INTRODUZIONE GENERALE

INTRODUZIONE

GENERALE

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1. AMMINE BIOGENE

Le ammine biogene rappresentano una classe eterogenea di composti capaci di esplicare numerosi effetti biologici come ad esempio messaggeri chimici, ormoni, neuromodulatori e neurotrasmettitori. Sono prodotte a partire da amminoacidi aromatici attraverso una decarbossilazione catalizzata da enzimi appartenenti alla famiglia delle decarbossilasi. Le catecolamine quali noradrenalina, dopamina e adrenalina derivano dalla tirosina, mentre la serotonina e l’istamina derivano rispettivamente dal triptofano e dall’istidina.

Nel SNC sono espresse altre ammine biogene indicate come “trace amines” (TAs) a causa della loro bassa concentrazione (0.1-10nM). La classe delle trace-amines include ammine quali la (para- e meta-) tiramina, triptamina, β-feniletilammina, (para- e meta-) octapamina. (Figura 1)

Figura 1. Composti endogeni ed esogeni collegati alle ammine traccia

Gli effetti farmacologici indotti dalle TAs vengono tradizionalmente indicati come “simpatomimetici”. Questi effetti si manifestano generalmente quando soggetti sensibili sottoposti a terapie farmacologiche con inibitori delle monoammino-ossidasi (MAO-inibitori), consumano cibi che contengono elevate concentrazioni di TAs (formaggi stagionati, vino, cioccolato). L’aumento della concentrazione della TAs a livello del SNC può provocare effetti amfetamino-simili quali ad esempio euforia, irritabilità, riduzione dell’appetito, insonnia e tremori. A livello del sistema cardiovascolare, un aumento della concentrazione della TAs provoca tachicardia, ed effetti ipertensivi o ipotensivi (a seconda della concentrazione raggiunta). Sono stati osservati anche altri effetti quali nausea, vomito, aumento o riduzione della resistenza bronchiale e ipertermia.

6 La p-tiramina, la β-PEA e l’octapamina mostrano anche effetti endocrini quali ad esempio l’inibizione della secrezione di prolattina. La β-PEA provoca un aumento dei livelli di ACTH e della produzione di glucocorticoidi, mentre l’octapamina ha mostrato effetti insulino-simili sull’uptake del glucosio negli adipociti, nella muscolatura scheletrica e nel miocardio.

Tutti gli effetti farmacologici citati sono prodotti dalle trace amines a concentrazioni elevate (nell’ordine del micromolare). A concentrazioni submicromolari (che corrispondono alle concentrazioni fisiologiche) le TAs sembrano esplicare un’attività neuromodulatoria influenzando la risposta cellulare a differenti neurotrasmettitori. Ad esempio la β-PEA e la p-tiramina potenziano la risposta indotta da noradrenalina e dopamina, mentre la triptamina potenzia la risposta inibitoria delle cellule alla serotonina. Le TAs esplicano anche effetti inibitori: la β-PEA e la p-tiramina deprimono la risposta inibitoria postsinaptica mediata dai recettori del GABA (GABA B) interferendo con la corrente di ioni potassio (probabilmente a causa di un inibizione di canali al potassio di tipo Kir).

In questi ultimi anni è stato evidenziato anche un ruolo patofisiologico delle TAs nell’eziologia di patologie neurologiche e mentali. Una carenza di β-PEA sembra essere correlata alla depressione mentre una riduzione del suo catabolismo è stato associato alla schizofrenia. Alcuni studi hanno inoltre indicato che la somministrazione di β-PEA a soggetti affetti da Parkinson o da disturbo da deficit di attenzione e iperattività (ADHD) sembra avere effetti benefici.

A livello molecolare gli effetti farmacologici delle TAs è stato tradizionalmente attribuito alla loro abilità di indurre rilascio di noradrenalina dalle terminazioni nervose simpatiche e dalla loro capacità di competere nel legame al sito attivo dei recettori adrenergici e serotoninergici, a livello dei trasportatori delle ammine biogene o su siti di stoccaggio. In particolare, negli ultimi anni, i trasportatori delle ammine biogene hanno ricevuto particolare attenzione a causa della concreta evidenza sperimentale dell’esistenza di siti specifici di legame per le TAs. Nonostante queste interazioni, la molteplicità degli effetti farmacologici indotti dalle TAs è risultata giustificata solo parzialmente fino alla scoperta dell’esistenza di una famiglia di recettori orfani accoppiati a proteine G, i cui ligandi endogeni sono stati identificati nelle TAs, ed a cui è conseguito il nome TAARs1.

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1.1. Biosintesi e metabolismo

Le ammine traccia endogene vengono sintetizzate tramite un processo di decarbossilazione dei loro precursori amminoacidici ad opera dell’enzima L-Aminoacido-Aromatico Decarbossilasi (AADC)2; infatti la β-feniletilamina (β-PEA) viene sintetizzata a partire dalla fenilalanina, mentre la p-tiramina deriva dalla L-tirosina. La p-tiramina può essere ulteriormente convertita enzimaticamente dalla dopamina-β-idrossilasi (DBH) in p-octopamina. Per azione dell’AADC sull’L– triptofano, invece, si ottiene la triptamina, localizzata nel cervello in quantità paragonabili a tiramina e β-PEA3_.

