1
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Greta Lodienė
DANTŲ ŠAKNŲ KANALŲ UŽPILDŲ
BIOLOGINIO SUDERINAMUMO
IR SANDARUMO VERTINIMAS
IN VITRO
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai, odontologija (07B) Kaunas, 20122
Disertacija rengta 2007–2011 metais Lietuvos sveikatos mokslų universite-to, Medicinos akademijos, Dantų ir burnos ligų klinikoje.
Mokslo vadovė
prof. dr. Vita Mačiulskienė (Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitetas, Medicinos Akademija, biomedicinos mokslai, odontologija – 07B)
Konsultantė
prof. dr. Vilmantė Borutaitė (Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitetas, Medicinos Akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
ĮVADAS ... 6
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
1.1. Dantų šaknų kanalų užpildai ... 9
1.2. Odontologinių medžiagų poveikis organizmui ... 15
1.3. Biologinis suderinamumas ... 15
1.4. Odontologinių medžiagų tyrimo metodai ... 16
1.4.1. Ląstelių kultūros, naudojamos odontologinių medžiagų tyrimuose ... 17
1.4.2. Ląstelių/medžiagos kontaktas ... 18
1.4.3. Odontologinių medžiagų citotoksiškumo tyrimo metodai ... 20
1.4.4. Dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų citotoksiškumo tyrimai ... 23
1.4.4.1. Epoksidinių dervų pagrindu pagaminto AH Plus citotoksinis poveikis ... 23
1.4.4.2. Metakrilatų polimerų pagrindu pagaminto EndoREZ citotoksinis poveikis ... 29
1.4.4.3. Metakrilatų polimerų pagrindu pagaminto Epiphany citotoksinis poveikis ... 30
1.4.5. Dujų ir skysčių chromatografijos, masės spektrofotometrijos tyrimai ... 32
1.4.6. Oksidacinis stresas, aktyvios deguonies formos, antioksidantai ... 34
1.4.7. Dantų šaknų kanalų sistemos perforacijos ir užpildai naudojami jų užpildymui .. 36
2. TYRIMO MEDŽIAGOS IR METODAI ... 38
2.1. Tiriamieji minkštieji užpildai ir jų paruošimas ... 38
2.1.1. Tiriamųjų minkštųjų užpildų pavyzdžiai ... 40
2.1.2. Tiriamųjų minkštųjų užpildų ištraukų gaminimas ... 41
2.1.2.1. „Ką tik sumaišytų“ (KS), nepolimerizuotų minkštųjų užpildų ištraukos ... 41
2.1.2.2. „Sustingusių“ (S), polimerizuotų minkštųjų užpildų ištraukos ... 41
2.1.3. Cheminės medžiagos chromatografinei analizei ... 42
2.2. Ląstelių kultūros... 43
2.2.1. Pelių fibroblastai (L929)... 43
2.2.2. Žiurkių požandikaulinės seilių liaukos acinarinės ląstelės (SM 10-12) ... 43
2.2.3. Pelių makrofagai (J774) ... 43
2.3. Dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų citotoksiškumo tyrimai ... 44
2.3.1. Filtro difuzijos testas ... 44
2.3.2. MTT (3-(4,5-dimetiltiazolio-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas) tyrimas ... 45
2.4. Ląstelių gyvybingumo nustatymo metodai ... 46
2.4.1. Minkštųjų užpildų ištraukų poveikio žiurkių požandikaulinių seilių liaukų (SM 10-12) gyvybingumui nustatymas, naudojant fluorescuojančius dažus ir mikroskopą... 46
2.4.2. Minkštųjų užpildų ištraukų, NADPH oksidazės inhibitorių, antioksidanto askorbo rūgšties ir fermento katalazės poveikio nustatymas pelių makrofagų (J774) gyvybingumui, naudojant fluorescuojančius dažus ir mikroskopą ... 47
2.5. Kiti dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų tyrimo metodai ... 49
4
2.5.2. Cheminių junginių, išsiskiriančių iš minkštųjų užpildų, analizė ... 50
2.5.3. Tarpšaknio perforacijų užpildymui naudojamų užpildų bakterinio pralaidumo tyrimas ... 50
2.5.3.1. Tiriamųjų dantų paruošimas ir tarpšaknio perforacijų užpildymas ... 50
2.5.3.2. Tarpšaknio perforacijų užpildymui naudojami užpildai ir eksperimentinės grupės ... 51
2.5.3.3. Tarpšaknio perforacijų užpildymui naudojamų užpildų bakterinio pralaidumo procedūra ... 53
2.6. Statistinė analizė... 55
3. REZULTATAI ... 57
3.1. Dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų citotoksiškumas ... 57
3.1.1. Filtro difuzijos testas ... 57
3.1.2. MTT tyrimas ... 58
3.2. Minkštųjų užpildų poveikis ląstelių gyvybingumui... 59
3.2.1. Minkštųjų užpildų ištraukų poveikis SM 10-12 ląstelių gyvybingumui ... 59
3.2.2. Minkštųjų užpildų ištraukų koncentracijų įtaka žiurkių požandikaulinių seilių liaukų (SM 10-12) gyvybingumui ... 61
3.2.3. Minkštųjų užpildų ištraukų poveikis pelių makrofagų (J774) gyvybingumui ... 62
3.2.4. Minkštųjų užpildų ištraukų koncentracijų poveikis pelių makrofagų (J774) gyvybingumui ... 63
3.2.5. NADPH oksidazės inhibitorių, antioksidanto askorbo rūgšties ir fermento katalazės poveikis pelių makrofagų (J774) gyvybingumui ... 64
3.2.5.1. Inhibitorių, antioksidanto askorbo rūgšties ir fermento katalazės koncentracijų įtaka ląstelių gyvybingumui ... 64
3.2.5.2. NADPH oksidazės inhibitorių, antioksidanto askorbo rūgšties ir fermento katalazės poveikis ląstelių gyvybingumui epoksidinių dervų pagrindu pagaminto minkštojo užpildo AH Plus grupėje ... 64
3.2.5.3. NADPH oksidazės inhibitorių ir antioksidanto askorbo rūgšties ir fermento katalazės poveikis ląstelių gyvybingumui metakrilatų polimerų pagrindu pagaminto minkštojo užpildo EndoREZ grupėje ... 66
3.2.5.4. NADPH oksidazės inhibitorių, antioksidanto askorbo rūgšties ir fermento katalazės poveikis ląstelių gyvybingumui metakrilatų polimerų pagrindu pagaminto minkštojo užpildo Epiphany SE grupėje ... 68
3.3. Minkštųjų užpildų įtaka vandenilio peroksido (H2O2) susidarymui pelių makrofaguose (J774) ... 70
