KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
Modestas Kriukelis
Meloksikamo išsiskyrimo iš tirpalų pro dializės membraną
metodo sukūrimas ir vertinimas
Farmacijos magistro diplominis darbas
KAUNAS
2008
Darbas parengtas 2007 – 2008 metais Kauno Medicinos Universitete.
Darbo vadovai:
Doc. dr. G. Drakšienė (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, farmacija – 09B); Prof. dr. V. Briedis (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, farmacija – 09 B).
Recenzentas:
Prof. habil. dr. E. Tarasevičius (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, farmacija – 09 B).
Padėka
Uţ suteiktas kokybiškas darbo sąlygas ir materialinę bazę atlikti mokslinį tiriamąjį darbą ʺMeloksikamo išsiskyrimo iš tirpalų pro dializės membraną metodo sukūrimas ir vertinimasʺ dėkoju Kauno Medicinos Universiteto Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedros
kolektyvui, Vytauto Didţiojo Universiteto Chemijos katedros vedėjui prof. habil. dr. A. Maruškai ir visam kolektyvui.
Mokslinio tiriamojo darbo temą remia:
KMU Mokslo fondo remiamas projektas „Cheminių junginių transderminio prasiskverbimo vertinimo in vitro metodo sukūrimas ir taikymas biofarmaciniuose medicininių preparatų tyrimuose bei optimizavime“.
Turinys
1. ĮVADAS ... 7
1. 1 Darbo tikslas ir uţdaviniai ... 7
1. 2 Darbo naujumas ir praktinė reikšmė ... 8
2. LITERATŪROS APŢVALGA ... 8
2. 1 Meloksikamas, jo gydomasis poveikis, struktūra ir savybės, analizė ... 8
2. 1. 1 Meloksikamo gydomasis poveikis ... 8
2. 1. 2 Meloksikamo struktūra ... 9
2. 1. 3 Meloksikamo fizikinės-cheminės savybės ... 9
2. 1. 4 Meloksikamo kokybinė ir kiekybinė analizė ... 13
2. 2 Meloksikamo struktūros įtaka prasiskverbimui pro odos barjerą ... 18
2. 3 Vaistinių medţiagų išsiskyrimo in vitro tyrimo bendrieji reikalavimai ... 21
2. 3. 1 Difuzijos celės ... 21
2. 3. 2 Sintetinės membranos ... 23
2. 3. 3 In vitro tyrimuose naudojami akceptoriniai tirpalai ... 24
2. 3. 4 Bandinio ėmimo laikas ... 25
2. 3. 5 Kiti išsiskyrimo in vitro tyrimo veiksniai ... 25
2. 4 Apibendrinimas ... 26
3. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 27
3. 1 Tyrimo medţiagos ir prietaisai... 27
3. 2 Tyrimo metodai ... 28
3. 2. 1 Meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro tyrimas ... 28
3. 2. 2 Meloksikamo kiekybinis įvertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 29
3. 2. 3 Meloksikamo prasiskverbusio pro dializės membraną koncentracijos (µg/ml), kiekio (µg) ir srauto (µg/cm/h²) įvertinimas ... 29
3. 2. 4 Tyrimo duomenų statistinė analizė ... 29
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
4. 1 Standartinių tirpalų gamyba ir kalibracinės kreivės sudarymas ... 30
4. 2 Linijiškumo analitinės charakteristikos nustatymas ... 32
4. 4 Meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro tyrimas ir jo
vertinimas ... 34
4. 5 Meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro tyrimo atkartojamumas ... 36
4. 6 Akceptorinės terpės pH reikšmės įtaka meloksikamo prasiskverbimui pro dializės membraną in vitro ... 38
5. IŠVADOS ... 41
6. SANTRAUKA ... 42
7. SUMMARY ... 43
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 44
Santrumpos
NVNU – nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo; COX-II – fermentas ciklooksigenazė-II; PG – propileno glikolis;
PEG 400 – polietileno glikolis 400;
HPLC – efektyvioji skysčių chromatografija; UV – ultravioletinis;
pKa – medţiagos rūgštingumo rodiklis; pav – paveikslas;
h – valandos; min – minutės.
1. ĮVADAS
Nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo (NVNU) plačiai vartojami skausmui malšinti, artritui gydyti, tačiau jų negalima vartoti ilgą laiką, nes tada pasireiškia šalutinės reakcijos virškinamajam traktui: dispepsija, pilvo skausmai, skrandţio ir dvylikapirštės ţarnos opos, kraujavimai, perforacijos. Šių šalutinių poveikių galima išvengti vartojant selektyvius ciklooksigenazės II (COX-II) nesteroidinius vaistus nuo uţdegimo. Daugelis tyrimų rodo, kad selektyvūs COX-II nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo yra gerokai saugesni ir juos galima ilgiau vartoti. Tačiau daugėja įrodymų, kad vartojant šiuos preparatus didėja širdies nepakankamumo simptomų pavojus, o poveikis inkstams prilygsta neselektyvių nesteroidinių priešuţdegiminių vaistų poveikiui. Ilgai ir didelėmis dozėmis vartojant nors ir selektyvius peroralinius ir parenteralinius nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo preparatus gali atsirasti virškinamojo trakto sutrikimai. Šiuo metu siekiama sukurti transdermalines selektyvių COX-II nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo vaistų formas ir taip išvengti minėtų šalutinių reakcijų [18, 19, 28, 31, 33].
Lietuvoje šiuo metu yra registruotos tik peroralinės ir parenteralinės meloksikamo vaisto formos. Meloksikamas selektyviau negu kiti tradiciniai nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo (NVNU) slopina COX-II izofermentą. Meloksikamo maţa paros terapinė dozė (15 mg), didelis vaistinės medţiagos stabilumas įvairiuose tirpikliuose, plačiai vartojamos peroralinės ir parenteralinės vaisto formos – visos šios savybės labai svarbios, kuriant meloksikamo transdermalines vaisto formas. Tačiau svarbi problema yra maţas meloksikamo tirpumas vandenyje ir kituose tirpikliuose [6, 8, 15].
1. 1 Darbo tikslas ir uţdaviniai
Šio darbo tikslas – sukurti meloksikamo išsiskyrimo iš tirpalų pro dializės membraną metodą ir jį vertinti.
Darbo uţdaviniai:
- Susipaţinus su meloksikamo struktūra, fizikinėmis-cheminėmis savybėmis, pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodo sąlygas meloksikamo kiekybiniam nustatymui.
- Pagaminti meloksikamo standarto (Reference Standard) metanolinius tirpalus (100; 75; 50; 25; 10; 5; 1; 0,5; 0,1 µg/ml koncentracijos) ir sudaryti kalibracinį kreivę.
- Parinkti išsiskyrimo in vitro metodo sąlygas.
- Atlikti meloksikamo išsiskyrimo iš tirpalų pro dializės membraną tyrimą.
- Įvertinti išsiskyrusio meloksikamo kiekį efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodu.
1. 2 Darbo naujumas ir praktinė reikšmė
Šiuo metu selektyvūs COX-II nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo yra išleidţiami tik peroralinėmis ir parenteralinėmis vaistų formomis. Europoje nėra registruotų transdermalinių selektyvių COX-II nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo vaisto formų, todėl yra aktualu jas sukurti.
Šiame darbe parinkome tinkamą analizės metodą meloksikamo kiekybiniam įvertinimui. Sukūrėme metodą in vitro meloksikamo išsiskyrimui tirti, parinkome metodo sąlygas ir įvertinome išsiskyrusios vaistinės medţiagos kiekį.
Šio darbo rezultatai bus panaudoti kuriant transdermalinės meloksikamo vaistų formos ir vertinant meloksikamo prasiskverbimą pro dializės membraną ir odos barjerą.
2. LITERATŪROS APŢVALGA
2. 1 Meloksikamas, jo gydomasis poveikis, struktūra ir savybės, analizė
2. 1. 1 Meloksikamo gydomasis poveikis
Meloksikamas (lot.k. - meloxicamum, angl.k. – meloxicam) – vienas iš nesteroidinių vaistų nuo uţdegimo (NVNU) klasės vaistų, skirtų gydyti sąnarių ligoms – osteoartritui, reumatoidiniam artritui, alkilozuojančiam spondilitui. Šis vaistas selektyviau nei kiti tradiciniai nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo (NVNU) slopina COX-II izofermentą. Klinikinėse studijose nustatyta, kad meloksikamas buvo toks pat efektyvus kaip ir piroksikamas, diklofenakas, naproksenas, bet turėjo ţymiai maţiau šalutinių poveikių. Meloksikamas maţiau slopina COX-II izofermentą nei kiti koksibai, tačiau yra selektyvesnis negu tradiciniai nesteroidiniai vaistai nuo uţdegimo (NVNU) (indometacinas, ibuprofenas ir naproksenas) [4, 6, 8, 26].
2. 1. 2 Meloksikamo struktūra
Meloksikamo cheminis pavadinimas – 4-Hidroksi-2-metil-N-(5-metil-2-tiazolil)-2H-1,2-benzotiazin-3-karboksamid-1,1-dioksidas (enolinių rūgščių grupė, oksikamo klasė) [21, 23].
1 pav. Meloksikamo formulė
Molekulinė masė – 351,39
Struktūrinė formulė - C14H13N3O4S2 [23].
2. 1. 3 Meloksikamo fizikinės-cheminės savybės
Meloksikamas yra šviesiai geltonos spalvos milteliai. Lydymosi taškas apie 243˚C. Jis praktiškai netirpsta vandenyje, tirpsta dimetilformamide, labai maţai tirpsta etanolyje (96%) [23].