Figura 2. Vie sintetiche e metaboliche per le ammine traccia e simpaticomimetiche endogene

ed esogene

Il metabolismo delle ammine traccia avviene ad opera della monoamino-ossidasi (MAO)2 (Figura 2). La MAO è responsabile della deaminazione di ammine primarie e secondarie che si trovano libere nel citoplasma neuronale mentre non ha effetto su quelle presenti all’interno di vescicole di deposito del neurone simpatico.

La reazione della MAO con il suo substrato richiede ossigeno molecolare e acqua e porta alla formazione dell’aldeide corrispondente, ammoniaca e perossido di idrogeno:

8 R-CH2NH2 + O2 + H2O → R-CHO +NH3 + H2O2

Sono stati individuati due isoenzimi della MAO aventi differente localizzazione e specificità di substrato. La MAO-A predomina nello stomaco, nell’intestino e nella placenta e si trova sia all’interno che all’esterno dei neuroni simpatici. I substrati preferiti dalla MAO-A sono le ammine aromatiche polari come la noradrenalina, l'adrenalina, la serotonina (o 5-idrossitriptamina) e l’octopamina. La MAO-B, invece, si ritrova a livello delle piastrine, dei neuroni serotoninergici e in gran parte del cervello e la sua attività di deaminazione interessa in modo selettivo le ammine aromatiche non-polari come la β-feniletilamina e la dopamina. Le aldeidi derivanti dalle reazioni cataboliche delle MAO vengono poi rapidamente convertite in acido p-idrossifenilacetico ad opera dell’aldeide deidrogenasi (ADH).

Un ulteriore processo metabolico in vivo avviene tramite la metilazione da parte di N-metiltransferasi non specifiche (NMT) o da feniletanolammina-N-N-metiltransferasi (PNMT), trovate nella midollare del surrene, a dare le corrispondenti ammine secondarie. Queste reazioni metaboliche portano alla formazione anche di noradrenalina, anch’essa interessata dal metabolismo da parte di MAO, ADH e PNMT (Figura 2).

Un ulteriore gruppo di enzimi contenenti rame coinvolto nei processi metabolici a carico delle ammine traccia sono le ammino ossidasi sensibili alla semicarbazide (SSAO), che comportano la deaminazione di ammine aromatiche e alifatiche in maniera identica alla MAO. Le SSAO non vengono inibite dagli inibitori MAO, come la clorgilina, ma sono inibite dalla semicarbazide, e sono state trovate in grande quantità nel tessuto vascolare (ad esempio nell’aorta di ratto)4_.

Le MAO presenti nell'intestino e nel fegato controllano i livelli circolanti di ammine assunte con la dieta, come tiramina e β-feniletilamina. Negli individui che assumono MAO-inibitori, l’ingestione di alimenti contenenti tiramina fa sì che una gran quantità di tiramina raggiunga i tessuti periferici. Il loro meccanismo d’azione consiste in un’attività simpaticomimetica indiretta, per cui entrano nei neuroni simpatici e rilasciano noradrenalina, provocando una vasocostrizione mediata da recettori α-adrenergici e ipertensione transitoria.

È stato visto che alcuni pazienti in trattamento con inibitori MAO sono stati colpiti da una grave crisi ipertensiva, per alcuni dei quali è risultata essere fatale a causa dell’insorgenza di un’emorragia intracranica. È evidente, quindi, che gli inibitori MAO potenziano gli

9 effetti periferici delle amine che si comportano come simpaticomimetiche indirette. Tuttavia, questo potenziamento avviene indipendentemente dal fatto che l’ammina sia o meno un substrato per le MAO. Un gruppo α-metilico sulla catena laterale, come in amfetamina ed efedrina, rende infatti l'ammina immune alla deaminazione, evitando quindi il metabolismo intestinale. Analogamente, la β-PEA non viene deaminata nell'intestino in quanto è un substrato selettivo per le MAO-B, enzimi non presenti a questo livello. Ciononostante, l’inibizione MAO nei neuroni simpatici consente un aumento del pool citoplasmatico di noradrenalina, il quale viene rilasciato dalle amine simpaticomimetiche indirette; le loro risposte sono quindi potenziate a prescindere dal fatto che siano deaminate dalle MAO5.

I livelli cerebrali delle ammine traccia endogene sono molto inferiori a quelli delle ammine biogene come noradrenalina, dopamina e serotonina (nell’ordine del nanomolare), ma la loro sintesi avviene in quantità equivalenti a quelli di noradrenalina e dopamina e hanno un rapidissimo turnover. Queste basse concentrazioni insorgono a causa della loro emivita molto breve e della mancanza di immagazzinamento2.

1.2. Fisiologia delle ammine traccia

Tradizionalmente nella letteratura scientifica ci si riferisce alle TAs come "falsi" trasmettitori o, nel migliore dei casi, come neuromodulatori fisiologici con effetti simpaticomimetici indiretti.

Nell'animale le azioni fisiologiche delle TAs sono relativamente deboli rispetto alle catecolamine. Tuttavia, in condizioni in cui l'attività MAO è inibita, i livelli di TAs possono diventare significativamente elevati, sostituendo i "veri" neurotrasmettitori all’interno delle loro vescicole. A concentrazioni ancora maggiori le TAs potenziano il rilascio di dopamina e, in misura minore, di noradrenalina e serotonina a livello delle sinapsi. Gli effetti evocati a queste elevate concentrazioni di TAs sono state denominate "anfetamina-like"2.

