V. MATERIALI E METODI
5.1 DESCRIZIONE DELL’AZIENDA
L’azienda agricola “Annonese” situata nel comune di Paganico (GR), si estende su di una superficie di trenta ettari nei quali trovano sistemazione quattro capannoni per l’allevamento del bestiame, il mangimificio, l’impianto biogas e l’area di produzione del vermicompost. L’azienda effettua l’ingrasso di vitelloni di razza Limousine provenienti da altre aziende, prevalentemente francesi, per un totale di oltre duemila soggetti. I capi arrivano in azienda all’età approssimativa di dodici mesi e vengono avviati alla macellazione prima dei sedici mesi. I soggetti presenti all’Annonese, in virtù di una selezione genetica, tale da conferire accelerata capacità di crescita e ridotta presenza di collagene, delle condizioni allevative e del regime alimentare cui sono sottoposte, sono condotti al macello in anticipo di due mesi rispetto agli standard di razza.
É presente inoltre un agglomerato rurale, dove originariamente si svolgevano le varie attività aziendali, al lato del quale sono presenti stalle in muratura (Pietratonda) utilizzate temporaneamente per l’allevamento, in attesa di completare il trasferimento dei capi nelle nuove stalle (Ontaneta). La stalla di Pietratonda è costituita da mura perimetrali in conglomerati di calcestruzzo, la copertura realizzata in lamiera ondulata sorretta da colonnine di cemento armato e la fenestratura perimetrale non è modificabile.
- Fig.4_Stalla Pietratonda, corsia foraggera.
Le due file di box (2m2/capo) sono disposte ai lati (Fig.4) e al centro è presente una corsia che funge anche mangiatoia. La lettiera è di tipo permanente ed è aggiunta ogni 3 - 4 giorni (Fig.5).
Il gruppo “Ontaneta” è invece contenuto in un box (5-8 m2/capo) facente parte delle strutture di recente costruzione, presenti in numero di quattro, e ospitanti più di 2000 capi. Trattasi di “stalle aperte”, prive di paramenti o barriere architettoniche all’infuori della tettoia; la lettiera, anch’essa di tipo permanente, viene rinnovata ogni due giorni utilizzando lo sparapaglia che passa agevolmente
i fronte ai boxes. d
-
Fig.5_Box “Stalla chiusa” (Pietratonda).
I soggetti di entrambi i gruppi sono alimentati con la stessa razione (unifeed) formulata dal veterinario e costituita da materie prime prodotte nella zona; la dieta risulta composta da mais (54%), girasole (22%), crusca (8%), paglia (9%) e soia (7%).
- Fig.6_“Stalla aperta” Ontaneta.
Fig.7_ Planimetria azienda agricola Annonese.
5.2 DESCRIZIONE DELLO STUDIO
La ricerca si è svolta dal dicembre 2007 all’aprile 2008. Sono state utilizzate 30 femmine di razza Limousine, di peso omogeneo tra loro, suddivise in due gruppi (A e B), alloggiati in due strutture differenti distanti un chilometro l'una dall'altra. Un gruppo “Pietratonda”di 15 soggetti è stato ospitato nella stalla omonima, struttura in muratura con pareti di conglomerato cementizio e tettoia in lamiera (circa 2 m2/capo), mentre il gruppo “Ontaneta” è stato alloggiato in un box (superiore a 5 m2/capo) facente parte di una delle quattro stalle aperte di recente costruzione e costituito anch'esso da quindici elementi. Sono stati monitorati i parametri microclimatici delle due diverse strutture e valutata la loro influenza sul
benessere attraverso il rilievo di parametri zootecnici, emato–chimici; è stato inoltre compilato un questionario a punti in base al metodo ANI 35L (Bartussek,
001). 2
5.3 RILIEVI MICROCLIMATICI
Prima dell’inizio della prova si è proceduto all'installazione di due stazioni meteorologiche (La Crosse VS-2308®) allo scopo di testare gli strumenti. E’ stata fissata una frequenza di campionamento di due ore, registrando per tutto il periodo della prova i seguenti parametri climatici: temperatura (interna ed esterna), umidità dell'aria (assoluta e relativa), velocità del vento (m/s), punto di rugiada. Non è stato possibile collegare direttamente le centraline a un computer al fine di ottenere un flusso costante di dati e la registrazione diretta su di un hard disk. Le centraline installate hanno una memoria propria limitata rendendo necessario il recupero manuale dei dati. Le centraline sono state installate all'interno degli stabulati in accordo con il veterinario responsabile, a distanza di sicurezza dal bestiame e in modo da consentire il passaggio di eventuali macchinari agricoli.