Meloksikamo tirpumas grynuose tirpikliuose
Meloksikamas labai maţai tirpsta vandenyje, nes jo molekulė yra nepolinė. 1 lentelėje matome, kad meloksikamo tirpumas maţėja didėjant tirpiklio poliškumui. Taigi, tirpiklio poliškumas yra svarbus faktorius įtakojantis meloksikamo tirpumą. Meloksikamo tirpumas didėja didėjant tirpiklio hidrofobiškumui. Tačiau poliškumas ir hidrofobiškumas nėra vieninteliai faktoriai įtakojantys tirpumą. Tarp alkoholių, tirpumas nedidėja maţėjant poliškumui, ar didėjant alkoholio hidrofobiškumui; maksimalus tirpumas yra metanolyje ir maţėja ilgėjant alkoholio anglies atomų grandinei. Šis efektas parodė kad tirpiklio gebėjimas suformuoti vandenilinius ryšius su heteroatomais vaisto molekulėje yra kitas svarbus faktorius įtakojantis meloksikamo tirpumą alkoholiuose. Didesnis meloksikamo tirpumas etanolyje negu etileno glikolyje parodo, kad tirpumas taip pat įtakojamas tarpmolekulinės sąveikos tarp tirpiklio molekulių, kuri yra stipresnė glikoliuose
nei alkoholiuose. Didelis meloksikamo tirpumas polietileno glikolyje (PEG) 400 tikriausiai yra dėl didelės hidrofobinės sąveikos su tirpikliu, nes polietileno glikolis (PEG) 400 turi ilgą nepolinę dalį lyginant su kitais tirpikliais [21, 30].
1 lentelė. Meloksikamo tirpumas skirtinguose tirpikliuose prie 25˚C. Tirpiklis Meloksikamo tirpumas(mg/ml)
Vanduo 0,012 Glicerolis 0,138 Metanolis 0,382 Etanolis 0,354 Butanolis 0,285 Oktanolis 0,187 Etileno glikolis 0,094 Propileno glikolis (PG) 0,307
Polietileno glikolis (PEG) 400 3,763
Meloksikamo tirpumas tirpiklių mišiniuose
Meloksikamo tirpumas grynuose tirpikliuose yra maţas, todėl siekiant pagerinti meloksikamo tirpumą tyrimuose buvo naudojami įvairių tirpiklių mišiniai ir vertinamas meloksikamo tirpumas juose. Naudojant tirpiklių mišinius galima ţymiai pagerinti meloksikamo tirpumą. 2 lentelėje pateikiami meloksikamo tirpumo duomenys glicerolio – etanolio mišinyje. Meloksikamo tirpumas glicerolyje yra 0,138 mg/ml, etanolyje - 0,354 mg/ml. Tačiau panaudojus glicerolio – etanolio mišinį (santykiu 40:60) galima meloksikamo tirpumą padidinti iki 0,484 mg/ml [21].
2 lentelė. Meloksikamo tirpumas glicerolio-etanolio mišinyje prie 25˚C. Silpnesnis tirpiklis % Stipresnis tirpiklis % Dielektrinė
konstanta (ε) Meloksikamo tirpumas (mg/ml) Glicerolis Etanolis 100 0 42,50 0,138 90 10 40,68 0,298 80 20 38,86 0,392 60 40 35,22 0,403 40 60 31,58 0,484 20 80 27,94 0,407 10 90 26,12 0,372 0 100 24,30 0,354
3 lentelėje pateikiami meloksikamo tirpumo duomenys etanolio ir polietileno glikolio (PEG) 400 mišinyje. Meloksikamo tirpumas etanolio ir polietileno glikolio (PEG) 400 mišinyje santykiu 80:20 yra tik 0,783 mg/ml, tačiau naudojant etanolio ir polietileno glikolio (PEG) 400 mišinį santykiu 10:90 tirpumas padidėja iki 4,023 mg/ml. Tuo tarpu gryname polietileno glikolyje (PEG) 400 meloksikamo tirpumas yra šiek tiek maţesnis (3,763 mg/ml) [21].
3 lentelė. Meloksikamo tirpumas polietileno glikolio-etanolio mišinyje prie 25˚C. Silpnesnis tirpiklis % Stipresnis tirpiklis % Dielektrinė
konstanta (ε) Meloksikamo tirpumas (mg/ml) Etanolis PEG-400 100 0 24,30 0,354 80 20 21,92 0,783 60 40 19,54 1,610 40 60 17,16 2,730 20 80 14,78 3,842 10 90 13,59 4,023 0 100 12,40 3,763
4 lentelėje pateikiami meloksikamo tirpumo vandens ir etanolio mišinyje duomenys. Naudojant vandens ir etanolio mišinį santykiu 90:10 meloksikamo tirpumas yra 0,042 mg/ml, o santykiu 10:90 - 0,298 mg/ml. Taigi vandens ir etanolio mišiniuose meloksikamo tirpumas nepagerėjo dėl didelių mišinių dielektrinių konstantų (ε) [21].
4 lentelė. Meloksikamo tirpumas etanolio-vandens mišinyje prie 25˚C. Silpnesnis tirpiklis % Stipresnis tirpiklis % Dielektrinė
konstanta (ε) Meloksikamo tirpumas (mg/ml) Vanduo Etanolis 100 0 78,36 0,012 90 10 72,95 0,042 80 20 67,55 0,051 60 40 56,74 0,061 40 60 45,92 0,134 20 80 35,11 0,255 10 90 29,71 0,298 0 100 24,30 0,354
Kotirpiklių pridėjimas yra nepaprastai efektyvus būdas norint padidinti menkai tirpstančių vaistų tirpumą. Maţa nepolinė angliavandenilių sritis kotirpikliuose gali susilpninti vandeninės sistemos galimybę suspausti nepolinį tirpinį. Daţniausiai tirpumas didėja maţėjant mišinio dielektriniai konstantai (ε) tik iki tam tikros stipresnio tirpiklio (juo pasirenkamas tas, kuriame gryname geriau tirpsta meloksikamas) koncentracijos, virš kurios tirpumas maţėja [21].
pH reikšmės įtaka meloksikamo tirpumui
Meloksikamo tirpumas vandeniniuose tirpikliuose esant rūgščiai terpei yra maţas. 5 lentelės duomenys parodo kaip keičiasi meloksikamo tirpumas didėjant pH reikšmei nuo 7 iki 10,9 naudojant 00,5M glicino-NaOH buferio tirpalą. Meloksikamo tirpumas polietileno glikolyje (PEG) 400 gali padidėti iki 12 mg/ml tirpinant medţiagą polietileno glikolio (PEG) 400 ir fosfatinio buferio mišinyje santykiu 40:60. Meloksikamo tirpumas didėjima, didėjant pH reikšmei [2, 21]. 5 lentelė. Meloksikamo tirpumas glicino-NaOH buferio tirpale prie skirtingų pH reikšmių.
pH reikšmė Meloksikamo tirpumas (mg/ml)
7,40 0,062 7,60 0,233 8,68 1,260 9,58 2,615 9,85 5,755 10,68 17,900
2. 1. 4 Meloksikamo kokybinė ir kiekybinė analizė
Meloksikamo grynumo ir priemaišų nustatymas
Meloksikamo grynumas ir priemaišos nustatomos naudojant skysčių chromatografiją.
Atlikimo metodika:
Tiriamasis tirpalas. Ištirpinam 40 mg tiriamosios medţiagos mišinyje iš 5 ml metanolio R ir 0,3 ml
1M natrio hidroksido ir skiedţiam iki 20,0 ml su metanoliu R.
Etaloninis tirpalas (a). Praskiedţiam 2,0 ml tiriamosios medţiagos iki 100,0 ml metanoliu R. Po to
5,0 ml gauto tirpalo praskiedţiam metanoliu R iki 100,0 ml.
Etaloninis tirpalas (b). Ištirpinam 2 mg tiriamosios medţiagos, 2 mg meloksikamo priemaišos A
CRS, 2 mg meloksikamo priemaišos B CRS, 2 mg meloksikamo priemaišos C CRS ir 2 mg meloksikamo priemaišos D CRS mišinyje iš 5 ml metanolio R ir 0,3 ml 1M natrio hidroksido ir praskiedţiam metanoliu R iki 25 ml [23].
Kolonėlė:
- dydis: l=0,15 m,Ø=4,6 mm;
- nejudanti fazė: oktadecilsilil silika gelis chromatografijai R (5 µm); - temperatūra: 45˚C.
Judanti fazė:
- judanti fazė A: 1 g/l kalio divandenilio fosfato R tirpalo koreguojant pH iki 6,0 su 1M natrio hidroksidu;
- judanti fazė B: metanolis R; [23]
Laikas (min) Judanti fazė A (% V/V) Judanti fazė B (% V/V)
0-2 60 40
2-10 60→30 40→70
10-15 30 70
Tekėjimo greitis: 1,0 ml/min.
Detekcija: spektrofotometrija prie 260 nm ir 350 nm. Injekcija: 10µl.
Santykinis sulaikymas su meloksikamo standartu (sulaikymo laikas = apie 7 min): priemaiša B = apie 0,5; priemaiša A = apie 1,4; priemaiša C = apie 1,7; priemaiša D = apie 1,9.
- atsiskyrimas: minimumas 3,0 tarp meloksikamo ir priemaišos A pikų prie 350 nm; minimumas 3,0 tarp priemaišos B ir meloksikamo pikų prie 260 nm [23].
Limitai:
- koregavimo faktorius: dėl turinio apskaičiavimo, padauginti priemaišos A piko plotą iš 2; - priemaiša A prie 350 nm: ne didesnis negu pagrindinio piko plotas chromatogramoje išgautoje
su etaloniniu tirpalu (a) prie 350 nm (0,1%);
- priemaiša B prie 260 nm: ne didesnis negu pagrindinio piko plotas chromatogramoje išgautoje su etaloniniu tirpalu (a) prie 260 nm (0,1%);
- priemaišos C, D prie 350 nm: kiekvienai priemaišai ne daugiau kaip 0,5 karto pagrindinio piko ploto chromatogramoje išgautoje su etaloniniu tirpalu (a) prie 350 nm (0,05%);
- nenustatytos priemaišos: kiekvienai priemaišai ne didesnis negu pagrindinio piko plotas chromatogramoje išgautoje su etaloniniu tirpalu (a) prie bangos ilgio duodančio aukščiausią reikšmę (0,10%);
- suma: ne daugiau kaip 0,3%;
- nepaisymo limitas: 0,3 karto pagrindinio piko ploto chromatogramoje išgautoje su etaloniniu tirpalu (a) prie to paties bangos ilgio (0,03%) [23].