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2. RECETTORE ASSOCIATO ALLE AMMINE TRACCIA (TAAR)

Fu osservato che i recettori attraverso i quali le ammine traccia esercitano queste risposte recettoriali non classiche potrebbero essere recettori specifici per la feniletilamina. La rilevazione del primo recettore per le ammine traccia è stata effettuata da due gruppi di ricercatori in modo indipendente, utilizzando comunque metodi similari. Miscele complesse di oligonucleotidi, le cui sequenze erano basate sui recettori per la serotonina6 o la dopamina7, sono stati usati come modelli per amplificare nuove sequenze di DNA mediante PCR usando DNA complementare di ratto e DNA genomico1.

Tuttavia, solo la recente scoperta di una famiglia di recettori accoppiati a proteina G (GPCR) simili alla rodopsina, definiti come recettori accoppiati ad ammine traccia (TAARs), ha offerto l'opportunità di esplorare i ruoli delle ammine traccia e dei loro recettori sia da un punto di vista fisiologico che patologico7.

Figura 3. Recettore associato alle ammine traccia TAAR

I TAARs sono una classe di recettori appartenenti alla famiglia dei recettori accoppiati a proteine G (GPCRs). La famiglia degli hTAARs (TAARs dell’uomo) è composta da 6 geni e 3 pseudogeni, è localizzata su un singolo cromosoma e presenta una elevata omologia strutturale con i recettori delle ammine biogene. E’ stata inoltre evidenziata la presenza di una sequenza peptidica TAAR-specifica (fingerprint motif) costituita da sette domini transmembranali che risulta essere assente in altri GPCRs. Si ritiene che la famiglia dei TAARs rappresenti probabilmente l’evoluzione, attraverso il susseguirsi di una serie di duplicazioni geniche, di un gene “ancestrale” comune che mostra una stretta somiglianza con il gene umano codificante per il recettore 5-HT4 della serotonina8.

11 La maggior parte dei segnali dei TAAR1 sono stati studiati attraverso il sistema proteina G/adenilato ciclasi; questo ha permesso di constatare che tali recettori potrebbero essere attivati non solo dalle ammine traccia, ma anche da derivati anfetaminici, metaboliti delle monoamine, iodotironamine ed ergoline, nonché alcuni farmaci adrenergici e serotoninergici9.

Solo nel 2010-2011, Hoener e collaboratori hanno permesso l’identificazione dei primi ligandi selettivi per il TAAR grazie alla scoperta dell’agonista selettivo RO5166017 (per il TAAR1) il quale è risultato essere molto più potente dell’ammina traccia β-PEA (Figura 4)12.

Figura 4. Struttura degli agonisti selettivi di TAAR1 RO5166017, β-PEA, 3-iodotironamina

Il TAAR1 è espresso in diverse regioni del cervello, comprese le zone contenenti i nuclei monoaminergici e le regioni limbiche. Grazie alle evidenze raccolte, è stato visto che il TAAR1 è coinvolto nella modulazione del sistema sia dopaminergico che serotoninergico e ciò rende questo recettore un nuovo bersaglio promettente per la scoperta di farmaci che permettano di gestire disturbi monoaminergici come la schizofrenia, depressione, sindrome da deficit di attenzione e iperattività (ADHD) e il morbo di Parkinson13. Partendo dal presupposto che diversi ligandi serotoninergici e adrenergici agiscono anche come agonisti del TAAR1, il presunto modello di sito di legame per il recettore è stato individuato sia sulla base delle corrispondenti regioni sul sito di legame del recettore β2-adrenergico, sia mettendo in evidenza i più interessanti residui del TAAR1 che potrebbero essere coinvolti nel riconoscimento del ligando, attraverso un confronto qualitativo con il modello 5-HT1A costruito in precedenza da Cichero e dal suo staff14. Per definire meglio i complessi hTAAR1/RO5166017, hTAAR1/β-PEA e TAAR1/T1AM, Cichero et al. hanno anche eseguito un’“analisi” di tutte le catene laterali coinvolte nel legame con

12 l’agonista. Al fine di ottenere ulteriori dati significativi da questo esperimento, fu messa in atto anche una valutazione qualitativa del modello ottenuto mediante valutazione di un'adeguata distribuzione delle porzioni idrofobe e idrofile sulla superficie del modello di hTAAR1, che ha dimostrato che il dominio transmembrana del recettore mostra proprietà idrofobiche sulla superficie (raffigurati in rosso, figura 5), mentre le porzioni estese verso l’ambiente extra-cellulare (CE) o intra-cellulare (IC) sono state rappresentate in blu (e sono quelle che presentano proprietà idrofile) .

Figura 5. Distribuzione delle porzioni idrofobiche e idrofiliche sulla superficie dell’hTAAR1

Gli studi di docking hanno permesso di rivelare che RO5166017, β-PEA e T1AM condividono le seguenti interazioni:

- un legame a idrogeno tra gli ammino gruppi dei due composti e la catena laterale Asp103;

- legame π-π tra l'anello fenilico (per quanto riguarda T1AM il fenile è quello dell’inner ring a cui è legata la catena etilamminica per T1AM) eTrp264, Phe267 e Phe268

(Figure 6 e 7).

Inoltre, il composto RO5166017 presenta un ulteriore legame a idrogeno con Thr100 per mezzo dell'anello ossazolico, mentre T1AM è impegnata in un legame ad idrogeno anche con Asn286 e Asp287 (attraverso i due atomi di ossigeno).