Le centraline meteorologiche sono composte da:
‐ anemometro;
‐ termometro;
‐ psicrometro;
‐ trasmettitore wireless;
I parametri presi in considerazione sono stati: ‐ Velocità del vento [m/s];
‐ Temperatura interna ed esterna [°C];
‐ Umidità interna ed esterna [%];
‐ Punto di rugiada [°C].
- Fig.8_Stazione metereologica in Ontaneta.
- Fig.9_Stazione metereologica in Pietratonda.
I dati sono stati suddivisi per mese e per periodo diurno e notturno, sono state quindi individuati i valori minimi e massimi, calcolate le medie e la relativa
eviazione standard. d
5.4 ANALISI EMATO-CHIMICHE
I campionamenti sono stati eseguiti su un numero di 7 capi per gruppo, scelti casualmente, per un totale di 14 animali. I prelievi sono stati effettuati in due momenti distinti: all’inizio della prova, dopo un periodo di acclimatamento di quindici giorni, e immediatamente prima del carico, il giorno stesso della macellazione. Si è ritenuto corretto attendere due settimane dall'arrivo dei capi in azienda per far si che lo stress da trasporto subito non influenzasse eccessivamente i parametri ematici.
I prelievi di sangue sono stati compiuti al mattino, prima della foraggiata (Archetti e Ravarotto, 2002). Il sangue, prelevato dall’arteria coccigea, è stato raccolto in
provette vacutainer, una per le analisi chimico - cliniche, l’altra K3EDTA per l’esame emocromocitometrico. I campioni etichettati e refrigerati sono stati inviati entro dodici ore all’Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Roma per le analisi.
- Fig.11_Prelievo di sangue dall’arteria coccigea.
Durante le suddette operazioni si è proceduto alla pesatura individuale, utilizzando un metro zootecnico (Balasini, 2001), e collettiva, tramite mezzo gommato con pianale tarato per la pesa.
5.4.1 Metodologie e tecniche ematologiche
L’esame emocromocitometrico è stato compiuto con l’ausilio di una macchina conta globuli automatica, l’applicazione della strumentazione e dell’automazione all’ematologia, infatti, permette di ridurre fortemente i costi del personale di laboratorio, fornendo così analisi più complete e con elevata ripetibilità dei
risultati (Lubas, 2004). La prova è stata eseguita su campioni di sangue intero prelevato e conservato in K3EDTA. In particolare è stato utilizzato uno strumento conta globuli con metodo combinato, in altre parole a impedenza elettrica e a fascio laser (CellDYN 3500®). Tale strumento impiega il metodo a impedenza elettrica a bassa frequenza per ottenere la differenziazione della popolazione dei globuli bianchi con una valutazione del loro volume, usando una corrente elettromagnetica ad alta frequenza per valutarne la conduttività e la luce laser. Secondo tale metodica si ottengono due citogrammi che forniscono il volume, l’analisi elettromagnetica e ottica; da essi s’identificano le cellule di dimensioni simili (basofili, piccoli linfociti) e il loro tipo di granulazione. Lo strumento usato è in grado di misurare, contare e calcolare parametri di ematologia animale, possedendo a tale scopo apposita taratura con valori di riferimento per uso veterinario. La macchina conta globuli ripartisce in tre aliquote diluite il campione in esame in precedenza aspirato. La determinazione dei parametri ematologici si basa su diversi metodi di misurazione: per il conteggio dei leucociti e per la determinazione della formula leucocitaria si usa la citometria ottica a flusso; tale metodologia consiste nel far passare le cellule all’interno di un capillare che permette il passaggio, per via del diametro, di una cellula alla volta, e farle colpire da un fascio laser che ne induce la separazione mediante “scatter polarizzato multiangolare” (Lubas, 2004). Esistono cioè dei sensori, posti a diversa angolazione, in grado di misurare la capacità delle cellule di deviare il fascio; tale proprietà varia in base alle caratteristiche morfologiche proprie degli elementi cellulari. L’intensità della luce diffusa è misurata mediante l’utilizzo di quattro angoli specifici di dispersione (Lubas, 2004; Archetti e Ravarotto, 2002), ottenendo in tal modo una misurazione quadrimensionale della cellula (Lubas, 2004).