Specifikuotos priemaišos: A, B, C ir D.
Priemaiša A: etil 4-hidroksi-2-metil-2H-1,2-benzotiazin-3-karboksilat 1,1-dioksidas. Priemaiša B: 5-metil-1,3-tiazol-2-aminas.
Priemaiša C:
N-[(2Z)-3,5-dimetil-1,3-tiazol-2(3H)-iliden]-4-hidroksi-2-metil-2H-1,2-benzotiazin-3-karboksamid 1,1-dioksidas.
Priemaiša D:
1. priemaiša B 2.meloksikamas 3.priemaiša A 4.neţinoma priemaiša 5.priemaiša C 6.priemaiša D.
2 pav. Giminingų meloksikamui medţiagų chromatograma: etaloninis tirpalas (b) prie 260 nm.
1.meloksikamas 2.priemaiša A 3.neţinoma priemaiša 4.priemaiša C 5.priemaiša D.
3 pav. Giminingų meloksikamui medţiagų chromatograma: etaloninis tirpalas (b) prie 350 nm.
Taip pat nustatomas infraraudonasis spektras, sunkieji metalai, nuostolai dţiovinant ir sulfatuotų pelenų kiekis [23].
Infraraudonasis spektras: nustant infraraudonąjį spektrą palyginimui naudojamas
4 pav. Meloksikamo infraraudonasis spektras.
Sunkieji metalai: maksimaliai 20 ppm.
2,0 g laikom su testu C. Paruošiam etaloninį tirpalą naudojant 2 ml švino standartinio tirpalo (10 ppm Pb) R.
Nuostoliai džiovinant: maksimaliai 0,5%, nustatoma 1,00 g dţiovinant orkaitėje 100-105˚C
temperatūroje 4 valandas.
Sulfatuoti pelenai: maksimaliai 0,1%, nustatoma naudojant 1,0 g medţiagos [23].
Meloksikamo kiekybinė analizė
Meloksikamo kiekybinį įvertinimą galima atlikti įvairiais analizės metodais. Grynas meloksikamas kiekybiškai nustatomas bevandenio titravimo metodu [23]. Meloksikamą ir jo druskas kiekybiškai nustatyti galima naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą (HPLC), UV spektrofotometriją. Pateikiamos meloksikamo kiekybinio įvertinimo įvairių analizės metodų atlikimo metodikos.
Bevandenio titravimo atlikimo metodika:
Ištirpinam 0,250 g tiriamosios medţiagos mišinyje iš 5 ml bevandenės skruzdţių rūgšties R ir 50 ml bevandenės acto rūgšties R. Titruojam 0,1M perchlorato rūgštimi, pabaigos taškas nustatomas potenciometriškai. 1 ml 0,1M perchlorato rūgšties yra ekvivalentiškas 35,14 mg meloksikamo [23].
Efektyviosios skysčių chromatografijos atlikimo metodikos
Pirmoji metodika:
Naudojama kolonėlė C8 (4,6×150 mm, dalelių dydis 5 μm). Kolonėlės temperatūra 30°C buvo palaikoma naudojant ploną folijos temperatūrinį reguliatorių. Judanti fazė metanolis/vanduo/fosforo rūgštis (700/299/1). Eliuento tekėjimo greitis 1 ml/min. UV detektoriaus bangos ilgis buvo 320 nm [10].
Antroji metodika:
Naudojama kolonėlė C18 (4,6×100 mm, dalelių dydis 3 μm). Kolonėlės temperatūra palaikoma 12°C. Judanti fazė metanolis/vanduo/fosforo rūgštis (69,9/30/0,1). Eliuento tekėjimo greitis 1ml/min. Detektoriaus bangos ilgis 370 nm. Injekuojamas tūris 20 μl. Būdingas sulaikymo laikas 2,8-3,1 min [14].
Trečioji metodika:
Naudojama kolonėlė C18 (55×4 mm, dalelių dydis 3 µm). Piroksikamas naudojamas kaip vidinis standartas. Judanti fazė – mišinys iš 0,05M diamonio fosfato (koreguojant pH iki 6,5 fosforo rūgštimi) ir metanolio santykiu 55:45, tekėjimo greitis 1 ml/min. UV detektoriaus bangos ilgis 365 nm. Nustatymo riba 0,025 µg/ml [15].
UV spektrofotometrijos atlikimo metodika:
Paruošiamas standartinis meloksikamo tirpalas metanolyje (250 µg/ml). Stebimas tirpalo stabilumas jį laikant +4°C temperatūroje maţiausiai du mėnesius. Po to imama 5 ml standartinio tirpalo ir naudojant 100 mM boratinį buferį (pH 8,5) pagaminami 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 15; 20; 25; 30 µg/ml tirpalai. Matuojama šių tirpalų absorbcija prie 363 nm. Sudaromas kalibracinis grafikas. 5 pav. pateikiamas meloksikamo UV spektras (15mg/ml) 100mM boratinio buferio (pH 8,5) tirpale [5].
Absorbcija
Bangos ilgis nm
2. 2 Meloksikamo struktūros įtaka prasiskverbimui pro odos barjerą
Įvedant vaistines medţiagas pro odą išvengiama perėjimo per virškinamąjį traktą bei kepenų metabolizmo, sumaţėja galimybė pasireikšti šalutiniams poveikiams, pagerėja bioprieinamumas, maţėja vaisto dozės ir išvengiama vaisto vartojimo nutraukimo problemų lyginant su kitomis vaistų formomis [9, 17, 24].
Vaisto gebėjimas prasiskverbti pro odos epidermio, dermos ir poodinių riebalų sluoksnius priklauso nuo vaisto fizikinių-cheminių savybių, vaisto nešėjo ir vaisto kontakto su negyvomis odos ląstelėmis, mikroorganizmais, odos riebalais ir kitomis medţiagomis. Skiriami trys pagrindiniai keliai kuriais vaistinės medţiagos gali patekti į gilesnius odos sluoksnius: per prakaito liaukas, per plaukų folikulus ir su jais susijusias riebalų liaukas ir per raginį odos sluoksnį. Tačiau epidermis yra pagrindinis barjeras, kuris trukdo vaistinėms medţiagoms patekti į gilesnius odos sluoksnius [1, 3, 20, 32].
Meloksikamo transderminis panaudojimas yra problematiškas dėl jo fizikinių-cheminių savybių. Meloksikamas yra dipolinis (cviterjoninis) vaistas su dviem pKa reikšmėmis (pKa1=1,09; pKa2=4,18) kaip parodyta 6paveiksle [10].
Anijoninė forma Dipolinė forma Katijoninė forma
6 pav. Anijoninės, dipolinės ir katijoninės meloksikamo formų struktūros.
Dauguma dipolinių (cviterjoninių) vaistų turi santykinai aukštą lydymosi tašką, maţą tirpumą poliniuose ir nepoliniuose tirpikliuose ir maţą lipofiliškumą dėl esamo didelio molekulių vidinio daugiapoliškumo. Taigi, būdingos dipolinių (cviterjoninių) vaistų savybės padaro juos netinkamus transderminiam vaistų pristatymui [10].
Yra keletas būdų kaip pagerinti dipolinių (cviterjoninių) vaistų prasiskverbimą pro odą. Vienas iš tokių būdų yra lipofilinio jono poros suformavimas pridedant priešingai įkrautas atmainas.
Šie jono poros dariniai paprastai turi maţesnį dipolį ir ţemesnę kristalinės gardelės energiją, kurie įtakoja didesnį tirpumą poliniuose ir nepoliniuose tirpikliuose. Be to, šie fizikinių-cheminių savybių pakeitimai gali pagerinti dipolinių (cviterjoninių) vaistų prasiskverbimą pro odą be vaisto struktūros modifikacijos [10].
Siekiant pagerinti meloksikamo tirpumą bei praeinamumą per transderminį barjerą buvo paruoštos meloksikamo ir meloksikamo monoetanolamino, dietanolamino ir trietanolamino druskos bei atlikti šių druskų tirpumo įvairiuose tirpikliuose tyrimai [10].
Meloksikamo ir meloksikamo-etanolamino druskų tirpumai yra nurodyti 6lentelėje. Po to kai buvo sudaryta meloksikamo druska su monoetanolaminu, tirpumas daugelyje tirtų tirpiklių pagerėjo, išskyrus cineolį, Crovol® A 70 (PEG-60 migdolų gliceridas), Tween® 20 (polioksietilen sorbitan monolauratas), Crodamol® IPM (izopropilo miristatas) ir Labrafac® PG (propileno glikol kaprilatas/kapratas). Meloksikamo tirpumas taip pat pagerėjo po druskos suformavimo su dietanolaminu daugelyje tirtų tirpiklių. Tačiau meloksikamo-dietanolamino druskos tirpumas Crovol® PK 40 (PEG-12 palmių branduolio gliceridas), Crovol® EP 40 (PEG-2 vakarinių raktaţolių gliceridas), Crovol® A 70 (PEG-60 migdolų gliceridas), Labrafil® 2609 (PEG-8 gliceril linolatas), Crodamol® IPM (izopropilo miristatas), Labrafac® PG (propileno glikol kaprilatas/kapratas) ar PPG 400 šiek tiek sumaţėjo. Nors meloksikamo-monoetanolamino ir meloksikamo-dietanolamino druskų tirpumas buvo didesnis nei gryno meloksikamo daugelyje tirtų tirpiklių, meloksikamo-trietanolamino druskos tirpumas buvo maţesnis daugelyje tirtų tirpiklių nei gryno meloksikamo, išskyrus Crovol® A 40 (PEG-2 migdolų gliceridas) ir propileno glikolyje [10, 11].
6 lentelė. Meloksikamo ir meloksikamo etanolamino druskų tirpumas įvairiuose tirpikliuose.