3.4. Cheminių komponentų, išsiskiriančių iš minkštųjų užpildų, nustatymas dujų chromatografijos/masės spektrometrijos (DC/MS) ir skysčių chromatografijos/masės spektrometrijos (SC/MS) metodais ... 72
3.5. Tarpšaknio perforacijų užpildymui naudojamų užpildų bakterinis pralaidumas ... 76
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 79
IŠVADOS ... 93
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 93
PUBLIKACIJOS... 107
5
SANTRUMPOS
ADF – aktyvios deguonies formos
DC/MS – dujų chromatografija/masės spektrometrija SC/MS – skysčio chromatografija/masės spektrometrija
MTT – (3-(4,5-dimetiltiazolio-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas) NADPH – nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas
SDH – sukcinato dehidrogenazė
AH – cheminio kietėjimo, epoksidinių dervų pagrindu pagamintas AH Plus RSA – cheminio kietėjimo, silikono pagrindu pagamintas RoekoSeal
ER – dvigubo kietėjimo, metakrilatų polimerų pagrindu pagamintas EndoREZ EP – dvigubo kietėjimo, metakrilatų polimerų pagrindu pagamintas Epiphany
ar Epiphany SE
AHKS – „ką tik sumaišyta“, nepolimerizuota AH Plus būsena AHCHEM – „ sustingusi“, polimerizuota AH Plus būsena
RSAKS – „ką tik sumaišyta“, nepolimerizuota RoekoSeal būsena RSACHEM – „sustingusi“, polimerizuota RoekoSeal būsena
ERKS – „ką tik sumaišyta“, nepolimerizuota EndoREZ būsena ERŠV,CHEM – „sustingusi“, polimerizuota EndoREZ būsena
EPKS – „ką tik sumaišyta“, nepolimerizuota Epiphany ar Epiphany SE būsena EPŠV,CHEM – „sustingusi“, polimerizuota Epiphany ar Epiphany SE būsena
EPCHEM – „sustingusi“ be polimerizavimo lempa Epiphany ar Epiphany SE būsena PI – propidžio jodidas
DPI – difenilenjodonis APO – apocianinas AR – askorbo rūgštis KAT – fermentas katalazė
BISGMA – bisfenolio-A glicerolato dimetakrilatas
UDMA – uretano dimetakrilatas (kiti pavadinimai: UEDMA/DUDMA) EBPADMA – etoksilintas bisfenolio-A dimetakrilatas (kiti pavadinimai: Bis-EMA) HEMA – hidroksietilo metakrilatas
TEGDMA – trietileno glikolio dimetakrilatas PEGDMA – polietileno glikolio dimetakrilatas
MSDS – medžiagos saugumo duomenų lentelė (angl. Material Safety Data Sheet) SN – standartinis nuokrypis
lls – laisvės laipsnių skaičius p – reikšmingumo lygmuo PI – pasikliautinumo intervalas n – atvejų skaičius grupėje χ2 – Chi kvadrato kriterijus proc. – procentai
6
ĮVADAS
Odontologijos praktikoje gydant danties ligas bei danties audinių defek-tus naudojamos įvairios medžiagos ir taikomi įvairūs fiziniai bei cheminiai gydymo metodai. Visa tai veikia gyvuosius organizmo audinius, pirmiau-sia – danties pulpą ir apydančio audinius. Siekiant kuo geresnių gijimo re-zultatų bei kuo mažesnio pašalinio poveikio organizmui, reikalingi komp-leksiniai audinių tyrimai, leidžiantys optimizuoti gydymo strategiją.
Dantų šaknų kanalų gydymo sėkmė priklauso nuo daugelio faktorių. Šaknų kanalų sistemos ir danties vainiko hermetizavimas yra labai svarbūs veiksniai, lemiantys endodontinio gydymo sėkmę. Šio tikslo siekiama nau-dojant sandarius užpildus, kurie sumažina toksinių medžiagų komponentų patekimą į viršūninio apydančio audinius. Užpildai, užtikrinantys ilgalaikį dantų šaknų kanalų sistemos sandarumą, taip pat pasižymi silpnu toksiniu poveikiu [82]. Dantų šaknų kanalų sistemos užpildai neturi kliudyti audinių atsistatymui, bet skatinti pažeistų struktūrų persitvarkymą [91].
Klinikinėje praktikoje naudojamos medžiagos, patekusios už dantų šaknų kanalų sistemos ribų, gali tiesiogiai liestis su apydančio audiniais. Nors lieti-mosi sritis nedidelė, audinių atsakas gali veikti viršūninio apydančio audinių gijimo procesus ir sutrukdyti ar užkirsti kelią kaulo destrukcijos židinių išsiskaidymui [154, 213, 215]. Ieškoma atsakymų, kaip viena ar kita odontologinė medžiaga ar cheminis komponentas veikia organizmo ląsteles ir audinius ir įvertinti šiuos pokyčius gyvūnų ar žmogaus organizmuose. Iš dervų pagrindu pagamintų užpildų, naudojamų endodontijoje, išsiskyrę cheminiai komponentai ir/ar irimo produktai, patekę į viršūninio apydančio audinius, kartu su organizmo skysčiais gali būti transportuojami į kitas organizmo vietas [92]. Todėl reikalinga atlikti in vitro ir in vivo tyrimus, kad būtų nustatyta, ar laikui bėgant šios medžiagos gali sukelti lėtinius sistemi-nius ir/ar vietisistemi-nius patologisistemi-nius organizmo pokyčius [69]. Literatūroje neaptikta duomenų, apie nustatytus iš dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų išsiskyrusius cheminius komponentus bei jų poveikį.
Viena iš savybių, kuria turi pasižymėti dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai – biologinis suderinamumas. Šią sąvoką apibūdina daugelis fakto-rių: genotoksiškumas/mutageniškumas/kancerogeniškumas, citotoksiškumas, histologinis suderinamumas ar antimikrobinis poveikis [71].
Vienas iš būdų nustatyti minkštųjų užpildų biologinį suderinamumą – ištirti ląstelių atsaką in vitro. Šių tyrimų privalumas – galimas įvairių faktorių ir kintamųjų kontroliavimas [14], leidžiantis patikimai įvertinti tiriamųjų medžiagų citotoksinius poveikius. Daugelį metų naudojamos ląstelių kultūros endodontinių medžiagų sukeltoms toksinėms reakcijoms
7
tirti [174]. Nustatinėjama šių medžiagų įtaka ląstelių dauginimuisi, morfologijai, membranos vientisumui, citopatogeniniams pokyčiams [70]. Tačiau nedaug atlikta tyrimų, kuriais nustatyti dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų citotoksinių poveikių mechanizmai.