A conferma di tale conteggio si utilizza, per la stima dei leucociti totali, un altro metodo basato sul passaggio delle cellule, sospese in un reagente di lisi, in un canale a impedenza elettrica. Il passaggio di queste tra due elettrodi produce una variazione transitoria della resistenza tra gli elettrodi stessi, traducibile in impulso elettrico misurabile. La lettura viene fatta attraverso un’apertura di misure note mediante il conteggio degli impulsi generati, valore che indica il numero di elementi transitati (Archetti e Ravarotto, 2002).
Anche il conteggio degli eritrociti e delle piastrine è affidato al metodo a impedenza elettrica, tale metodica si basa sulla misurazione delle variazioni della corrente elettrica prodotte al passaggio delle cellule attraverso un orifizio posto tra due elettrodi, le variazioni suddette sono poi tradotte in impulsi elettrici e il loro numero corrisponde a quello delle particelle misurate (Archetti e Ravarotto, 2002).
Per il dosaggio dell’emoglobina è stato impiegato un procedimento spettrofotometrico. Tale metodo si basa sulla misurazione colorimetrica dell’emoglobina liberata per emolisi e stabilizzata mediante uno specifico reagente. La lettura spettrofotometrica con una lunghezza d’onda di 540 nanometri permette quindi la misurazione dell’emoglobina presente nel campione in studio, poichè direttamente proporzionale alla lunghezza d’onda prescelta (Archetti e Ravarotto, 2002).
5.4.2 Determinazione dell’ematocrito (Hct o PCV)
La procedura utilizzata per la determinazione dell’ematocrito si basa sulla centrifugazione ad alta velocità che provoca la separazione degli elementi corpuscolati del sangue in base al loro diverso peso specifico (Lubas, 2004). La metodica adottata nei laboratori di analisi è quella del microematocrito: questa tecnica impiega un capillare riempito per 3/4 della sua lunghezza che viene poi inserito in un’apposita centrifuga in grado di ruotare fino ai 12000 rpm; per il sangue bovino viene azionata per 6 minuti circa.
In seguito a tale operazione si ottengono le seguenti suddivisioni del capillare:
-plasma (nella parte superiore): si presenta di colore trasparente e/o giallo pallido, dato dalla spremitura del sangue privo di cellule;
-strato bianco o buffy-coat (strato intermedio): esso presenta colore bianco grigiastro ed è suddiviso a sua volta in uno strato superiore color crema costituito da trombociti, da uno intermedio di colore grigio formato da leucociti e infine da uno strato rossastro dato dalle emazia nucleate che ritroviamo a questo livello
poichè presentano un peso specifico inferiore a quello degli eritrociti maturi (Lubas, 2004);
-strato rosso (nella parte inferiore del capillare): formato dai globuli rossi, tale strato è separato dal precedente da una linea scura data dall’emoglobina denaturata e ossidata a causa del contatto con i leucociti.
La lettura del PCV si esegue a livello dell’estremita` superiore dello strato degli eritrociti; poiché il capillare usato non è graduato per la lettura si ricorre a un normogramma, il capillare quindi viene inserito in una fessura di un cursore mobile, si fa quindi coincidere la linea di base del grafico con l’estremita` piu` in basso della parte corpuscolata. Gli altri parametri analizzati, quali MCV, MCH, MCHC, RDW, PDW, sono stati misurati elettronicamente dalle strumentazioni precedentemente descritte. Per quanto riguarda la determinazione della formula leucocitaria ci si è basati sulla lettura ottica microscopica.