Tirpiklis Tirpumas (mg/ml) Meloksikamas Meloksikamo-monoetanolamino druska Meloksikamo-dietanolamino druska Meloksikamo-trietanolamino druska Cineolis 0,07±0,01 0,10±0,01 0,10±0,02 0,06±0,01 Crovol® PK 40 (PEG-12 palmių branduolio gliceridas) 4,61±0,51 47,25±1,72 3,89±0,08 1,15±0,12 Labrafil® 2609 (PEG-8 gliceril linolatas) 0,76±0,13 33,47±0,23 0,74±0,07 0,15±0,02 Span® 80 (sorbitano monooleatas) 0,50±0,13 14,75±0,77 1,96±0,22 0,40±0,07
6 lentelės tęsinys. Tirpiklis Tirpumas (mg/ml) Meloksikamas Meloksikamo-monoetanolamino druska Meloksikamo-dietanolamino druska Meloksikamo-trietanolamino druska Crovol® EP 40 (PEG-2 vakarinių raktaţolių gliceridas) 7,26±0,73 9,28±1,54 7,10±0,29 3,64±0,11 Crovol® A 40 (PEG-2 migdolų gliceridas) 3,10±0,21 79,61±2,35 8,88±0,93 5,02±0,34 Propileno glikolis 0,28±0,05 10,02±0,59 17,13±0,43 5,18±0,36 Plural oleique® (poligliceril-3 oleatas) 0,53±0,08 12,24±0,04 1,11±0,07 0,15±0,01 Crovol® A 70 (PEG-60 migdolų gliceridas) 8,45±0,31 8,45±0,1 7,72±0,04 4,86±0,01 PEG 300 (polietileno glikolis 300) 3,62±0,06 144,70±0,63 30,00±1,76 2,86±0,01 Tween® 20 (polioksietilen sorbitan monolauratas) 8,17±0,76 8,67±2,22 9,71±0,90 4,07±0,006 Crodamol® IPM (izopropilo miristatas) 0,08±0,0005 0,01±0,0003 0,002±0,0007 0,0002±0,0001 Labrafac® PG (propileno glikol kaprilatas/kapratas) 0,27±0,01 0,20±0,004 0,003±0,0005 0,002±0,0008 Labrasol® (PEG-8 gliceril kaprilatas/kapratas) 2,75±0,03 175,77±15,39 4,29±0,09 0,95±0,10 Tween® 80 (polioksietilen sorbitan monooleatas) 5,42±0,03 137,54±2,39 8,45±0,001 3,18±0,001 PPG 400 (polipropileno glikolis 400) 0,74±0,05 6,51±0,52 0,18±0,06 0,16±0,007
2. 3 Vaistinių medţiagų išsiskyrimo in vitro tyrimo bendrieji reikalavimai
Farmakopėjose nėra nurodytų reikalavimų, aparatūros ir atlikimo metodikų in vitro vaistinių medţiagų atsipalaidavimo tyrimams. Publikuojami tik bendrieji reikalavimai ir sąlygos norint atlikti vaistinių medţiagų in vitro atsipalaidavimo tyrimus. Svarbiausi išsiskyrimo in vitro tyrimo veiksniai yra difuzijos celė, sintetinė membrana, akceptorinis tirpalas, bandinio ėmimo laikas, donorinio tirpalo kiekis ir temperatūra [27].
2. 3. 1 Difuzijos celės
In vitro vaistinių medţiagų atsipalaidavimo tyrimai iš pusiau kietų kosmetinių ir vaistinių preparatų (kremai, tepalai, geliai) naudojamos difuzijos celės. Jos daţniausiai gaminamos iš inertiškos medţiagos (daţniausiai stiklo ar politetrafluoretileno) norint iki minimumo sumaţinti sąveiką su tiriamąja medţiaga. Difuzijos celės turi pasiţymėti geru sandarumu aplink sintetinę membraną, taip pat suteikti galimybę gerai išmaišyti mėginį bei lengvai paimti bandinį iš akceptoriaus kameros skysčio. Daţniausiai naudojamos Franz tipo ir Enhancer difuzijos celės, kartai eksperimentai atliekami su abiejų tipų celėmis ir gauti duomenys palyginami [15, 16, 22, 25, 27, 34].
Franz tipo difuzinės celės yra statinės vienos kameros difuzinės celės. Yra daugybė Franz tipo difuzinės celės modifikacijų, tačiau visos jos turi tą pačią konstrukciją. Pagrindiniai Franz tipo difuzinės celės modifikacijų skirtumai yra akceptoriaus kameros tūris ir receptoriaus kameros angos diametras (plotas per kurį vyksta prasiskverbimas) [13, 15, 16].
In vitro vaistinių medţiagų atsipalaidavimo tyrimuose galima naudoti Franz tipo, Enhancer
difuzijos celės (7 ir 8 pav. parodyta Enhancer ir Franz difuzijos schemos) bei kitokios konstrukcijos difuzines celes [16, 25, 34].
7 pav. Franz difuzijos celės schema.
2. 3. 2 Sintetinės membranos
Difuzijos celėse in vitro atsipalaidavimo tyrimuose daţniausiai naudojama sintetinė membrana. Membranos pasirinkimas priklauso nuo tiriamojo produkto savybių (molekulių dydţio, aplinkos pH reikšmės, tyrimo metu palaikomos temperatūros) [27].
Sintetinių membranų pasirinkimas yra didelis. Tačiau sintetinės membranos daţniausiai gaminamos iš politetrafluoretileno, įvairių celiuliozės darinių, regeneruotos celiuliozės, polivinylideno difluorido, izopropilo miristato, silikono ir kt. Tačiau sintetinės membranos skiriasi savo charakteristikomis. Pagrindinės sintetinių membranų charakteristikos yra: sintetinių membranų porų dydis, kuris išreiškiamas atskiriama molekuline mase (išreiškiama daltonais), organinis atsparumas, pH reikšmės ribos ir temperatūros ribos. 7 lentelėje nurodytos pagrindinės plačiausiai naudojamų sintetinių membranų charakteristikos. Remiantis 7 lentelės duomenimis didţiausiu organiniu atsparumu, plačiausiomis pH reikšmės ir temperatūrinėmis ribomis pasiţymi regeneruotos celiuliozės ir polivinylideno difluorido membranos, o celiuliozės esterio membranos organinis atsparumas yra vidutinis, pH reikšmės ir temperatūrinės ribos yra siauros [1, 7, 12]. 7 lentelė. Difuzijos membranų pagrindinės charakteristikos.
Membranos tipas Celiuliozės esterio membrana
Regeneruotos celiuliozės membrana
Polivinylideno difluorido membrana Porų dydis (daltonais)* 100, 500, 1K, 2K,
3,5K, 5K, 8K, 10K, 15K, 25K, 50K, 100K 1K, 2K, 3,5K, 5K, 6-8K, 10K, 12-14K, 15K, 25K, 50K 250K, 500K
Organinis atsparumas Vidutiniškas Geras Labai geras
pH ribos 2-9 2-12 1-14
Temperatūros riba 37°C 60°C 130°C
*Membranų porų dydis išreiškiamas atskiriama molekuline mase.
Be anksčiau minėtų sintetinių membranų charakteristikų labai svarbu yra membranų atsparumas cheminėms medţiagoms, nes netinkamai parinkus sintetinę membraną ji gali tyrimo metu suirti. Sintetinių membranų atsparumą cheminėms medţiagoms įtakoją temperatūra, cheminės medţiagos koncentracija, tyrimo laikas ir kiti faktoriai. Todėl sintetinių membranų gamintojai pateikia rekomendacijas kokias sintetines membranas rekomenduojama naudoti su tam tikromis medţiagomis. Kaip matome 8 lentelėje celiuliozės esterio membranos nerekomenduojama naudoti su etilo alkoholiu (95 %) ir etileno glikoliu, o kitos membranos yra atsparios šioms medţiagoms [12].
8 lentelė. Įvairių membranų cheminis atsparumas medţiagoms. Cheminės medţiagos pavadinimas Membrana Celiuliozės esterio membrana Regeneruotos celiuliozės membrana Polipropileno membrana Polivinylideno difluorido membrana Etilo alkoholis (15%) R R R R Etilo alkoholis (95%) RN R R R Etileno glikolis RN R R R Glicerolis R R R R Mineraliniai aliejai R R R R Propanolis R R R R Vanduo R R R R
R - rekomenduojama naudoti, RN – ribotas naudojimas.
2. 3. 3 In vitro tyrimuose naudojami akceptoriniai tirpalai
Tyrimo metu siekiama naudoti tokį akceptorinį tirpalą, kad tyrimo sąlygos būtų kuo panašesnės į fiziologines odos sąlygas. Taip pat yra labai svarbu išsiskyrusios medţiagos kiekį įvertinti kuo tiksliau. Svarbiausias veiksnys parenkant akceptorinį tirpalą yra tiriamos madţiagos tirpumas akceptoriniame tirpale. Priklausomai nuo tiriamos vaistinės medţiagos tirpumo galima naudoti vandeninį buferį (vandenyje tirpioms vaistinėms medţiagoms), taip pat į akceptorinį tirpalą galima pridėti tam tikrą kiekį alkoholio ir/ar paviršiui aktyvių medţiagų (ribotai vandenyje tirpstančioms vaistinėms medţiagoms). Kitas svarbus veiksnys yra akceptorinio tirpalo pH reikšmė. Parenkant akceptorinio tirpalo pH reikšmę svarbu atsiţvelgti į tiriamo preparato pH reikšmę, pH reikšmės įtaką tiriamos vaistinės medţiagos tirpumui ir naudojamos sintetinės membranos pH reikšmę [7, 27, 29].