Oksidacinio streso būklė, t. y., pernelyg didelis kiekis aktyvių deguonies formų (ADF) organizme, gali susidaryti suaktyvėjus jų gamybai arba išse-kus antioksidaciniams mechanizmams, stokojant vitaminų ir mikroelementų. Didelis ADF kiekis žeidžia aplinkinius audinius. Nustatyta, jog ADF tiesio-giai ar netiesiotiesio-giai yra susiję su lėtinėmis uždegiminėmis ligomis, sepsiniu šoku, ateroskleroze, plaučių emfizema, nervų sistemos ligomis, navikiniais procesais, senėjimu, katarakta ir pan. [223].
Nedaug atlikta tyrimų, kuriais nustatyta aktyvių deguonies formų įtaka viršūninio apydančio audinių uždegimo vystymuisi [100,129]. Šie
duome-nys rodo, kad fagocitinis aktyvių deguonies formų susidarymas gali prisidėti prie uždegiminio viršūninio apydančio audinių pakenkimo [130]. Padidintas ADF susidarymas gali vykti ne tik, kaip organizmo atsakas į infekciją, bet šiam procesui gali daryti įtaką ir dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai [35,47]. Padidintas aktyvių deguonies formų susidarymas, kurį sukelia odontologinės medžiagos, siejamas su medžiagos citotoksiniu ir genotok-siniu poveikiu bei signalo perdavimo kelių aktyvavimu, kas sukelia ląstelės ciklo pokyčius [190].
Dantų šaknų kanalų užpildų mikropralaidumas tiriamas naudojant dažus, įvairius skysčius ar radioizotopus [37, 238]. Visos šios medžiagos skiriasi savo dydžiu ir forma nuo endodontines komplikacijas sukeliančių bakterijų ir endotoksinų [20, 87]. Todėl daugelio pralaidumų tyrimų aktualumas išlieka kontraversiškas [238].
Darbo tikslas
Įvertinti trumpalaikį dantų šaknų kanalų užpildų toksinį poveikį makro-ląstelėms, nustatyti galimus ląstelių žūties mechanizmus bei įvertinti užpildų mikropralaidumą in vitro
Darbo uždaviniai
1. Įvertinti minkštųjų užpildų poveikį pelių fibroblastams (L929), žiur-kių požandikaulinių seilių liaukų ląstelėms (SM 10-12) ir pelių makrofagams (J774) priklausomai nuo medžiagos būsenos.
2. Nustatyti galimus minkštųjų užpildų citotoksinio poveikio mecha-nizmus.
8
3. Chromatografijos metodais įvertinti galimą cheminių junginių išsi-skyrimą iš minkštųjų užpildų.
4. Palyginti dantų tarpšaknio perforacijų uždarymui naudojamų užpildų sandarumo savybes ir nustatyti bakterijų prasiskverbimo kelius.
Mokslinio darbo naujumas
Skirtingai nei kitos odontologijoje naudojamos dervų pagrindu pagamin-tos medžiagos, metakrilatų polimerų pagrindu pagaminti dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai glaudžiai ilgą laiką kontaktuoja su įvairiomis ląstelėmis, esančiomis viršūninio apydančio audiniuose [152]. Be to, iš šių užpildų į aplinkinius audinius gali išsiskirti cheminiai komponentai ir irimo produktai [224]. Šios medžiagos, patekę į viršūninio apydančio audinius, kartu su organizmo skysčiais gali būti transportuojamos į kitas organizmo vietas [92]. Literatūroje nerasta duomenų apie iš šių medžiagų išsiskyrusius che-minius komponentus ir jų toksinį poveikį. Šiame darbe pirmą kartą ištirtos dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų ištraukos, panaudojant dujų chroma-tografijos/masės spektrofotometrijos ir skysčių chromachroma-tografijos/masės spektrofotometrijos tyrimo metodus. Dujų chromatografijos/masės spektro-metrijos (DC/MS) ir skysčių chromatografijos/masės spektrospektro-metrijos (SC/MS) metodais galima kiekybiškai ir kokybiškai nustatyti iš dervų pagrindu paga-mintų odontologinių medžiagų išsiskyrusius cheminius komponentus [137, 138]. Didžiausias dėmesys kreiptas į pirminius išsiskiriančius monomerus. Atlikta daug tyrimų apie toksinius šių medžiagų poveikius įvairioms ląstelių kultūroms, tačiau nedaug duomenų apie šių poveikių mechanizmus. Nedaug atlikta tyrimų, kurie nustatė dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų įtaką aktyvių deguonies formų susidarymui ląstelėse [35, 47]. Šiame darbe nustatytas ADF susidarymas ir jo įtaka į citotoksiniam minkštųjų užpildų poveikiui. Taip pat pirmą kartą nustatyta, kad užpildžius dideles tarpšaknio perforacijas, bakterijos gali prasiskverbti pro dentino, esančio toliau nuo perforacijos vietos, tubules ir/ar tarpšakinio kanalus.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Dantų šaknų kanalų užpildai
Vienas iš endodontinio gydymo tikslų – dantų šaknų kanalų sistemos hermetizavimas, siekiant užkirsti kelią infekcijos plitimui. Šiam tikslui naudojami dantų šaknų kanalų plastiški ir minkštieji užpildai.
Pastarosios medžiagos atlieka keletą funkcijų:
a) rišamąją – jungtis tarp plastiškos kanalų plombavimo medžiagos (pvz., gutaperča) ir danties audinio;
b) užpildančiąją – užpildo ertmes, į kurias nepatenka kanalų plastiški užpildai (pvz., lateralinius kanalus, deltas);
c) sutepančiąją – palengvina kanalų plastiško užpildo (pvz., kaiščio) slydimą kanalu [118]. Minkštiesiems užpildams, kaip ir kitoms odontologijoje naudojamoms medžiagoms, keliami tam tikri reikalavimai [75]:
Užtikrinti kanalo sandarumą;
Būti takios konsistencijos, kad lengviau prisitvirtintų prie kanalo sienų;
Būti rentgenokontrastišku;
Miltelių dalelės turi būti smulkios, kad lengvai susimaišytų su skysčiu;
Nesitraukti kietėjimo metu;
Nedažyti kietųjų danties audinių;
Būti bakteriostatišku (ar bent jau neskatinti bakterijų daugini-mosi);
Lėtai kietėti;
Netirpti audinių skysčiuose;
Nedirginti viršūninio apydančio audinių;
Tirpti tirpikliuose, jei reikalinga pašalinti iš danties šaknies kanalo.
Dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai yra gaminami ne tik miltelių – skysčio, bet ir cheminio kietėjimo pastų pagrindu. Šias medžiagas sumai-šius, inicijuojama cheminė reakcija ir jos pradeda stingti. Taip pat gaminami ir dvigubo kietėjimo dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai, kurių kietėjimo reakcija pradedama polimerizuojant šviesa ir toliau vyksta cheminio kietė-jimo būdu (1.1 pav.).
10
1.1 pav. Dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai
Pagal cheminę sudėtį dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai skirstomi į [135]:
1. Cinko oksido – eugenolio pagrindu
2. Gutaperčos tirpiklio pagrindu (Chloroperča) 3. Kalcio hidroksido pagrindu
4. Dervų pagrindu
5. Stiklojonomerinių cementų pagrindu 6. Silikono pagrindu
7. Turintys formaldehido
Odontologinės medžiagos, pagamintos dervų pagrindu, daugelį metų naudojamos atstatomojoje odontologijoje (derviniai kompozitai, surišimo sistemos, kompomerai, įvairios plastmasės, derva modifikuoti stiklojonome-riniai cementai), gana plačiai pradėtos naudoti ir endodontijoje. Pažangių adhezinių technologijų pagalba sukurti nauji dantų šaknų kanalų užpildai dervų pagrindu. Naudojant šias medžiagas, tarp dentino ir naudojamo užpil-do sukuriamas hibridinis sluoksnis ir/ar dėl hidrofilinių dervų savybių pastarasis įsiskverbia giliai į dentino tubules [159]. Tokiu būdu užkertamas kelias mikrororganizmų pralaidumui, vienam iš faktorių, lemiančių endo-dontinio gydymo sėkmę.
Endodontinėje praktikoje iš dervų pagrindu pagamintų dantų šaknų kana-lų minkštųjų užpildų plačiausiai naudojami: epoksidinių dervų pagrindu - AH26 ir AH Plus (Dentsply) bei metakrilatų polimerų pagrindu pagaminti užpildai – EndoREZ (Ultradent) ir RealSeal (SybronEndo). Kitų odontolo-ginių medžiagų rinkoje esančių metakrilatų polimerų pagrindu pagamintų minkštųjų užpildų (pvz., Epiphany (Pentron Clinical Technologies), SimpliFill (LightSpeed Technology Inc.), InnoEndo (Heraeus Kulzer) cheminė sudėtis tokia pati kaip ir RealSeal [135].
Buvo nustatyta, kad minkštasis užpildas AH26 stingdamas išskiria formaldehidą, kurio didžiausias kiekis nustatytas po dviejų dienų [201]. Dėl šios priežasties buvo pakeista šios medžiagos sudėtis ir sukurtas naujas epoksidinių dervų pagrindu pagamintas AH Plus. Gamintojų teigimu, šis
11
užpildas pasižymi palankiomis AH26 savybėmis – erdviniu stabilumu, rentgenokontrastiškumu, lipnumu, netirpumu, mažu susitraukimu, takumu, lengvu pašalinimu [2, 132], geriau išsaugo chemines epoksidinių aminų savybes. Todėl ši medžiaga neišskiria toksinių komponentų (formaldehido) ir jos toksinis poveikis ženkliai silpnesnis [90, 112]. Šį minkštąjį užpildą sudaro dvi pastos, kurias sumaišius prasideda cheminė kietėjimo reakcija. Dėl fizikocheminių savybių šis užpildas takus, lengvai prisitaiko prie dantų šaknų kanalų sienų, pasižymi ilgalaikiu erdviniu stabilumu [8].
Šiuo metu žinomos keturios kartos dantų šaknų kanalų minkštųjų užpil-dų, pagamintų metakrilatų polimerų pagrindu [108]:
1. Pirmos kartos užpildai pradėti naudoti dar 1976 m. [24]. Buvo teigia-ma, kad:
a) užpildus lengva naudoti, nes jie įšvirkščiami; b) nedirgina aplinkinių audinių;
c) puikiai prisitaiko prie kanalo sienų; d) neskatina mikroorganizmų dauginimosi;
e) gali kalcifikuotis, patekę į viršūninio apydančio audinius [24, 114]. Dėl prieštaringų klinikinių/laboratorinių tyrimų rezultatų buvo nutraukta šių medžiagų gamyba ir naudojimas.
2. Antros kartos hidrofilinės kilmės metakrilatų polimerų pagrindu pagamintiems minkštiesiems užpildams nereikalingas ėsdinimas ir papildomas dentino sujungimas. Šios medžiagos efektyviai įsiskverbia į dentino tubules, sudarydamos stiprią jungtį su dentinu, tačiau nestiprią jungtį su gutaperča.
3. Trečios kartos minkštuosius užpildus sudaro savaime besiėsdinantis praimeris ir dvigubo kietėjimo minkštasis užpildas. Rūgštiniu prai-meriu padengiamas dentino paviršius, jis prasiskverbia per lipnųjį sluoksnį ir demineralizuoja paviršinį dentiną. Taip sudaromos sąly-gos dantų šaknų kanalų minkštajam užpildui prasiskverbti į dentino tubules. Šios medžiagos pasižymi geromis adhezinėmis savybėmis su dentinu.
4. Klinikinių etapų skaičiaus sumažinimui buvo sukurtos ir dabar plačiausiai naudojamos ketvirtos kartos savaime besiėsdinantys ir besijungiantys minkštieji užpildai.
Šių medžiagų chronologinė klasifikacija ir fizikinių savybių palyginimas pateikiami 1.1 lentelėje [108].
12
1.1 lentelė. Metakrilatų polimerų pagrindu pagamintų dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų chronologinė
klasifi-kacija, cheminė sudėtis ir fizikinių savybių palyginimas [108]
Karta Pavyzdys
(pavadinimas, gamintojas)
Cheminė sudėtis Privalumai Trūkumai
1 2 3 4 5 I Hydron (Hydron Technologies, Inc, Pompano Beach, FL, JAV) Pagrindinis komponentas – poly[2-hydroksietilo metakrilatas] (poly[HEMA])
Taki, paprasta naudoti. Nedirginantis.
Gerai prisitaiko prie kanalo sienų. Neleidžia daugintis bakterijoms. Patekusi į viršūninio apydančio audinius, gali kalcifikuotis.
