - / - c 7 - / - 15 - / - 30 + / + 45 - / + 60 - / + 90 - / - 240 - / - 247 / -255 - / - 270 / -285 - / - 300 / -330 - / -
Tabella III.6: Isolato ViPi04 di TTV identificato attraverso la nuova PCR gruppo-specifica nel plasma e PBMC del soggetto MON a diversi giorni dopo le vaccinazioni
Analisi semiquantitative sono state condotte per verificare che, al giorno trenta, la carica dell’isolato ViPi04 eccedesse quella dei genogruppi 1 e 4 di TTV.
I campioni di plasma al giorno 30 sono stati quindi diluiti con acqua salina sterile in rapporti scalari fino a 1:100.000, estratti e sottoposti a PCR per i gruppi 1, 4 e 2 utilizzando, in quest’ultimo caso, i primers specifici per il ceppo ViPi04 presente in MON. Dai risultati ottenuti è emerso che l’isolato ViPi04 era riscontrabile fino alla diluizione 1:10.000, eccedendo di un logaritmo la carica del genotipo 6 (gruppo 1) e di ben due logaritmi quella del genotipo 21 (gruppo 4).
Le stesse analisi semiquantitative sono state effettuate anche sui campioni di plasma al giorno 30 dopo immunoprecipitazione con IgG. I risultati hanno evidenziato che il nuovo genotipo di TTV risultava immunocomplessato ad anticorpi di tipo IgG così come il genogruppo 4, mentre il gruppo 1 risultava essere presente solo in forma libera (fig. III.8, tab. III.7). Con analisi più approfondite, è stato però possibile stabilire che la percentuale dell’isolato ViPi04 immunocomplessato era molto bassa rispetto alla carica totale del virus infettante e corrispondeva a meno dell’1%.
Viremia IC
TTV gruppo 1 TTV ViPi04 TTV gruppo 4
Diluizioni del plasma di MON
25 10-5 20 10-4 15 10-3 10 10-2 5 10-1 0 100 Giorno 30
Figura III.8: Risultati delle analisi semiquantitative effettuate sul plasma di MON al giorno 30.
DNA di TTV rivelato nel plasma al giorno 30 diluizione Genogruppo Non diluito 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1 + / - a + / - + / - + / - - / - - / - 4 + / + + / + + / - - / - - / - - / - ViPi04 b + / + + / + + / + + / - + / - - / -
Tabella III.7: Quantificazione di TTV dopo diluizioni del plasma al giorno 30 del soggetto MON esaminato con specifici protocolli di tipizzazione.
a TTV totale / TTV immunocomplessato con IgG
b La determinazione è stata effettuata con la PCR specifica per il
4. PREVALENZA DEL GRUPPO 2 DI TTV
Come ultima analisi, è stata studiata la prevalenza del gruppo 2 di TTV nella popolazione generale, utilizzando i nuovi primers disegnati sulla base della sequenza del ceppo ViPi04. A tale proposito è stato analizzato il plasma di 48 pazienti adulti, scelti tra sani e portatori di varie malattie reumatiche e immunitarie, insieme a plasma e tamponi nasali ottenuti da bambini con gravi malattie respiratorie. Tutti i soggetti erano positivi alla ricerca di TTV.
I risultati hanno evidenziato la presenza di un solo campione positivo, ottenuto da un tampone nasale di un bambino (tab. III.8). Il campione è stato quindi sottoposto a sequenziamento e la sequenza ottenuta, inserita in banca dati, ha mostrato una netta differenza rispetto all’isolato ViPi04 ed una omologia del 98% con l’isolato PMV (Hallett et al., 2000) appartenente sempre al gruppo 2 di TTV.
Questo risultato indica che l’isolato ViPi04 è scarsamente prevalente nella popolazione così come tutti gli altri genotipi appartenenti allo stesso gruppo 2 di TTV.
Gruppo N° campioni esaminati N° positivi (%) Plasma Soggetti adulti a 2002 19 0 (0) 2003 18 0 (0) 2004 11 0 (0) Bambini 14 0 (0) Tamponi nasali Bambini 11 1 (9)
Tabella III.8: Prevalenza del genogruppo 2 di TTV nel plasma di 48 soggetti adulti, raggruppati secondo l’anno di campionamento, e nel plasma e nei tamponi nasali di 25 bambini.
a I soggetti includono 10 pazienti con malattie reumatiche e