Long Island Universiteto mokslininkai R. Jantharaprapap ir G. Stagni tirdami prasiskverbimo greitintojų įtaką meloksikamo gelių in vitro prasiskverbimui per celiuliozės membraną, prisotintą izopropilo miristatu kaip akceptorinį tirpalą naudojo Dulbecco‘s fosfato buferinį tirpalą (DPBS), kurio pH reikšmė 7,4. Kaohsiung Medicinos Universiteto mokslininkai Jui-Sheng Chang, Pao-Chu
Wu, Yaw-Bin Huang, Yi-Hung Tsai tirdami meloksikamo gelių prasiskverbimą pro odą kaip akceptorinį tirpalą naudojo fosfatinį buferį (pH reikšmė 7,4), turinčio 20 proc. etanolio ir 20 proc. propileno glikolio [14, 15].
2. 3. 4 Bandinio ėmimo laikas
Atliekant vaistinių medţiagų išsiskyrimo in vitro tyrimus būtina nusistatyti bandinio ėmimo periodiškumą (pvz. 6 valandų tyrimo laikas su nemaţiau nei 5 bandinių ėmimu (po 30 minučių, po 1, 2, 4 ir 6 valandų)). Paėmus bandinį būtina įpilti tokį patį švieţio akceptorinio tirpalo tūrį koks buvo paimtas. Galima tyrimą atlikti ir trumpesnį laiką (pvz. 3 valandas), tačiau tuomet rekomenduojama daţniau imti bandinius (automatizuojant bandinių ėmimą) [7].
Long Island Universiteto mokslininkai R. Jantharaprapap ir G. Stagni tirdami prasiskverbimo greitintojų įtaką meloksikamo gelių in vitro prasiskverbimui per celiuliozės membraną, prisotintą izopropilo miristatu bandinius ėmė po 15, 30, 45 min ir 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 ir 8 valandų. Louisiana Universitete mokslininkai W. Liebenberg, E. Engelbrecht, A. Wessels ir kt. atlikdami medţiagų išsiskyrimo iš pusiau kietų kosmetinių preparatų in vitro tyrimus mėginius ėmė po 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 ir 6 valandų [14, 16].
2. 3. 5 Kiti išsiskyrimo in vitro tyrimo veiksniai
Temperatūra ir donorinio tirpalo kiekis yra svarbūs išsiskyrimo in vitro tyrimo veiksniai. Reikiamos temperatūros palaikymui daţniausiai naudojamos įvairios konstrukcijos vandens vonelės ar šildymo blokai. Temperatūros pasirinkimas priklauso nuo tiriamųjų preparatų paskirties. Transdermalinių preparatų išsiskyrimo in vitro tyrimai daţniausiai atliekami esant 32°C temperatūrai, imituojant normalias odos sąlygas [27].
Donorinio tirpalo kiekis priklauso nuo naudojamos membranos ploto, nes vaistinės medţiagos išsiskyrimas priklauso nuo vaistinio preparato uţdėto ant membranos sluoksnio storio. Kaohsiung Medicinos Universiteto mokslininkai Jui-Sheng Chang, Pao-Chu Wu, Yaw-Bin Huang, Yi-Hung Tsai tirdami meloksikamo gelius į donorinę kamerą talpino 3 g meloksikamo gelio, kai membranos plotas buvo 3,46 cm². Long Island Universiteto mokslininkai R. Jantharaprapap ir G. Stagni tirdami prasiskverbimo greitintojų įtaką meloksikamo gelių in vitro prasiskverbimui per celiuliozės membraną į donorinę kamerą dėjo 0,5 g tiriamojo preparato, o membranos plotas buvo 1,76 cm² [14, 15].
2. 4 Apibendrinimas
1. Meloksikamas yra perspektyvus, selektyvus COX-II nesteroidinis vaistas nuo uţdegimo naudojamas maţomis terapinėmis paros dozėmis. Šiuo metu yra registruotos tik geriamosios ir injekcinės šio vaisto formos, todėl yra aktualu sukurti transdermalines šios vaistinės medţiagos vaistų formas.
2. Meloksikamo tirpumas įtakoja jo praeinamumą pro transdermalinį barjerą, todėl kuriant transdermalines šios vaistinės medţiagos formas yra aktualu pagerinti meloksikamo tirpumą. Meloksikamo tirpumą galima pagerinti naudojant įvairių tirpiklių mišinius, stipriai šarminant jo tirpalus, sudarant įvairias meloksikamo ir kitų medţiagų druskas. 3. Išanalizavus literatūrą nustatėme, kad meloksikamo kiekybinę analizę galima atlikti
efektyviosios skysčių chromatografijos, UV spektrofotometrijos metodais.
4. Meloksikamo in vitro išsiskyrimo tyrimui atlikti gali būti naudojamos Franz tipo, Enhancer ar kitos modifikacijos difuzinės celės. Membranos, akceptorinio tirpalo, donorinio tirpalo kiekio pasirinkimas priklauso nuo tiriamos medţiagos savybių (tirpumo, molekulės dydţio, pH reikšmė, tyrimo metu palaikomos temperatūros ir kt.).
3. EKSPERIMENTINĖ DALIS
Šio darbo metu buvo kuriamas meloksikamo atpalaidavimo iš tirpalų pro dializės membraną metodas ir vertinamas praėjusio meloksikamo kiekis.
Darbe pritaikėme efektyviosios skysčių chromatografijos sistemą meloksikamo kiekybiniam įvertinimui. Buvo pagaminti meloksikamo tirpalai ir atlikta kiekybinė analizė, sudaryta kalibracinė kreivė. Darbe buvo tiriamas meloksikamo tirpumas ir pH reikšmės įtaka tirpumui, tiriamas gauto tirpalo perėjimas pro dializės membraną ir įvertintas praėjusio meloksikamo kiekis.
3. 1 Tyrimo medţiagos ir prietaisai
Darbe naudotos šios medžiagos:
• Metanolis (BÁRTA a CIHLÁŔ, Čekija)
• Meloksikamas, Reference Standard (USP, Rockville, JAV) • Meloksikamas (Derivados Quimicos, Italija)
• NaOH 10 proc. tirpalas Ph. Eur. 01/2005:0677
• Propileno glikolis (1,2 – propandiolis) (Carl Roth GmbH, Vokietija) • Trifluoracto rūgštis (MERCK – Schuchardt, Hohenbrunn, Vokietija) • Buferinis tirpalas pH 8,50±0,02 (BDH, Anglija)
• Buferinis tirpalas pH 9,00±0,02 (BDH, Anglija) • Buferinis tirpalas pH 7,00±0,02 (BDH, Anglija)
• Dializės membrana Biotech Regenerated Cellulose (RC) Membrane (Nyderlandai)
Darbe naudoti šie prietaisai:
• Efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) sistema (Perkin Elmer, JAV) - UV detektorius Spectra 200 (Spectra – Physics)
- Degazatorius Hewlett Packard Series 1100, G1322A - Siurblys Hewlett Packard Series 1100, G1310A
• Ultragarso vonelė Cole – Parmer (Cole – Parmer Instrument Company, Ilinojus, JAV) • Analitinės svarstyklės GX-200-EC (A&D Instruments, Japonija)
• Vandens vonelė Grant GD100 (Grant Instruments, Kembridţas, Anglija) • Automatinės pipetės (Transferpette, Vokietija)
3. 2 Tyrimo metodai
3. 2. 1 Meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro tyrimas
Meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro tyrimas atliekamas difuzijos celėje. Difuzijos celės schema pavaizduota 9 pav. Donorinio (tiriamojo) tirpalo (1 proc. meloksikamo propileno glikolio (PG) tirpalas) tūris 0,5 ml. Akceptorinio tirpalo (buferinis tirpalas pH 8,50±0,02) tūris 30 ml. Akceptorinis tirpalas buvo parinktas remiantis tiriamojo tirpalo pH (tiriamojo tirpalo pH reikšmė 11,5 ir akceptorinio tirpalo pH reikšmė buvo pasirinktas kiek galima artimesnis, kad perėjęs meloksikamas ištirptų akceptoriniame tirpale). Dializės membranos kontaktuojančios su akceptoriniu tirpalu plotas 1,76 cm². Dializės membrana buvo pasirinkta remiantis pH reikšmės ribomis ir temperatūros ribomis. Buvo naudojama regeneruotos celiuliozės membrana, kurios pH reikšmių ribos 2 – 12 ir temperatūros ribos iki 60°C. Tyrimo metu buvo naudojamos 6 difuzinės celės. Difuzinės celės buvo patalpintos vandens vonelėje, kurioje įmontuota maišyklė. Vandens vonelėje buvo palaikoma temperatūra 37±1°C. Bandiniai (1 ml) buvo imami po 15, 30, 60, 120, 180 ir 300 minučių ir kiekvieną kartą paėmus bandinį buvo pripilama po 1 ml akceptorinio tirpalo.
3. 2. 2 Meloksikamo kiekybinis įvertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Meloksikamo kiekybinis įvertinimas buvo atliekamas naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją (HPLC). Naudojama kolonėlė C18 (100×4 mm, dalelių dydis 3 µm). Judanti fazė 55 proc. metanolis parūgštintas 0,05 proc. trifluoracto rūgštimi. Judančios fazės tekėjimo greitis 0,5 ml/min. Injekcijos tūris – 4 µl. Naudojamas UV detektoriaus bangos ilgis 320 nm. Meloksikamo sulaikymo laikas 10 min.
3. 2. 3 Meloksikamo prasiskverbusio pro dializės membraną koncentracijos (µg/ml), kiekio (µg) ir srauto (µg/cm/h²) įvertinimas
Chromatogramų plotai buvo vertinami naudojant ChromStar program. Gauti chromatogramų
plotai remiantis kalibracinės kreivės lygtimi x = (y+3181)/13948 (y – chromatogramos plotas, x – meloksikamo koncentracija (µg/ml)) buvo apskaičiuotos meloksikamo koncentracijos.
Prasiskverbusio pro dializės membraną meloksikamo kiekis apskaičiuojamas pagal formulę: yn = 30(xn+1 – xn +(xn/30)), kur y – meloksikamo kiekis prasiskverbęs pro membraną (µg), x – meloksikamo koncentracija apskaičiuota pagal kalibracinę kreivę (µg/ml), n – matavimo numeris, 30 – akceptorinės terpės tūris (ml).