Sukelia smarkią uždegiminę reakciją. Medžiagos absorbcija. Didelis pralaidumas. Vandens sugėrimas ir išsiplėtimas. II Nereika-laujančios ėsdinimo EndoREZ (Ultra-dent Products Inc, South Jordan, UT, JAV)
Bazė: Diuretano dimetakrilatas
(DUDMA), trietileno glikolio dimetakrilatas (TEGDMA), ben-zoilo peroksidas, bismuto jungi-nys, foto iniciatorius.
Katalizatorius:
2,2´-(p-tolylimi-no)dietanolis, trietileno glikolio dimetakrilatas (TEGDMA), diure-tano dimetakrilatas (DUDMA), tretinis aminas, bismuto junginys
Efektyviai įsiskverbia į dentino tubules, stipri jungtis.
Gerai prisitaiko prie kanalo sienų. Gerai toleruojamas jungiamojo ir kaulinio audinio.
Silpna jungtis su įprasta gutaperča.
13 1.1 lentelės tęsinys. 1 2 3 4 5 III Savaime besiėsdi-nančios FibreFill R.C.S. (Pentron Clinical Technologies, Wallingford, CT, JAV) Resinate (Obtura Spartan, Fenton, MO, JAV)
Uretano dimetakrilatas (UDMA), PEGDMA, HDDMA ir BISGMA dervų mišinys, silanuotas bario borosilikato stiklas, bario sulfatas, kalcio hidroksidas ir iniciatoriai. UDMA, PEGDMA, EBPADMA & BISGMA dervų mišinys, silanuotas bario borosilikato stiklas, bario sulfatas, silica, kalcio hidroksidas, bismuto oksichloridas su aminais, peroksidas, foto iniciatorius, stabilizatoriai ir pigmentas
Geras sandarumas. Geros adhezinės savybės su dentinu.
Keletas panaudojimo etapų. Dvikomponentė surišimo sistema. Šarminė ir fermentinė hidrolizė. Patekus į viršūninio apydančio audinius, gali susidaryti nesukietėjęs sluoksnis.
Savaime besiėsdi-nančios Epiphany (Pentron Clinical Technologies, Wal-lingford, CT, JAV) RealSeal (SybronEndo, Orange, CA, JAV) InnoEndo (Heraeus Kulzer, Armonk, NJ, JAV) Resinate (Obtura Spartan Corp, Fenton, MO, JAV)
UDMA, PEGDMA, EBPADMA, BisGMA dervų mišinys, silanuotas bario borosilikato stiklas, bario sulfatas, silica, kalcio hidroksidas, bismuto oksichloridas su aminais, peroksidas, foto iniciatorius, stabilizatoriai, pigmentas. Vienkomponentė surišimo sistema. Stipresnė jungtis su dentinu ir gilesnis medžiagos prasiskverbimas į dentino tubules, lyginant su užpildu, pagamintu cinko oksido-eugenolio pagrindu.
Efektyviau pašalinami iš kanalų pergydymo atvejais.
Tirpūs.
Keletas panaudojimo etapų.
Daugiau tarpų lyginant su gutaperčia ir tradicinėmis minkštosiomis dantų šaknų kanalų plombavimo
medžiagomis.
Traukiasi polimerizacijos metu. Karštis plombavimo metu paspartina medžiagos polimerizaciją, kas gali sukelti „polimerizacinį stresą“. Polimerai yra dėl cheminių ir fizikinių procesų.
Kadangi lengviau pašalinami iš viršūninio kanalo trečdalio, tai rodo nepakankamą jungtį su dentinu.
14 1.1 lentelės tęsinys. 1 2 3 4 5 Savaime besiėsdi-nančios Smart (Discus Dental, Culver City, CA, JAV)
Epiphany netirpsta tirpikliuose pergydymo atveju.
Nepašalina lipniojo sluoksnio be papildomo EDTA (etileno tiamino tetra acto rūgštis) panaudojimo.
Polimerizacinis susitraukimas. IV Savaime besiėsdi-nančios ir besijungia nčios MetaSEAL (Parkell, Inc. Edgewood, NY, JAV RealSeal SE (Epiphany SE) (SybronEndo, Orange, CA, JAV) SimpliFill SE (Diskus Dental, Culver City, CA, JAV)
Skystis: monometakrilatai
(2-hidroksietil metakrilatas (HEMA)), di(met)akrilatai
Milteliai: cirkonio oksidas, silica,
amorphous, polimerizacijos iniciatorius.
EBPADMA, HEMA, BISGMA ir rūgštinių metakrilatų dervų mišinys, silanuotas bario borosilikato stiklas, silica,
hidroksilapatitas, Ca-Al-F-silikatas, bismuto oksichloridas su aminais, peroksidas, foto iniciatorius, stabilizatoriai, pigmentas.
„Viskas viename“ sistema. Vienas panaudojimo etapas.
Dvigubas kietėjimas suma-žina polimerizacinį stresą. Hibridinio sluoksnio susidarymas tarp gutaperčios ir užpildo. Dervinio matrikso išsiplėtimas (dėl vandens) sugėrimo gali kompensuoti polimerizacinį susitraukimą.
Bis-GMA, bisfenolio-A glicidilo metakrilatas {2,2-bis [4-(2-hidroksi-3-metakriloksi-propoksi)-fenil]-propane}; UDMA, uretano dimetakri-latas; EBPADMA, etoksiliuotas bisfenolio-A dimetakridimetakri-latas; PEGDMA, polietileno glikolio dimetakrilatas.
15
1.2. Odontologinių medžiagų poveikis organizmui
Dėl medžiagų irimo ir/ar cheminės sudėties pokyčio iš dervų pagrindu pagamintų odontologinių medžiagų išsiskiria cheminiai junginiai. Tai, savo ruožtu, gali sukelti pašalinį poveikį tiek pacientams, tiek ir gydančiam personalui [71, 86, 101, 151, 157, 230]. Nustatyta, kad odontologinės medžiagos, ypatingai metalų lydiniai bei dervų pagrindu pagamintos medžiagos, gali sukelti alergines reakcijas [1, 11, 68, 74, 95, 164].
Iš dervų pagrindu pagamintų odontologinių medžiagų išsiskyrusios įvai-rios cheminiai junginiai gali sąveikauti su steroidinių hormonų receptoriais ir veikti žmogaus endokrininės sistemos funkciją [133]. Gana plačiai aprašytas Bisfenolio A estrogeninis poveikis [206, 234]. Olea su bendra-autoriais (1996) nustatė, kad BisGMA pagrindu pagamintos odontologinės medžiagos pasižymi estrogeniniu poveikiu [156]. Vėliau Schafer (1999) patvirtino estrogeninį BisGMA ir Bisfenolio A poveikį ląstelėms [183].