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Figura 6. Rappresentazione di punti di interazione selezionati di RO516607 e β-PEA posti nel

presunto sito di legame dell’hTAAR1

Figura 7. Rappresentazione di punti di interazione selezionati di RO516607 e T1AM posti nel

presunto sito di legame dell’hTAAR1

Tenendo in considerazione solo l'agonista RO5166017, ci sono diverse sostituzioni che potrebbero essere effettuate, e che possono fornire risultati interessanti:

- il gruppo etilico dell’agonista è proiettato verso i numerosi residui dell’hTAAR1, ma tra questi solo i residui Phe267 e Asn286 si sono conservati per quanto riguarda il recettore sia β2-adrenergico che il 5HT1A, mentre il Thr271 solo per il residuo polare Asn293 del recettore β2-adrenergico e per il residuo idrofobico Ala385 del 5HT1A. Inoltre, i residui Asp287 e Ile290 dell’hTAAR1, a differenza

14 dei due GPCR usati come modello, sono in corrispondenza di due spazi vuoti. Perciò, la tasca del hTAAR1 che circonda il sostituente etilico del RO5166017 risulta essere utilizzata, a differenza dei recettori 5HT1A e β2. Di conseguenza, la catena etilica potrebbe essere sostituita in maniera appropriata con un gruppo più ingombrante, che porti anche una funzione idrofila, per aumentare gli H-bond, in particolare, con Thr271 e Asn286. L’anello fenilico del RO5166017, inoltre, è rivolto verso altri due residui conservati del recettore (Trp264 e Phe268); in particolare, Phe195 corrisponde, rispettivamente, ai residui polari Ser204 e Thr200 β2-adrenergico e 5HT1A serotoninergico. In questo caso, l’introduzione di un gruppo idrofobico o aromatico in corrispondenza di questo residuo polare del hTAAR1 potrebbe essere utile per la selettività dell'agonista per l’hTAAR1; - l’anello 4,5-diidro-1,3-ossazolico del RO5166017 occupa una regione che

comprende i residui His99, Thr100, Asp103 e Cys182 del hTAAR1. Tra questi, Asp103 e Cys182 sono conservati per quanto riguarda i recettori β2-adrenergici e quelli del 5HT1A, mentre Thr100 è conservato soltanto tra l’hTAAR1 e il recettore adrenergico. In particolare, His99 corrisponde al residuo Trp109 del recettore β2-adrenergico. Dunque, l'introduzione di sostituenti appropriati in posizione 2 dell’anello ossazolico potrebbe migliorare l'interazione con i residui di base dell’hTAAR1, e probabilmente anche il raggiungimento della selettività per l’agonista dell’hTAAR115_.

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3. EFFETTI FARMACOLOGICI ASSOCIATI ALLE AMMINE TRACCIA 3.1. Pressione sanguigna

La somministrazione orale nell'uomo di tiramina, efedrina, e delle ammine sintetiche fenilpropanolamina, anfetamine, metilfenidato, provoca un aumento della pressione sanguigna, sia diastolica che sistolica.

La risposta pressoria della tiramina viene utilizzata sperimentalmente come strumento per studiare i meccanismi di rilascio di noradrenalina dai neuroni simpatici e come indice dell’attività del nervo simpatico periferico. Il “test pressorio” della tiramina corrisponde alla quantità di tiramina necessaria per aumentare la pressione sanguigna sistolica di 30 mmHg, in seguito a iniezioni endovenose16. L’iniezione di tiramina innalza la pressione arteriosa ma questo effetto è stato associato ad un aumento della gittata cardiaca piuttosto che ad una vasocostrizione. L’iniziale aumento della pressione induce, inoltre, una diminuzione della resistenza periferica totale, suggerendo l’insorgenza di una vasodilatazione riflessa mediata da barorecettori17.

L’infusione in pazienti sani, inoltre, ha fatto osservare anche un rilascio elevato di noradrenalina sia a livello sistemico che periferico, indicando che c'era stato un rilascio locale di noradrenalina da parte della tiramina.

Poiché l'aumento pressorio veniva inibito dal bisoprololo (antagonista selettivo β1– adrenergico) ma non dalla doxazosina (antagonista α1–adrenergico), si presume che l'effetto pressorio sia di origine cardiaca piuttosto che indotta da vasocostrizione. Tuttavia, questa paradossale vasocostrizione seguita da vasodilatazione non è stata ancora spiegata in modo soddisfacente.

Anche la frequenza cardiaca da parte della tiramina è risultata aumentata, suggerendo che l'effetto cardiaco è dovuto ad un effetto inotropo positivo, ma ciò non avviene in maniera drastica; questo fatto è spiegabile poiché tale effetto viene controbilanciato da un riflesso bradicardico compensatorio ad opera del nervo vago. La conferma di ciò deriva dall'osservazione che l’antagonista muscarinico atropina potenziava l'aumento di frequenza cardiaca e di pressione sanguigna indotta dalla tiramina18.

È stato notato che la tiramina, oltre a provocare vasocostrizione, favorisca il rilascio anche di altre sostanze endogene vasodilatanti, come la dopamina e l’ATP; quest’ultima, oltre a causare vasodilatazione, regola il flusso ematico locale andando a contrastare l’attività vasocostrittrice simpatica.

16 Un’ulteriore sostanza dagli effetti vasodilatanti, probabilmente rilasciata dalla tiramina, è l’ossido nitrico. L'infusione endovenosa di tiramina provoca l’aumento della pressione sanguigna e delle resistenze vascolari periferiche; queste risposte sembrano essere potenziate dall’inibitore dell'ossido nitrico sintasi, la N-nitro-L-arginina, indicando l’insorgere di un effetto vasodilatante opposto alla tiramina mediato attraverso il rilascio di ossido nitrico19. Le ammine traccia, quindi, aumentano la pressione sanguigna negli esseri umani e negli animali; tuttavia questa risposta non è del tutto chiara e non può essere interamente dovuta alla vasocostrizione ma include anche una componente cardiaca.