Meloksikamo srautas apskaičiuojamas pagal formulę Sr = y/S/t, kur Sr – srautas (µg/cm²/h), y – prasiskverbusio pro dializės membraną meloksikamo kiekis (µg), S – dializės membranos plotas (cm²), t – laikas (h).
3. 2. 4 Tyrimo duomenų statistinė analizė
Statistinis duomenų apdorojimas buvo atliekamas naudojant SPSS 15 ir Microsoft Office Excel 2007 programas.
Skirtumų patikimumą apskaičiavome naudodami Wilcoxon testą (SPSS 15 programa), kai paklaidos tikimybė p<0,05. Apskaičiuoti eksperimentinių duomenų aritmetiniai vidurkiai (x), vidutiniai kvadratiniai nuokrypiai (SD), patikimumo lygmuo (p).
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
4. 1 Standartinių tirpalų gamyba ir kalibracinės kreivės sudarymas
Meloksikamo 100; 75; 50; 25; 10; 5; 1; 0,5; 0,1 µg/ml metanoliniai tirpalai buvo naudojami kalibracinės kreivės sudarymui. 2 mg meloksikamo buvo ištirpinti 20 ml gryno metanolio ir gauta 100 µg/ml koncentracija. Norint gauti kitas anksčiau minėtas meloksikamo koncentracijas buvo paimta atitinkamai 0,75 ml; 0,5 ml; 0,25 ml; 0,1 ml; 0,05 ml; 0,01 ml; 0,005 ml; 0,001 ml pradinio meloksikamo (100 µg/ml) tirpalo ir pripilta gryno metanolio iki 1 ml. Gauti tirpalai buvo chromatografuojami du kartus. Antrą kartą tirpalai buvo chromatografuojami po dviejų savaičių. Dvi savaites tirpalai buvo laikomi šaldytuve esant +8°C temperatūrai. Laikant šaldytuve meloksikamo tirpalai išliko stabilūs (vertinant vizualiai neiškrito nuosėdos, tirpalai nesusidrumstė). Chromatogramų plotai buvo įvertinti programa ChromStar (11 ir 12 pav. parodytos meloksikamo 10 ir 100 µg/ml koncentracijos chromatogramos) ir apskaičiavus plotų vidurkius naudojant Microsoft Office Excel 2007 programą buvo nubraiţyta kalibracinė kreivė (10 pav.). Remiantis gauta tiesine lygtimi y = 13948x+3181 (koreliacijos koeficientas R² = 0,9997) vėliau buvo vertinamos meloksikamo koncentracijos.
11 pav. Meloksikamo 10 µg/ml metanolinio tirpalo chromatograma.
4. 2 Linijiškumo analitinės charakteristikos nustatymas
Linijiškumo analitinės charakteristikos nustatymas - atliekama meloksikamo 10 µg/ml metanolinio tirpalo efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) analizė penkis kartus. 13 pav. pateikiamos visos penkios chromatogramos viename paveiksle.
0 10 20 30 40 -2 0 2 4 6 8 mV Laikas, min. 13 pav. Meloksikamo 10 µg/ml metanolinio tirpalo chromatogramos.
Naudojant ChromStar programą apskaičiuojami gautų chromatogramų smailių plotai. Pagal kalibracinės kreivės lygtį apskaičiuojamos meloksikamo koncentracijos (rezultatai pateikiami 9 lentelėje).
9 lentelė. Meloksikamo chromatogramų plotai ir koncentracijos. Smailės plotas, mV/s Koncentracija, µg/ml
137328 9,88
136266 9,80
135818 9,77
137007 9,85
14 pav. pateikiama meloksikamo 10 µg/ml metanolinio tirpalo linijiškumo grafinė išraiška. Apskaičiuojamas koreliacijos koeficientas R² = 0,992, vidurkis (x) – 9,818; standartinis nuokrypis (SD) – 0,045497.
14 pav. Meloksikamo 10 µg/ml metanolinio tirpalo linijiškumo grafinė išraiška.
4. 3 Meloksikamo tirpumo vertinimas
Meloksikamo tirpumas daugelyje tirpiklių yra labai maţas. Geriausias meloksikamo tirpumas yra polietileno glikolyje (PEG) 400 (3,763 mg/ml) [21]. Tačiau šio tirpiklio negalima naudoti gaminant meloksikamo hidrogelį, naudojant karbomerą (gamintojai nurodo, kad karbomeras nesiderina su polietileno glikoliu (PEG)). Todėl norėdami pagaminti 1 proc. meloksikamo tirpalą turėjome naudoti kitą tirpiklį. R. Jantharaprapap ir G. Stagni eksperimento metu gamino meloksikamo gelį meloksikamą tirpindami propileno glikolyje (PG). Tačiau meloksikamo tirpumas propileno glikolyje (PG) yra tik 0,307 mg/ml. Tirpalas buvo šarminamas 10 proc. natrio hidroksido (NaOH) tirpalu ir taip pagerinamas meloksikamo tirpumas [14, 21]. Remdamiesi šių tyrimų duomenimis mes atlikome meloksikamo tirpumo tyrimą propileno glikolyje (PG) koreguojant pH reikšmes.
10 lentelė. Meloksikamo tirpumas propileno glikolyje (PG) koreguojant pH reikšmes. Meloksikamo kiekis, mg Propileno glikolio kiekis, g 10% NaOH kiekis, ml Tirpalo pH reikšmė Tirpumas 300 30 0 4,1 Netirpsta 0,100 8,9 Netirpsta 0,200 9,0 Netirpsta 0,300 9,1 Netirpsta 0,350 9,2 Netirpsta 0,360 9,3 Netirpsta 0,370 9,5 Netirpsta 0,380 10,9 Netirpsta 0,390 11,3 Netirpsta 0,400 11,5 Tirpsta
Buvo gaminamas 1 proc. meloksikamo propileno glikolio (PG) tirpalas. 300 mg meloksikamo buvo tirpinama 30 g propileno glikolio (PG) ir šarminama 10 proc. natrio hidroksido (NaOH) tirpalu. Gautas tirpalas buvo laikomas 3 min ultragarso vonelėje esant 20°C temperatūrai. Tirpumo rezultatai pateikiami 10 lentelėje. Meloksikamas ištirpsta propileno glikolyje (PG) pridėjus 0,400 ml 10 proc. natrio hidroksido (NaOH) tirpalo, šio tirpalo pH reikšmė yra 11,5. Pagamintas 1 proc. meloksikamo tirpalas buvo naudojamas meloksikamo prasiskverbimo pro odą in vitro tyrimo metu ir meloksikamo gelių gamyboje.
4. 4 Meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro tyrimas ir jo vertinimas
Meloksikamo 1 proc. propileno glikolio (PG) tirpalas buvo naudojamas meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro vertinimui. Tyrime naudotos 6 difuzijos celės. Vandens vonelėje buvo palaikoma 37°C temperatūra. Meloksikamo 1 proc. propileno glikolio (PG) tirpalas buvo naudojamas kaip donorinis tirpalas, jo buvo dedama po 0,5 ml (šiame kiekyje donorinio tirpalo buvo 5 mg gryno meloksikamo). Kaip akceptorinis tirpalas buvo naudojamas buferinis tirpalas pH 8,50±0,02; jo buvo pilama po 30 ml į kiekvieną difuzijos celę. Bandiniai (1 ml) buvo imami po 15, 30, 60, 120, 180 ir 300 minučių. Paėmus bandinius buvo pripilama po 1 ml akceptorinio tirpalo. Bandiniai buvo laikomi šaldytuve (+8°C) 24 valandas ir po to bandiniai buvo chromatografuojami.
I eksperimento rezultatai.
Apdorojus chromatogramas ChromStar programa buvo gauti chromatogramų plotai pagal kuriuos buvo apskaičiuotos meloksikamo koncentracijos pagal kalibracinę kreivę, meloksikamo kiekiai ir meloksikamo srautai (duomenys pateikiami 11 lentelėje). 15 pav. pateikiamas meloksikamo srauto grafikas. Remiantis šiais duomenimis meloksikamo srautas yra didţiausias bandymo pradţioje. Nuo bandymo pradţios praėjus 15 min (0,25 h) meloksikamo srautas buvo 346,963 µg/cm²/h. Bandymo pabaigoje po 5 valandų meloksikamo srautas buvo 67,401 µg/cm²/h. 11 lentelė. Meloksikamo srautas tam tikru laiku.
Bandinio ėmimo laikas, h Meloksikamo koncentracija, µg/ml Meloksikamo kiekis, µg* Srautas, µg/cm²/h 0,25 5,089±0,274 152,664±8,218 346,963±17,049 0,5 13,042±1,041 243,696±27,628 276,928±28,659 1 25,209±1,099 378,052±43,311 214,802±22,464 2 43,826±1,277 583,712±24,269 165,827±6,294 3 58,061±0,754 470,879±46,585 89,182±8,054 5 75,897±1,384 593,128±42,662 67,401±4,425
Vidurkis (x)±standartinis nuokrypis (SD) (n=6). *Meloksikamo kiekis (µg) tam tikrais laiko intervalais.
Bandymo metu per 5 valandas pro dializės membraną prasiskverbė 2,422 mg meloksikamo, tai sudaro 48,44 proc. meloksikamo kiekio buvusio donoriniame tirpale. Remiantis šiais duomenimis, tikslinga pailginti eksperimento atlikimo laiką ir nustatyti per kiek laiko prasiskverbė visas meloksikamo kiekis, esantis donoriniame tirpale (5 mg).