5.4.3 Analisi emato-biochimiche
AST
La tecnica per l’individuazione dell’aspartato aminotransferasi si basa su un metodo cinetico secondo le indicazioni dell’International Federation of Clinical
Chemistry and Laboratory (IFCC), in assenza di piridossalfosfato. L’AST
catalizza la reazione per cui l’α-chetoglucarato associato al l-aspartato sono convertiti in l-glutammato e ossalacetato, mediante una reazione accoppiata alla presenza di malatoidrogenasi e del relativo coenzima (NADH): l’ossalacetato è stechiometricamente ridotto a malato, con ossidazione del coenzima. Il consumo del coenzima ridotto, osservato come diminuzione di estinzione nell’unita` di tempo, è direttamente proporzionale all’attività AST del campione in esame.
LDH
La determinazione quantitativa della lattato-deidrogenasi si basa sul metodo cinetico. Secondo le indicazioni della Società Tedesca di Chimica Clinica (DGKC), mettendo a reagire il piruvato con NADH e ioni idrogeno per azione della LDH si ha la conversione in l-lattato e NAD+. La velocità iniziale di ossidazione del NADH è proporzionale all’attività` catalitica della LDH.
Misurando la diminuzione di assorbenza nell’unita` di tempo a 340 nm si calcola l’attività della LDH presente nel campione (Vassault et al., 1986).
CK
La determinazione quantitativa della creatinfosfochinasi è stata ottenuta secondo il metodo cinetico in base alle raccomandazioni della Società Chimica Clinica I.F.C.C. e D.G.K.C. con NAC attivato a 37°C. La creatinchinasi catalizza la trasformazione del creatinfosfato e ADP in creatina e ATP, in seguito, alla presenza del reattivo a base di magnesio acetato, si ha la trasformazione del glucosio e ATP in ADP e glucosio-6- fosfato; quest’ultimo associato al NADP è convertito in gluconato- 6 –fosfato, NADPH e ione idrogeno. La velocità di formazione del NADPH è proporzionale all’attività catalitica della CPK e viene determinata misurando l’aumento di estinzione nell’unita` di tempo.
5.5 PARAMETRI ZOOTECNICI
5.4.1 Rilevi in vivo
In occasione dei prelievi ematici si è proceduto alla misurazione della circonferenza toracica tramite metro zootecnico per la stima del peso individuale dei soggetti; per un riscontro dei valori ottenuti è stata inoltre effettuata una pesata collettiva, tramite mezzo gommato con pianale tarato per la pesa.
5.4.2 Rilevi sulla carcassa
Al termine della macellazione, avvenuta presso il vicino macello di Stiacciole (GR), dopo che le carcasse sono state valutate per conformazione e stato d’ingrassamento secondo le normative Comunitarie, sono state rilevate alcune misure lineari (ASPA, 1991) (Fig.12):
- lunghezza della carcassa (AB), dal punto mediano del margine craniale della prima costola al margine caudale della sinfisi pubica;
- profondità del torace (CD), dal margine dorsale della quinta vertebra toracica, nel punto di articolazione con la sesta, al punto mediano del margine ventrale della prima sternebra;
- lunghezza della coscia (FA), dal margine craniale della sinfisi pubica al malleolo mediale;
- larghezza della coscia (GH), distanza misurata tra la faccia mediale e quella laterale nel punto di massima convessità;
- spessore della coscia (JH), tra il margine craniale e quello caudale della coscia vista lateralmente;
Sono stati quindi calcolati i seguenti indici:
- indice di compattezza: calcolato come peso a caldo/lunghezza della carcassa (Preziuso, 2001);
- resa a caldo: calcolata come rapporto percentuale tra peso a caldo e peso vivo;
- Fig.12_Misure di carcassa.
5.6 VALUTAZIONE DEL LIVELLO DI BENESSERE
Infine durante un sopralluogo e a seguito di un’intervista di quaranta minuti è stata compilata una scheda di valutazione del benessere su modello ANI35L e
lcolato il punteggio delle differenti situazioni di stabulazione. ca
5.7 ANALISI STATISTICA
L’elaborazione statistica è stata effettuata mediante analisi della varianza così condotta:
- per i dati climatici sono stati considerati come fattori di variabilità la stalla, il mese e il periodo della giornata (notte e dì);
- per i rilievi fisiologici la stalla e il campionamento (iniziale e finale);
- per i rilievi ponderali la stalla, l’età degli animali includendo come covariata il peso iniziale;
- per i rilievi sulla carcassa la stalla, l’età degli animali e quest’ultimo fattore entro la stalla.