Nors minkštieji užpildai turėtų užpildyti dantų šaknų kanalų sistemą, plombavimo metu jie gali patekti į kraštinio (per pridėtinius kanalus) ar viršūninio (per viršūninę angą ar pridėtinius kanalus) apydančio audinius. Skirtingai nei kitos odontologijoje naudojamos dervų pagrindu pagamintos medžiagos, pastarieji glaudžiai ir ilgą laiką kontaktuoja su įvairiomis ląstelėmis, esančiomis viršūninio apydančio audiniuose [152]. Atlikta daug tyrimų, kurie nustatė citotoksinį šių užpildų poveikį [7, 12, 35, 47, 56, 102, 240]. Nėra moksliškai pagrįstų duomenų, kad dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai, patekę už šaknies viršūnės į aplinkinius audinius, galėtų lemti endodontinio gydymo sėkmę. Tačiau patekus medžiagai į viršūninio apy-dančio audinius, pastaroji gali veikti kaip antigenas ir iššaukti apsaugines organizmo reakcijas [211]. Tai gali trukdyti viršūninio apydančio audinių uždegimo gijimui [154].
1.3. Biologinis suderinamumas
Biologinis suderinamumas – medžiagos gebėjimas atlikti savo funkciją, nesukeliant neigiamos organizmo reakcijos [237]. Odontologinės medžiagos neturėtų neigiamai veikti burnos ertmės, dantų bei apydančio audinių. Jos turėtų būti nekenksmingos pulpos, apydančio ir minkštiesiems audiniams. Iš jų neturėtų išsiskirti cheminiai komponentai, kurie patekę į kraujotaką, sukeltų sisteminį toksinį atsaką. Sudėtyje neturėtų būti alergijas sukeliančių medžiagų ir šios medžiagos turi neturėti kancerogeninio poveikio [165]. Kol kas nėra moksliškai pagrįstų klinikinių įrodymų, kad dervų pagrindu pagamintos odontologinės medžiagos ar iš jų išsiskyrę cheminiai junginiai
16
turi sisteminį pašalinį poveikį. Tai gali užtrukti eilę metų ar net dešimt-mečius, kol šių medžiagų sukeltas šalutinis poveikis pasireikš kliniškai [69].
Dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai plombavimo metu įvedami į kanalą „ką tik sumaišytos“, nepolimerizuotos būsenos. Po kanalo plomba-vimo nepilnai polimerizuoti ar nepolimerizuoti cheminiai šių medžiagų komponentai gali sukelti vietinį audinių atsaką [91]. Tiesioginio medžiagos kontakto su ląstelių kultūromis tyrimai atspindi klinikinę situaciją, kai dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai plombavimo metu patenka į viršūninio apydančio audinius. Netiesioginio kontakto su ląstelių kultūromis ar medžiagų ištraukomis tyrimai atspindi klinikinę situaciją, kai po užpildų polimerizacijos iš pastarųjų išsiskiria cheminiai junginiai ir difunduoja į apydančio audinius [193].
1.4. Odontologinių medžiagų tyrimo metodai
Prieš pradedant naudoti klinikinėje praktikoje, turi būti įvertintas odonto-loginių medžiagų biologinis suderinamumas, atliekant eilę standartizuotų tyrimų metodų. 1974 m. Autian su bendraautoriais pasiūlė pagrindinius šių medžiagų tyrimų metodų lygius [15]:
1. Patikrinimo metodai (nespecifinio toksiškumo). Tiriamas pradinis medžiagų toksiškumas ląstelių ir audinių kultūrose [153].
2. Panaudojimo metodai, atliekami su gyvūnais (specifinio toksiškumo); 3. Klinikiniai tyrimo metodai.
Šiandien įvairių medžiagų tyrimai in vitro ir in vivo atliekami remiantis Tarptautinės Standartų Organizacijos (ISO, Ženeva, Šveicarija 1992–2009) nustatytais tyrimo metodais. Šie standartai taikomi tiriant odontologines medžiagas [97] bei medicinines priemones [98]. Dokumentuose aprašomi rekomenduojami tiriamųjų pavyzdžių paruošimo būdai, citotoksiškumo, genotoksiškumo, karcinogeniškumo, reprodukcinio toksiškumo tyrimo metodai, taip pat vietinių reakcijų nustatymas po implantavimo, sudirginimo, sujautrinimo ir sisteminio toksiškumo įvertinimo metodai. In vivo tyrimo rezultatams gali daryti įtaką daug faktorių: daktaro patirtis, techninės medžiagos savybės, paciento organizmo ypatybės ir pan. Tuo tarpu in vitro tyrimų sąlygas bei įtakojančius faktorius galima kontroliuoti. Šie tyrimai yra paprasti, tikslūs, nesudėtingi, nebrangūs [200]. Tyrimai atliekami su ląstelių kultūromis gali suteikti svarbios informacijos apie galimus cheminių medžiagų poveikius specifinėms ląstelių ypatybėms ir suteikti labiau tinkamą ir aiškesnį paaiškinimą molekulinėms studijoms nei laboratoriniai tyrimai, atliekami su gyvūnais. Kelių metodų panaudojimas tiriant dantų
17
šaknų kanalų minkštuosius užpildus, gali suteikti daugiau informacijos apie pradinį šių medžiagų poveikį ląstelių kultūroms [243].
1.4.1. Ląstelių kultūros, naudojamos odontologinių medžiagų tyrimuose
Dervų pagrindu pagamintų dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų sukelto citotoksinio poveikio tyrimams naudojamos gyvūnų [7, 28, 29, 56, 102, 167, 243] ir žmogaus [35, 36, 56, 102, 240] ląstelių kultūros. 1.4.1 lentelėje pateikiamos dažniausiai minkštųjų užpildų citotoksiškumo įvertinimo tyrimams naudojamos pastoviosios ląstelių kultūros ir pirminės ląstelės, išskirtos iš burnos ertmės audinių [85, 102].
1.4.1 lentelė. Dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų citotoksiniam
įvertini-mui naudojamos ląstelių kultūros.