4. 5 Meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro tyrimo atkartojamumas
Meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro tyrimo atkartojamumas buvo atliktas tomis pačiomis sąlygomis po dviejų savaičių (II eksperimentas). Buvo naudotas meloksikamo 1 proc. propileno glikolio (PG) tirpalas (donorinio tirpalo buvo dedama 0,5 ml). Naudotas akceptorinis tirpalas - buferinis tirpalas, kurio pH reikšmė 8,50±0,0; jo buvo pilama po 30 ml į kiekvieną difuzijos celę. Bandiniai (1 ml) buvo imami po 15, 30, 60, 120, 180 ir 300 minučių. Paėmus bandinius buvo pripilama po 1 ml akceptorinio tirpalo. Bandiniai buvo laikomi šaldytuve (+8°C) 24 valandas. Bandiniai buvo chromatografuojami, gauti smailių plotai buvo perskaičiuoti į meloksikamo srautus. Gauti rezultatai buvo lyginami su I eksperimento rezultatais, 12 lentelėje pateikiami I ir II eksperimentų meloksikamo srautai. I eksperimento metu diţiausias srautas 346,963 µg/cm²/h buvo po 15 min. (0,25 h) nuo eksperimento pradţios. Srautas maţėjo po 5 h buvo 67,401 µg/cm²/h. II eksperimento metu po 15 min (0,25 h) ir 5 h meloksikamo srautas buvo atitinkamai 358,946 µg/cm²/h ir 62,169 µg/cm²/h.
12 lentelė. Meloksikamo srautų palyginimas.
Bandinio ėmimo laikas, h Srautas, µg/cm²/h (I eksperimento)* Srautas, µg/cm²/h (II eksperimento)** 0,25 346,963±17,049 358,946±10,139 0,5 276,928±28,659 291,959±24,542 1 214,802±22,464 217,531±9,022 2 165,827±6,294 159,312±11,658 3 89,182±8,054 88,983±9,868 5 67,401±4,425 62,169±0,792
Vidurkis (x)±standartinis nuokrypis (SD) (*n=6, **n=2).
16 pav. pateikiama I ir II eksperimentų (in vitro tyrimo atkartojamumo) meloksikamo srautų grafinė išraiška. Didţiausias meloksikamo srautas yra eksperimento pradţioje ir vėliau meloksikamo srautas maţėja.
16 pav. In vitro tyrimo atkartojamumo grafinė išraiška.
I ir II eksperimentų (in vitro tyrimo atkartojamumo) rezultatų palyginimui naudojamas Wilcoxon testas (SPSS 15 programa). Šiuo testu palyginus rezultatus statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p<0,05.
17 pav. pateikiama I ir II eksperimentų meloksikamo srautų statistinio patikimumo grafinė išraiška. Kuo taškai yra arčiau tiesės, tuo duomenys yra statistiškai patikimesni.
17 pav. I ir II eksperimentų meloksikamo srautų palyginimo grafinė išraiška.
II eksperimento metu pro dializės membraną (per 5 h) iš viso prasiskverbė 47,5 proc. meloksikamo kiekio buvusio donoriniame tirpale.
Šio tyrimo metu nustatėme, kad atkartojus meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro tyrimą rezultatai statistiškai reikšmingai nesiskyrė. Taigi, in vitro tyrimo metodas yra patikimas ir tinkamas tirti vaistinių medţiagų prasiskverbimą pro dializės membraną.
4. 6 Akceptorinės terpės pH reikšmės įtaka meloksikamo prasiskverbimui pro dializės membraną in vitro
Akceptorinės terpės pH reikšmės įtakos meloksikamo prasiskverbimui pro dializės membraną
in vitro tyrimas buvo atliekamas I ir II eksperimento sąlygomis. Tyrime naudotos difuzijos celės,
meloksikamo 1 proc. propileno glikolio (PG) tirpalas, vandens vonelė (palaikoma temperatūra 37°C). Tyrimo metu buvo koreguojama vienintelė sąlyga – tai akceptorinio tirpalo pH reikšmė. Buvo naudojami skirtingo pH reikšmės akceptoriniai tirpalai (buferiniai tirpalai, kurių pH reikšmės 9,00±0,02 ir 7,00±0,02). Gauti rezultatai buvo lyginami su II eksperimento rezultatais. 13 lentelėje pateikiama meloksikamo srautai, kai akceptorinės terpės pH reikšmė yra 7; 8,5; 9. Didţiausias meloksikamo srautas - eksperimento pradţioje ir vėliau maţėja. Duomenų palyginimui
buvo naudojamas Wilcoxon testas (SPSS 15 programa) ir nustatyta, kad statistiškai reikšmingų skirtumų nėra, kai p<0,05.
13 lentelė. Meloksikamo srautai esant skirtingoms akceptorinės terpės pH reikšmėms. Bandinio ėmimo laikas, h Srautas, µg/cm²/h pH reikšmė 8,5 (II eksperimentas) pH reikšmė 7 pH reikšmė 9 0,25 358,946±10,139 348,287±1,363 355,026±8,381 0,5 291,959±24,542 295,332±5,965 289,021±16,356 1 217,531±9,022 229,926±1,707 221,787±7,243 2 159,312±11,658 157,813±12,942 155,816±9,098 3 88,983±9,868 87,519±5,529 84,091±4,832 5 62,169±0,792 65,362±8,809 65,435±8,142
Vidurkis (x)±standartinis nuokrypis (SD) (n=2).
18 pav. pateikiama meloksikamo srautų, kai akceptorinės terpės pH reikšmės yra 7; 8,5; 9, grafinė išraiška. Didţiausias meloksikamo srautas yra eksperimentų pradţioje (po 15 min nuo eksperimentų pradţios), toliau atliekant eksperimentus meloksikamo srautas maţėja. Maţiausias meloksikamo srautas yra eksperimentų pabaigoje (po 5 h).
18 pav. Akceptorinės terpės pH reikšmės įtaka meloksikamo srautui.
Bendras prasiskverbęs pro dializės membraną meloksikamo kiekis, kai akceptorinės terpės pH reikšmė 7 buvo 2,41 mg, kai akceptorinės terpės pH reikšmė 9 - 2,369 mg. Tai sudaro atitinkamai 48,2 proc. ir 47,38 proc. bendro meloksikamo kiekio buvusio donoriniame tirpale (5 mg).
Apibendrinus tyrimo metu gautus rezultatus nustatėme, kad akceptorinės terpės pH reikšmė neturi įtakos meloksikamo prasiskverbimui pro dializės membraną ir atliekant meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro tyrimą akceptorinės terpės pH reikšmės ribos gali būti 7 – 9.
5. IŠVADOS
1. Įvertinus meloksikamo struktūrą, fizikines-chemines savybes parinkta ir pritaikyta efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodo sąlygos meloksikamo kiekybiniam nustatymui.
2. Pagaminti ir chromatografuoti meloksikamo standarto (Reference Standard) metanoliniai tirpalai (100; 75; 50; 25; 10; 5; 1; 0,5; 0,1 µg/ml koncentracijos), sudaryta meloksikamo kalibracinė kreivė. Remiantis gauta tiesinė lygtimi y=13948x+3181 (y – kreivės plotas (mV/s), x – meloksikamo koncentracija (µg/ml), koreliacijos koeficientas R²=0,9997) galima nustatyti meloksikamo koncentracijas.
3. Nustatyta, kad gaminant 1 proc. meloksikamo propileno glikolio tirpalą didţiausią įtaką meloksikamo tirpumui turėjo tirpalo pH reikšmė. Meloksikamas pilnai ištirpo šarminant tirpalą 10 proc. natrio hidroksido (NaOH) tirpalu iki pH reikšmės 11,5.
4. Parinktos išsiskyrimo in vitro metodo sąlygas: akceptorinio tirpalo tūris – 30 ml, donorinio tirpalo tūris – 0,5 ml, dializės membrana – regeneruotos celiuliozės membrana, bandinio ėmimo laiko intervalai – 15; 30, 60, 120, 180 ir 300 min, palaikoma temperatūra - 37°C, akceptorinės terpės pH reikšmė – 8,5. Nustatyta, kad atlikus meloksikamo išsiskyrimo pro dializės membraną in vitro tyrimą ir jo atkartojamumą statistiškai reikšmingų rezultatų skirtumų negauta. Todėl galima teigti, kad in vitro metodo sąlygos parinktos tinkamai ir metodas tinkamas naudoti.
5. Nustatyta, kad akceptorinės terpės pH reikšmė (ribose 7 – 9) statistiškai reikšmingai neįtakoja meloksikamo išsiskyrimo pro dializės membraną, todėl meloksikamo prasiskverbimo pro dializės membraną in vitro tyrimą galima atlikti nustatytose pH reikšmės ribose.
6. Nustatyta, kad per 5 valandų eksperimento trukmę išsiskyrusio pro dializės membraną meloksikamo kiekis sudaro apie 48 proc. bendro meloksikamo kiekio buvusio donoriniame tirpale (5 mg), todėl tikslinga ilginti eksperimento laiką.
6. SANTRAUKA
Raktaţodţiai: meloksikamas, transdermalinės vaistų formos, vaistinės medţiagos
išsiskyrimas, efektyvioji skysčių chromatografija (HPLC).
Meloksikamas,
(4-hidroksi-2-metil-N-(5-metil-2-tiazolil)-2H-1,2-benzotiazin-3-karboksamid-1,1-dioksidas), yra nesteroidinis vaistas nuo uždegimo (NVNU), selektyvus ciklooksigenazės II (COX-II) inhibitorius ir naudojamas reumatoidiniam artritui, osteoartritui ir kitoms sąnarių ligoms gydyti. Jis yra žymiai efektyvesnis ir sukelia mažiau šalutinių poveikių virškinamąjam traktui lyginant su kitais tradiciniais nesteroidiniais vaistais nuo uždegimo (NVNU). Gydomoji meloksikamo paros dozė (15 mg) yra viena mažiausių lyginant su kitais tradiciniais nesteroidiniais vaistais nuo uždegimo (NVNU). Europoje ir Lietuvoje yra registruotos tik peroralinės ir parenteralinės meloksikamo vaistų formos. Todėl siekiama sukurti transdermalines meloksikamo vaistų formas. Šio darbo tikslas – sukurti meloksikamo išsiskyrimo iš tirpalų pro dializės membraną in vitro metodą ir įvertinti išsiskyrusio meloksikamo kiekį. Tyrimo metu buvo naudojamas 1 proc. meloksikamo propileno glikolio tirpalas. Dializės membrana - regeneruotos celiuliozės. Akceptorinis tirpalas – buferinis tirpalas, kurio pH reikšmė 8,5. Palaikoma temperatūra - 37°C. Bandiniai buvo imami po 15, 30, 60, 120, 180 ir 300 minučių. Išsiskyręs meloksikamo kiekis iš bandinių kiekybiškai buvo vertinamas efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodu. Didžiausias meloksikamo srautas (346,963 µg/cm²/h) buvo po 15 minučių nuo eksperimento pradžios. Vėliau meloksikamo srautas mažėjo. Mažiausias meloksikamo srautas (67,401 µg/cm²/h) buvo po 300 minučių nuo eksperimento pradžios. Per visą eksperimento laiką pro dializės membraną išsiskyrė apie 48 proc. bendro meloksikamo kiekio buvusio donoriniame tirpale.