Sebbene gli effetti pressori delle ammine traccia siano spiegati unicamente riferendosi alle loro proprietà di “falsi trasmettitori”20_{, la scoperta che l’mRNA del TAAR1 viene}

espresso nel cuore7 e che alcune tironamine quali T1AM e T0AM hanno effetti così drastici sul sistema cardiovascolare, ha dato origine a ricerche approfondite in tale ambito, che hanno condotto il gruppo del Dr. R. Zucchi dell’Università di Pisa a studiare gli effetti biologici cardiovascolari delle tironamine e dei TAARs.

Figura 8. Struttura delle tironamine: tironamina (T0AM) e 3-iodotironamina (3-T1AM)

In seguito agli studi riportati da Scanlan et al.10, Zucchi ed il suo team21 hanno esplorato l’attività del T1AM su cuore isolato di ratto e cardiomiociti. Dagli studi è emerso che il T1AM produce un effetto cronotropo negativo, ma anche un effetto inotropo negativo, ed entrambi risultano essere reversibili e dose-dipendenti (riduzione del 27±5%, 51±3%, e 65±2% nella gittata cardiaca a 19 μM, 25 μM, e 38 μM, rispettivamente).

Fu notato che gli effetti emodinamici del T1AM venivano notevolmente aumentati in presenza di genisteina, un inibitore di tirosina chinasi, mentre diminuivano in presenza di vanadato, cioè di un inibitore di tirosina fosfatasi. Nessun effetto, invece, veniva prodotto da un gruppo di enzimi, tra cui inibitori di protein chinasi A (PKA), protein chinasi C (PKC), calcio-calmodulina chinasi II, fosfatidilinositolo-3-chinasi o MAP chinasi.

17 I risultati di esperimenti svolti tramite Western blotting con proteine ventricolari di ratto e anticorpi antifosfotirosina hanno suggerito che la fosforilazione di proteine microsomiali e citosoliche viene ridotta in seguito a perfusione con T1AM. Per capire se gli effetti del T1AM sul cuore sono mediati dal TAAR, o da altri membri della stessa famiglia, Chiellini et al.21 hanno condotto uno studio tramite RT-PCR che ha permesso di rivelare la presenza di copie per almeno 5 sottotipi di TAAR di ratto (TAAR1, TAAR2, TAAR3, TAAR4, e TAAR8a) nell’mRNA. Nel tentativo di mostrare il legame del T1AM nel cuore, le membrane cardiache furono marcate con [125I]T1AM sia in presenza che in assenza di concentrazioni crescenti di T1AM “non marcato”. Un sito di legame specifico e saturabile viene riportato con un Kd calcolato in un range al di sotto del micromolare (5 μM). Lo studio è stato completato attraverso la spettrometria di massa in tandem che ha permesso di evidenziare la distribuzione del T1AM.

È degno di nota che gli effetti di ammine traccia, β-feniletilammina e tiramina producano un effetto stimolante sul sistema cardiovascolare, mentre le tironamine hanno effetti opposti. Se però è vero che le ammine traccia e le tironamine vanno ad evocare le loro risposte cardiovascolari attivando il TAAR1, allora quello che si presenta non è altro che un paradosso. Comunque, data la molteplicità dei geni del TAAR esistenti, la loro complessa espressione nel miocardio e la mancanza di informazioni circa la loro farmacologia ed i segnali del secondo messaggero, la soluzione a questo enigma dovrà probabilmente attendere fino a quando non ci sarà una maggiore e migliore conoscenza riguardo ciascun membro di questa famiglia di recettori.

3.2. Vasi sanguigni isolati

In vasi sanguigni isolati non vi è alcun dubbio che la tiramina e altre ammine provochino vasocostrizione. Inizialmente si pensava che questo effetto non interessasse molte altre sostanze, mentre recentemente sono state attribuite proprietà vasocostrittrici anche all’anfetamina22_.

Si ipotizza perciò che le ammine traccia alimentari provochino dilatazione nel letto vascolare mesenterico per aumentare il flusso di sangue nel tratto gastrointestinale, facilitando così la digestione e l'assorbimento. Per incentivare questo aumento del flusso sanguigno, l’instaurarsi di una vasocostrizione periferica fa sì che il sangue venga convogliato dagli altri organi verso l’intestino23_.

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Figura 9. Curve cumulative che mostrano una vasocostrizione in risposta alla p-tiramina in

assenza (A) o in presenza (B) di antagonisti

3.3. Meccanismi dimostrati per gli effetti vascolari delle ammine traccia

Test su animali hanno dimostrato che le ammine traccia hanno due possibili meccanismi d’azione; infatti, si comportano come amine simpaticomimetiche indirette attraverso il rilascio di noradrenalina dai neuroni simpatici, ma potrebbero anche esercitare effetti diretti sui recettori adrenergici.

Le prime osservazioni, infatti, suggerivano che la risposta all’adrenalina veniva potenziata dalla cocaina, ma le risposte alla tiramina venivano inibite. Analogamente, la denervazione cronica del sistema simpatico potenziava le risposte all'adrenalina, ma inibiva quelle alla tiramina.