Ląstelės Literatūros šaltiniai
Ląstelių kultūros Pelių fibroblastai (L929) [28, 42, 56, 112, 141, 142, 158, 243] 3T3 ląstelių kultūros [7, 67, 122, 184]
HeLa [134, 141]
Kinų žiurkėnų plaučių fibroblastai (V79) [91, 143, 188] Žiurkių osteoblastai (ROS) 17/2,8 [12, 29, 167] Pelių osteoblastai (MC3T3-E1) [29, 34, 124] Žmogaus THP-1 monocitai [45]
Pelių makrofagai [47]
Žmogaus, į osteoblastus panašios ląstelės (MG63)
[240]
Makrofagai [197]
Žmogaus burnos vėžio ląstelės OC2 [91, 92] Žmogaus periferinio kraujo limfocitai [143] Žiurkių smegenų astrocitai [94]
Žiurkių hepatocitai [96]
Žiurkių pulpos ląstelės [112] Pirminės ląstelės,
išskirtos iš žmogaus burnos ertmės audinių
Pirminės žmogaus pulpos ląstelės [36, 102]
Žmogaus dantenų fibroblastai (HGF)) [17, 56, 107, 210] Žmogaus apydančio raiščio fibroblastai [85, 91, 122, 184] Žmogaus skruosto gleivinės fibroblastai [210]
18
Vis dar vyrauja prieštaringos nuomonės, kokias ląstelių kultūras geriau naudoti citotoksiškumo tyrimuose: pastoviąsias ar pirmines. Pastoviųjų ląstelių panaudojimo privalumas – jos gali daugintis ilgą laiką, kol bus mitybinės terpės. Tuo tarpu pirminės ląstelės turi apibrėžtą gyvavimo perio-dą nepriklausomą nuo mitybinės terpės. Al-Nazhan ir Spangberg (1990) atliko tyrimą, kuriame tyrė polimerinių dervų pagrindu pagamintų minkštųjų užpildų ištraukų toksinį poveikį žmogaus apydančio raiščio fibroblastams ir pelių fibroblastams (L929) [9]. Tyrimo metu buvo nustatytas chromo išsiskyrimas iš ląstelių bei skenuojančiu ir transmisiniu elektroniniu mikro-skopais įvertinti morfologiniai ląstelių pokyčiai. Nustatyta, kad apydančio raiščio ląstelės labiau atsparios citotoksiniam tirtų medžiagų ištraukų povei-kiui. Huang su bendraautoriais (2002 ir 2004) tyrė minkštųjų užpildų citotoksinį poveikį MTT (3-(4,5-dimetiltiazolio-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas) metodu panaudojant skirtingas ląstelių kultūras (osteosarkomos, žmogaus apydančio raiščio ir kinų žiurkėnų plaučių (V79) fibroblastus [91, 92]. Rezultatai parodė, kad citotoksinis tirtų medžiagų poveikis nepriklausė nuo ląstelių kultūros. Panašius rezultatus aprašė ir Brackett su bendraauto-riais (2010) [29]. Tyrime buvo naudojamos trys ląstelių kultūros: pelių fibroblastai (L929), žiurkių osteoblastai (ROS) 17/2,8 bei pelių osteoblastai MC3T3-E1 ir minkštųjų užpildų citotoksinis poveikis nustatytas MTT testu. Gauti rezultatai parodė, kad tirtos medžiagos panašiai veikė visas ląstelių kultūras. MC3T3 ląstelės buvo reikšmingai jautresnės nei L929 ar ROS ląstelių kultūros. Įvairių tyrimų taikymas ar skirtingų parametrų nustatymas labai įtakoja medžiagų citotoksiškumo tyrimų rezultatus, tačiau panašūs rezultatai, gauti atlikus daugelį tyrimų su ląstelių kultūromis, gali efektyviai apibūdinti dervų pagrindu pagamintų minkštųjų užpildų poveikį [70].
1.4.2. Ląstelių/medžiagos kontaktas
Biologiniam odontologinių medžiagų poveikiui įvertinti labai svarbus ląstelių ir tiriamosios medžiagos santykis. Dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai gali patekti į viršūninio apydančio audinius plombavimo metu. Iš šių medžiagų į aplinkinius audinius gali išsiskirti cheminiai junginiai ar/ir irimo produktai, kurie gali būti transportuoti į kitas organizmo vietas [92]. Todėl citotoksiškumo tyrimuose būtina tirti kietus užpildų pavyzdžius ir jų ištraukas. Atliekant šiuos tyrimus, ląstelės su tiriamosiomis medžiagomis gali sąveikauti tiesiogiai, netiesiogiai (per filtrą) arba su medžiagų ištrau-komis [148].
19
1. Tiesioginis kontaktas
Tiesioginis, netirpių vandenyje odontologinių medžiagų, kontaktas su ląstelėmis pasiekiamas keliais būdais [148]:
Tiriamasis pavyzdys uždedamas kiek galima glausčiau ant audinio gabaliuko.
Tiriamasis pavyzdys uždedamas ant vienasluoksnės ląstelių kultūros.
Tiriamasis pavyzdys patalpinamas į ląstelių kultūrų indą, užpilama ląstelių suspensijos, kad pastarosios prisitvirtintų aplink medžiagos pavyzdį.
Ląstelės auginamos tiesiogiai ant tiriamosios medžiagos pavyzdžio. Šiuo metodu vertinamas atstatomųjų odontologinių medžiagų [232],
dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų [192, 243] toksinis poveikis ląstelėms.
Tiesioginio medžiagos kontakto su ląstelių kultūromis tyrimai atspindi klinikinę situaciją, kai minkštieji užpildai plombavimo metu patenka į viršūninio apydančio audinius [193].
2. Netiesioginis kontaktas
Taikant ląstelių/tiriamosios medžiagos netiesioginio kontakto metodą, medžiagos atskiriamos nuo ląstelių, pvz., filtru. Šis testas nepriklauso nuo medžiagos fizikinės būsenos ir gali būti naudojamas tirti kietas, pusiau kietas ir skystas medžiagas. Tiriamasis pavyzdys nenardinamas į ląstelių kultūrą, todėl galima tirti ir nesukietėjusias medžiagas [169]. Pirmasis ne-tiesioginio ląstelės/tiriamosios medžiagos kontakto, agaro uždengimo/di-fuzijos (angl. „agar overlay/diffusion“) tyrimo metodą 1967 m. aprašė Guess su bendraautoriais [76]. Juo nustatomas citotoksinis, per agaro sluoksnį, dengiantį vienasluoksnių ląstelių kultūrą, iš tiriamosios medžiagos išsisky-rusių ir difundavusių komponentų poveikis. Šis metodas naudojamas odon-tologinių medžiagų biosuderinamumui įvertinti [42, 147]. Kaip tarpininką tarp tiriamosios medžiagos ir ląstelių kultūros galima naudoti ir sintetinį filtrą, pvz., Millipore [236] ar dentino griežinėlį [221]. Filtras yra plonas ir ląstelės dažnai įauga į poras: taip susidaro glaudus kontaktas tarp tiriamosios medžiagos ir ląstelių. Taip netgi iš vandenyje netirpių medžiagų išsiskyrę komponentai pasiekia ląsteles [148]. Šis metodas naudojamas ir dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų citotoksiniam poveikiui nustatyti [134, 192, 19].