7. SUMMARY
Keywords: meloxicam, transdermal formulation, drug release, high performance liquid chromatography (HPLC).
Meloxicam, (4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methyl-2-thiazolyl)-2H-1, 2-benzothiazine-3-carbox-amide-1, 1-dioxide), a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) and selective cyclooxygenase II (COX-II) inhibitor, is used in the treatment of rheumatoid arthritis, osteoartritis and other joint diseases. It has comparable efficiency and greater gastric tolerability in comparison to conventional non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). The efficiency dose of meloxicam (15 mg/day) is one of the lowest in the non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). There are registered only oral and parenteral formulations of meloxicam in Europe and Lithuania. So it is strive to create transdermal formulations of meloxicam. The aim of the present work was to develop in vitro meloxicam release through dialysis membrane method and measure the amount of released meloxicam. On release of meloxicam from 1 % meloxicam propylene glycol solution was used regenerated cellulose dialysis membrane. As acceptor fluid was used buffer pH 8,5. Temperature was controlled at 37°C. Samples 1 ml were withdrawn at intervals of 15, 30, 60, 120, 180 and 300 min. The quantitative determination of meloxicam in samples was performed by high performance liquid chromatography (HPLC). The maximum flux of meloxicam (346,963 µg/cm²/h) was after 15 min from the beginning of the experiment. Later on meloxicam flux was on the decrease. The minimum flux of meloxicam (67,401 µg/cm²/h) was after 300 min from the beginning of the experiment. All over the experiment time, 48 % in general of meloxicam has released.
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Aulton M. E. Pharmaceutics The science of dosage form design. 2nd ed. 2002; 505-519 2. Babu P. R., Subrahmanyam C. V., Thimmasetty J., Manavalan R., Valliappan K. Solubility
of Meloxicam in Mixed Solvent Systems. Ethiopian Pharmaceutical Journal 2007; 25 (1): 23-28
3. Cork M. J. The importance of skin barrier function. J. Dermatol. Treat. 1997; 8: 7-13 4. Del Tacca M., Colucci R., Fornai M., Blandizzi C. Efficacy and Tolerability of Meloxicam,
a COX-2 Preferential Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drug: A Review. Clinical Drug Investigation 2002; 22 (12): 799-18
5. Emirhan Nemutlu, Sedef Kir. Validated Determination of Meloxicam in Tablets by Using UV Spectrophotometry. Hecettepe University, Journal of Faculty of Pharmacy 2004; 24 (1): 13-24 Prieiga per internetą:
(http://www.eczfakder.hacettepe.edu.tr/Arsiv/EskiDergiler/01_2004/13-01-2004.pdf) 6. Euller-Ziegler L., Velicitat P., Bluhmki E., Türck D., Scheuerer S., Combe B. Meloxicam: a
review of its pharmacokinetics, efficacy and tolerability following intramuscular administration. Inflamm. res.,2001; 50 (1): 5-9
7. FDA Guidance for Industry: SUPAC-SS Nonsterile Semisolid Dosage Forms. Scale-Up and Post Approval Changes: Chemistry, Manufacturing and Controls; in Vitro Release Testing and in Vivo Bioequivalence Documentation., 1997 Prieiga per internetą:
(http://www.fda.gov/cder/Guidance/1447fnl.pdf)
8. Fleischmann R., Iqbal I., Slobodin G. Meloxicam: Expert Opin Pharmacother., 2002; 3 (10): 1501-12
9. Gupta P., Garg S. Recent advances in semisolid dosage forms for dermatological
application. Pharmaceutical Technology 2002 Prieiga per internetą: (www.pharmtech.com) 10. Han-Moe Ki, Hoo-Kyun Choi. The Effects of Meloxicam/Ethanolamine Salt Formation on
Percutaneous Absorption of Meloxicam. Arch Pharm Res 2007; 30 (2): 215-21
11. Hyo-Kyung Han, Hoo-Kyun Choi. Improved absorption of meloxicam via salt formation with ethanolamines. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2007; 65: 99-103 Prieiga per internetą: (www.elsevier.com/locate/ejpb)
12. http://eu.spectrapor.com/dialysis/Fund.html 13. http://www.permegear.com/franz.htm
14. Jantharaprapap R., Stagni G. Effects of penetration enhancers on in vitro permeability of meloxicam gels. International Journal of Pharmaceutics 2007; 343; 26-33 Prieiga per internetą: (www.elsevier.com/locate/ijpharm)
15. Jui-Sheng Chang, Pao-Chu Wu, Yaw-Bin Huang, Yi-Hung Tsai. In-Vitro Evaluation of Meloxicam Permeation Using Response Surface Methodology. Journal of Food and Drug Analysis 2006; 14 (3): 236-41
16. Liebenberg W., Engelbrecht E., Wessels A., Devarakonda B., Yang W., M. M. De Villiers. A Comparative Study of the Release of Active Ingredients from Semisolid Cosmeceuticals Measured with Franz, Enhancer or Flow-Through Cell Diffusion Apparatus, Journal of Food and Drug Analysis 2004; 12 (1): 19-28
17. Loan Honeywell-Nguyen P., Bouwstra Joke A. Vesicles as a tool for transdermal and dermal delivery. Drug Discovery Today: Technologies 2005; 2 (1): 67-74 Prieiga per internetą: (www.drugdiscoverytoday.com)
18. Meghan F. Wilkosz, BS, Robin H. Bogner. Transdermal drug delivery. U. S. Pharmacist. 2003; 28 (4) Prieiga per internetą:
(http://www.uspharmacist.com/index.aps?show=article&page=8_1061.htm)
19. Mėgelaitis Ţ. Skausmo ir uţdegimo gydymas vietiškai veikiančiais vaistais. Farmacija ir laikas 2005; 9: 43-44 Prieiga per internetą:
(http://www.emedicina.lt/site/files/farmacija_ir_laikas/2005_09/skausmas.pdf)
20. Montagna W. The structure and function of skin. 3rd ed., Academic Press, New York, 1974. 21. Neelam S., Sonu B. Solubility Enhancement of Cox-2 Inhibitors Using Various Solvent
Systems. AAPS PharmSciTech 2003; 4 (3) Prieiga per internetą: (http://www.pharmscitech.org)
22. OECD (2004). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris 2004
23. PHARMEUROPA 2006; 18 (3): 458-60
24. Prausnitz Mark R., Mitragotri Samir, Langer Robert. Current status and future potential of transdermal drug delivery. Nature 2004; 3: 115-24 Prieiga per internetą:
(www.nature.com/reviews/drugdisc)
25. Sanghvi P., Collins C. C. Comparison of Diffusion Studies of Hydrocortisone Between the Franz Cell and the Enhancer Cell. Prieiga per internetą:
(http://www.varianinc.com/image/vimage/docs/products/dissilution/shared/ps_v2n2.pdf) 26. Schoenfeld R. Gastrointestinal safety profile of meloxicam: a meta-analysis and systematic
27. Siewert M., Dressman J., Brown C. K., Shah V. P. FIP/AAPS Guidelines to Dissolution/in
Vitro Release Testing of Novel/Special Dosage Forms. AAPS PharmSciTech. 2003; 4(1):
Prieiga per internetą:
(http://www.aapspharmscitech.org/articles/pt0401/pt040107/pt040107.pdf)
28. Ščiupokas A., Macijauskienė J., Jaskovikenė V. Vyresniojo amţiaus ţmonių skausmo valdymo sunkumai. Skausmo medicina 2005; 4(13): 8-19 Prieiga per internetą:
(http://www.emedicina.lt/site/files/skausmo_medicina/2005_04/vyr_amziaus_sunkumai.pdf) 29. Thakker K. D., Chern W. H. Development and Validation of In Vitro Release Tests for
Semisolid Dosage Forms – Case Study. Prieiga per internetą:
(http://www.dissolutiontech.com/DTresour/0503art/DT0503art2.pdf)
30. Vijaya Kumar, Sengodan Gurusamy, Dina Nath Mishra. Preparation, Characterization and
In vitro Dissolution Studies of Solid Dispersion of Meloxicam with PEG 6000. Yakugaku
Zasshi 2006; 126(8): 657-64 Prieiga per internetą:
(http://www.jstage.jst.go.jp/article/yakushi/126/8/657/_pdf)
31. Warfield C. A., Fausett H. J. Manual of pain management. Lippincot Williams&Wiikins, 2002
32. Williams C. Adrian. Transdermal and topical drug delivery-from theory to clinical practice. 1st ed. Pharmaceutical Press 2003
33. Wolfe MM., Lichtensein DR., Singh G. Gastrointestinal toxity of nonsteroidal anti-inflammatory drugs, N Eng J Med 1999; 340: 1888-99 Prieiga per internetą: (http://content.nejm.org/cgi/content/full/340/24/1888)
34. Zorin S., Kuylenstierna F., Thulin H. In Vitro Test of Nicotine‘s Permeability through Human Skin. Risk Evaluation and Safety Aspects. Ann. Occup. Hyg. 1999; 43 (6): 405-13 Prieiga per internetą: (http://annhyg.oxfordjournals.org/cgi/reprint/43/6/405)