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4. TERMOREGOLAZIONE E METABOLISMO

Il tentativo di stabilire un ruolo biologico per il TAAR1, tralasciando gli altri membri di questa famiglia, si è rivelato comprensibilmente incerto; infatti, molti dei reattivi richiesti per condurre esperimenti sensati, per esempio antagonisti ad alta affinità, agonisti selettivi e anticorpi recettoriali, devono ancora essere sviluppati. Inoltre, soltanto negli ultimi anni è stata descritta una linea di roditori knock-out per il recettore TAAR124. Nonostante queste limitazioni, però, la ricerca dei ruoli fisiologici del TAAR1 negli animali promette di essere estremamente eccitante.

Come precedentemente menzionato, l’esistenza di un nuovo composto simile agli ormoni tiroidei che sarebbe anche un agonista del TAAR1, fu ipotizzata per la prima volta nel 2002 da Grandy and Scanlan. Nello stesso anno, fu visto che sia T0AM che T1AM di sintesi erano agonisti completi e potenti per il TAAR1 (di topo e ratto) espresso eterologamente in vitro. Attirati dall’idea che queste due molecole potessero avere effetti biologici in vivo, cercarono di fare luce sui possibili ruoli del TAAR1; così, Grandy ed il suo gruppo, grazie alla disponibilità di T1AM e T0AM, sintetizzati in quantità sufficienti da Scanlan ed il suo gruppo, furono in grado di studiare le azioni di queste tironamine nei topi. Fu osservato, in particolare, che pochi minuti dopo l’iniezione intraperitoneale di T1AM o T0AM sintetici, sia in topi10 che criceti,rapidamente si manifestava uno stato di torpore caratterizzato da inattività comportamentale e da un crollo significativo del tasso metabolico. Contemporaneamente, gli animali mostravano una profonda ipotensione bradicardica e ipotermia, che erano comunque dose dipendenti e completamente reversibili. Incoraggiati da queste scoperte, svilupparono quindi un metodo di spettrometria di massa usando standard artificiali che permettevano di rilevare in maniera inequivocabile quantità picomolari sia di T1AM che T0AM nel materiale biologico. Successivamente, la sintesi di un T1AM standard sostituito con deuterio da parte di Scanlan ed il suo team, rese questo metodo sia quantitativo che sensibile. Tramite una semplice procedura di estrazione organica, Grandy, Scanlan ed i loro colleghi andarono a cercare la presenza di entrambi i composti che avevano trovato nel cervello di diverse specie di roditori. In studi successivi, però, entrambi i composti furono trovati anche nel siero e nel plasma umani.

Sebbene molti dettagli rimangano da confermare, un’interpretazione conservativa di questi risultati propone che le tironamine T1AM e T0AM derivino direttamente dagli

20 ormoni tiroidei presenti naturalmente, e che potrebbero essere generati da azioni concertate ad opera di decarbossilasi aromatiche acide e della 3TH deiodinasi26_.

In ogni modo, non si esclude che potrebbe essere esplorata la possibilità che esistano altre vie alternative di sintesi delle tironamine. Il periodo di tempo rapido in cui si manifestano i loro effetti ed il fatto che risposte inevitabili alle tironamine vadano in direzione opposta a quella degli ormoni tiroidei, ha condotto Grandy e Scanlan ad ipotizzare che le tironamine rappresentino una seconda branca della biologia degli ormoni tiroidei che fornisce un rapido feedback all’organismo, cosicché possa regolare più efficacemente la sua fisiologia e il metabolismo in risposta alle condizioni ambientali in continuo cambiamento. Tuttavia, è ancora da stabilire se gli effetti del T1AM e/o T0AM derivino dall’attivazione del TAAR1, o di altri TAAR, nel cervello e/o in periferia.

Comunque, la dimostrazione dell’esistenza di questi nuovi composti simili agli ormoni tiroidei, presenti naturalmente, implica che una nuova ed eccitante dimensione della fisiologia animale è stata rivelata come diretta conseguenza dei tentativi di delineare farmacologicamente il TAAR1 in vitro.

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5. COMPORTAMENTO DEI RECETTORI ASSOCIATI ALLE AMMINE TRACCIA

Siamo già a conoscenza della ricca letteratura che vede le ammine traccia implicate in un gran numero di condizioni mentali umane, tra cui schizofrenia, ADHD e depressione. La mancanza di ligandi altamente selettivi per il TAAR1 ha reso impossibile esaminare la fisiologia del TAAR1 nel sistema nervoso centrale.

Wolinsky et al. attraverso mutagenesi mirate in una linea di cellule staminali embrionali, sono riusciti a generare una specie animale che trasmetteva l’allele mutante del TAAR1 alla sua progenie. I discendenti di questo topo, omozigoti per l’allele mancante del TAAR1, ed i topi wild type sono stati valutati in numerose situazioni comportamentali; in questi casi si è visto, ad esempio, che l’anfetamina ha una certa influenza. La totale mancanza di qualsiasi espressione del TAAR1 apparentemente non ha effetto sul comportamento dei topi, valutati per la loro attività complessiva o l’ansietà, la temperatura corporea basale, o il saggio di ipertermia indotta da stress.

Questo forse non sorprende, dato che nel topo sono stati documentati almeno 15 geni correlati al TAAR127. Inoltre, i topi a cui manca completamente il TAAR1, durante il loro sviluppo, mostrano un significativo deficit del sistema sensomotorio che si manifesta come incontrollata propulsione.

Gli animali in cui il TAAR1 è assente differiscono dai wild-type poichè questi ultimi mostrano ipersensibilità in seguito all’effetto di stimolazione locomotoria provocata dall’anfetamina. In aggiunta, sonde di microdialisi piazzate nello striato dorsale hanno rivelato che 60 minuti dopo l’iniezione intraperitoneale di anfetamina (2.9 mg/kg), in topi mutanti, questi hanno risposto rilasciando in modo significativo più dopamina (910%) nel loro striato dorsale rispetto a quanto fanno i topi wild type (410%).

Similmente, i livelli di noradrenalina risultavano significativamente elevati in topi che non esprimevano il TAAR1 (837%) in confronto ai topi wild-type (424%)11.

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6. OLFATTO

Grazie a Borowsky et al.6 e Bunzow et al.7 fu notato che i trascritti del TAAR1 erano espressi in quantità relativamente basse, in confronto a molti altri recettori delle ammine biogene accoppiati a proteina G. Nonostante questo, Borowsky et al. ebbero successo nell’utilizzo di un’ibridizzazione in situ per effettuare una mappatura della distribuzione dei trascritti di TAAR1 nel cervello del topo.

Tenendo sotto controllo possibili reperti, Bunzow et al. raccolsero prove di RT-PCR plausibili per l’ampia espressione dei trascritti di TAAR1 in sistema nervoso centrale e organi periferici di topi, ratti ed esseri umani. In seguito a scoperte simultanee ed osservazioni indipendenti, Bunzow et al. e Borowsky et al. trovarono la più fitta espressione di trascritti di TAAR1 nel bulbo olfattivo. Sorprendentemente, comunque, la traccia definita da Borowsky et al. e Bunzow et al. non fu immediatamente raccolta dall’area olfattiva. Invece, il TAAR olfattivo fu “riscoperto” da Liberles and Buck25 _nel

corso dei loro tentativi per identificare un nuovo GPCR chemiosensitivo nell’epitelio olfattivo. Usando il cDNA creato dall’mRNA del neurone sensitivo olfattivo, Liberles and Buck inizialmente identificarono il TAAR7 e TAAR8 come dei trascritti molto numerosi nel neurone sensitivo olfattivo di topo. Tentativi successivi di cercare la presenza di altri membri della famiglia di TAAR nel topo nel neurone olfattivo, rivelò l’espressione di trascritti corrispondenti a quelli dei geni del TAAR di topo (eccetto TAAR1) a livelli paragonabili ai veri recettori olfattivi.

Sebbene i TAARs di topo non siano stretti parenti dei recettori olfattivi, il loro modello di espressione ha sollevato una questione, ovvero quale stimolo chemiosensitivo attiva il TAAR espresso nel recettore sensoriale olfattivo.

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7. NUOVI LIGANDI ENDOGENI DEI RECETTORI ASSOCIATI AD AMMINE TRACCIA

Sebbene TAAR1 umani, di ratto e topo vengano attivati dalle ammine traccia prodotte a livello endogeno, oltre alla dopamina e al suo O-metossi metabolita, rimane da mostrare che un qualsiasi composto tra questi può agire come ligando del TAAR1 in vivo. Il profilo struttura-attività effettuato da Bunzow et al.7 ha già rivelato che la farmacologia di questo recettore permetteva di dimostrare che gli O-metossi derivati delle catecolamine erano potenti agonisti del TAAR1.

La continua ricerca di ulteriori ligandi endogeni per il TAAR1 ha già condotto alla scoperta della 3-iodotironamina (T1AM) e al suo derivato deiodinato tironamina (T0AM), molecole che si possono considerare strettamente correlate, se non derivate, dall’ormone tiroideo28_{. Basandosi sul profilo struttura-attività completato da Bunzow et}

al.7 e con il fatto che le catecolamine e la p-tiramina sono tutti derivati dall’amminoacido tirosina, Grandy e Scanlan hanno ipotizzato che i metaboliti decarbossilati dell’ormone tiroideo potrebbero essere agonisti del TAAR1. Attraverso i tentativi combinati di Scanlan e del suo gruppo di chimici organici e il gruppo di Grandy e dei suoi farmacologi è stato dimostrato che T1AM, ed il suo enantiomero T0AM, sono agonisti completi e potenti in cellule umane, di topo e di ratto10. Questa osservazione ha immediatamente suggerito il proseguimento di studi addizionali sia in vivo che in vitro, in modo che permettano di ottenere risultati sempre più concreti che facciano luce su ogni aspetto di questi interessanti recettori.

7.1. Analoghi di β-PEA come agonisti del recettore TAAR1

Figura 10. β–feniletilammina

Sulla base del ruolo svolto dalle TAs nell'eziologia delle patologie precedentemente discusse, numerosi chimici farmaceutici si sono dedicati alla sintesi di analoghi delle tironamine, con lo scopo di individuare gli elementi farmacoforici fondamentali per

24 l'interazione degli stessi con il recettore hTAAR1. Partendo dagli effetti farmacologici indotti dalla somministrazione di β-PEA è stata sintetizzata una serie di analoghi di cui è stata valutata la capacità di attivazione del recettore hTAAR1, dopodichè i risultati ottenuti sono stati utilizzati per uno studio CoMFA 3D-QSAR per l'elaborazione di un modello farmacoforico di hTAAR129. In particolare, sono state effettuate modifiche a carico dell’anello aromatico e a carico della catena etilamminica. Sostituzioni della catena etilamminica con singoli e piccoli sostituenti come gruppi metilici sulla posizione β della catena sono ben tollerati, mentre sostituzioni con due metili o con un gruppo fenilico, riducono la potenza. Anche i composti α sostituiti dimostrano una riduzione dell’attività rispetto alla β-PEA, così come la conversione del gruppo amminico primario in gruppo amminico secondario mediante N-metilazione porta alla riduzione dell’attività. Per quanto riguarda l’anello aromatico, sostituzioni a carico delle posizioni 4 o 3 ne riducono l’attività, mentre, alcuni sostituenti come alogeni in posizione 2, attivano il recettore TAAR1 più di quanto lo attivi un gruppo metile in posizione 2 dell’anello. E’ stato evidenziato, infatti, che a parità di sostituente, l’attività si riduce passando dalla posizione 2 alla 4; l’unica eccezione è rappresentata dal gruppo OH, che sembra non influenzare la potenza. Tra i più importanti risultati ottenuti da studi CoMFA è stato evidenziato come gli analoghi con grandi sostituenti in N si allineino diversamente da analoghi con grandi sostituenti in meta e/o in para rispetto il recettore hTAAR1. Gli effetti ottenuti dalla N-metilazione, insieme agli effetti della sostituzione aromatica, indicano che analoghi di β-PEA interagiscono scarsamente a causa del loro ingombro sterico. Gli analoghi di β-β-PEA con grandi sostituenti, in particolare in posizione 4 dell’anello aromatico, e con sostituenti aromatici multipli, rivelano una ridotta efficacia. Incrementando la massa a livello della catena ammino-terminale, mediante N-metilazione o N-dimetilazione, si ha un incremento della potenza di β-PEA, con minimi effetti sull’efficacia. E’ stato inoltre osservato che aumentando l’ingombro sterico di entrambe le porzioni, aminica (mediante N-dimetilazione) e aromatica (in posizione para) si assiste ad importanti variazioni sia in termini di potenza sia di efficacia.

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Tabella 1. Sostituzioni della β-PEA, potenza ed efficacia su hTAAR1

7.2. Composti imidazolici come agonisti selettivi di TAAR1

Le amine traccia, quali β-PEA e p-tiramina, risultano essere agonisti selettivi del recettore TAAR1; sulla base di questa considerazione, un gruppo di studiosi, ha individuato composti imidazolici a basso peso molecolare, come potenti e selettivi agonisti del recettore TAAR1. A partire dalla 2-benzilimidazolina, è stata esaminata la potenza e la selettività di composti 2- e 4-benzilimidazolici30.

Modifiche a carico della regione linker hanno portato alla scoperta del 4-aminometilimidazolo, che ha un’elevata affinità verso TAAR1; invece, mediante un sostituente N-isopropilico, si ottiene una buona selettività verso il recettore α2.

Da questo studio è emerso che sostituenti piccoli e lipofili sono preferibili ai fini dell’interazione con TAAR1 e che l’introduzione di gruppi polari porta ad una minore attività dei ligandi. Al contrario, la sostituzione in meta o para dell’anello fenilico con

26 cloro, aumenta l’affinità e la selettività di legame. Inoltre la sostituzione dell’N con un gruppo isopropilico porta a composti più selettivi (Tabella 2).

Tabella 2. Legame TAAR1 e selettività verso α2 per i composti 2-imidazolici 49-54

7.3. Antagonista selettivo del recettore associato ad amine traccia (TAAR1): scoperta di EPPTB

Mediante uno studio HTS, sono stati identificati una serie di benzanilidi antagonisti del TAAR1 e l’ottimizzazione di questa classe di composti ha portato allo sviluppo di potenza di legame, attività funzionale e selettività verso altri target biologici. EPPTB (RO52122773), (Figura 11), rappresenta il primo antagonista selettivo TAAR1, del quale resta indiscussa la sua elevata potenza verso mTAAR131.

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Figura 11. Antagonista EPPTB del recettore TAAR1

Analoghi di questo composto, sono stati ottenuti mediante condensazione di derivati dell’acido nicotinico o benzoico e anilina opportunamente sostituita. Le sostituzioni a carico dell’anello anilinico hanno dimostrato che monosostituzioni in orto, para, meta, portano a perdita dell’affinità per il recettore, mentre monosostituzioni in meta offrivano composti con alta affinità, ad eccezione del fenile, CF3 e MeSO2. In posizione meta sono

preferiti piccoli sostituenti. La porzione amminica può inoltre essere sostituita da alogeni, per i quali l’aumento delle dimensioni porta ad un aumento dell’attività. Inoltre, la sostituzione di un Br con un gruppo ingombrante quale un eterociclo nucleofilo, come il gruppo pirazolico, porta ad una riduzione dell’affinità di legame. L’introduzione di sostituenti ingombranti e lipofili porta all’aumento dell’affinità di legame rispetto al Br; inoltre, la sostituzione del nitro gruppo con un sostituente lipofilo non polarizzato come il CH3, porta ad una notevole perdita dell’attività. Al contrario, la sostituzione con

sostituenti polari, come acetile, o con sostituenti polari e lipofili, come fluoro o trifluorometossi, porta solamente ad una lieve perdita di attività (Tabella 3). Infine, la sostituzione del cloro, con sostituenti lipofili come bromo o trifluorometile, incrementano l’affinità di legame per mTAAR1. E’ stato rivelato, dunque, che all’aumentare della lipofilia diminuisce l’affinità di una Ki pari a 0.002μM.

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