3. Kontaktas su medžiagų ištraukomis.
Ląstelės ir netirpios tiriamosios medžiagos gali kontaktuoti, naudojant emulsiklį ar ištirpinus pastarąsias tirpiklyje, kad išsiskirtų cheminiai jungi-niai. Tiriamosios medžiagos gali būti ištirpintos įvairiuose tirpikliuose: di-metilo sulfokside (angl. dimethyl sulphoxide), etanolyje, ląstelių kultūrų terpėje, distiliuotame vandenyje, fiziologiniame tirpale [148]. Pastaraisiais metais šis metodas dažnai naudojamas įvairių odontologinių medžiagų
20
citotoksiškumui įvertinti: atstatomųjų [72, 137, 138, 199], endodontinių [18, 102, 184], dantų protezavimo [16, 231]. Netiesioginio kontakto su ląstelių kultūromis ar medžiagų ištraukų tyrimai atspindi klinikinę situaciją, kai po minkštųjų užpildų polimerizacijos (sustingimo) iš pastarųjų išsiskiria chemi-niai jungichemi-niai ir difunduoja į viršūninio apydančio audinius [193].
1.4.3. Odontologinių medžiagų citotoksiškumo tyrimo metodai
Citotoksiškumas – molekuliniai pokyčiai ląstelėje, kurie sukelia ląstelinius, funkcinius, struktūrinius pažeidimus. Citotoksiniam odontologinių medžiagų ar jų ištraukų poveikiui nustatyti naudojami įvairūs tyrimai, kuriais įvertinami morfologiniai ar kiekybiniai – ląstelių gyvybingumo, dauginimosi ir funkci-niai pakitimai (apoptozė, prisitvirtinimas, migracija, tam tikrų medžiagų išsiskyrimas) [71, 97, 98, 148]. Verta paminėti, kad skirtingai pamatuoti ląste-lių gyvybingumo rezultatai gali nekoreliuoti tarpusavyje. Pavyzdžiui, memb-ranos integralumu paremti testai leidžia nustatyti ląsteles su sveikomis, funk-cijonuojančiomis membranomis, tačiau tokios ląstelės nebūtinai yra besidau-ginančios. Ląstelių gyvybingumo metodus galima suskirstyti į penkias pagrindines grupes (1.4.3.1 lentelė).
1.4.3.1 lentelė. Ląstelių gyvybingumo tyrimo metodai [160].
Nr. Metodų grupė
Metodas Metodo principas Literatūros
šaltiniai 1. Membranų
vientisumas
• Dažymas (tripano mėliu, fluo-rescuojančiais dažais)
• LDH (laktatdehidrogenazės) išsiskyrimas
Nustatomas memb-ranų vientisumas pagal dažų patekimą į gyvas ląsteles ar fermentų bei kitų junginių išsiskyrimą iš ląstelės. [85, 107] 2. Funkcijų tyri-mas (gyvy-bingumas, dauginimasis) • 3-[4,5-di-metiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolo (MTT), XTT • Kristalinio violeto/rūgštinės fosfatazės - Alamaro mėlio dažo oksidacija – redukcija
Tiriami metabolitai [7, 27–29, 56, 67, 85, 102,]
3. DNR žymėjimas
• Fluorescuojantys konjugatai Nuosekli ląstelių atranka ir gyvybin-gumo tyrimas 4. Morfologijos
tyrimas
• Mikroskopinis stebėjimas Morfologinių ląstelės pokyčių nustatymas 5. Reprodukcija • Kolonijų formavimas Nustatomas ląstelių
21
Dažniausiai atliekami ląstelių membranų vientisumo ir ląstelės funkcijų tyrimai. Membranų vientisumo tyrimais matuojamas ląstelių gebėjimas apsisaugoti nuo ekstraląstelinių molekulių patekimo. Šie metodai gali būti kolorimetriniai ar fluorescenciniai. Jais galima įvertinti ląstelių gyvybin-gumą [153]. Šiuose tyrimuose naudojami įvairūs dažai (1.4.3.2 lentelė) ir ląstelės, kurių pakitęs plazminės membranos pralaidumas nusidažo, o nepažeistos (gyvos) ląstelės – nenusidažo, t. y., dažai nepraeina pro plazmi-nę membraną. Dažniausiai naudojamas dažas – tripano mėlis. Taip pat naudojamas fluorescuojantis dažas propidžio jodidas (PI), kuris prisitvirtina prie ląstelės DNR ir fluorescuoja. Nusidažiusios ir nenusidažiusios ląstelės skaičiuojamos šviesiniu ar fluorescenciniu mikroskopu ir/ar tėkmės cito-metru [25]. Pagrindinis šių membranų vientisumo tyrimų trūkumas yra tai, kad citotoksiniai pakenkimai pirmiausia yra viduląsteliniai. Taigi ląstelės gali būti negrįžtamai pažeistos, o plazminė membrana – intaktinė. Lyginant su kitais tyrimais, pastarieji nepakankamai įvertina ląstelių pažeidimus. Nepaisant to, kai kurie membranų vientisumo tyrimai yra plačiai naudojami citotoksiškumo įvertinimui [25, 85, 107].
Ląstelės funkcijų tyrimo metodais nustatoma fermentų aktyvumo ar metabolitų koncentracijos pokyčiai, veikiant toksiniams veiksniams. Šie ty-rimai labiau kompleksiški nei membranų vientisumo tyty-rimai. Tačiau jų pa-grįstumui reikalingos labai tikslios eksperimento sąlygos, kad nebūtų re-zultatų iškraipymo. Nepaisant šių trūkumų, tyrimo metodai yra gana popu-liarūs, nes jais galima nesunkiai nustatyti normalų ar sumažėjusį ląstelių me-džiagų apykaitos lygį, kurį galima vertinti kaip metabolinį ląstelių gyvybin-gumą, nors tai neatspindi ląstelių gebėjimo daugintis [153]. Plačiausiai iš
funkcinių ląstelių gyvybingumo tyrimų yra naudojamas MTT (-3-[4,5-di-metiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolo) tyrimas, nes tai paprastas, greitas ir tikslus tyrimo metodas [54]. Kolorimetriniu MTT tyrimu nustatomas ląstelių gyvybingumas, vertinant mitochondrijų sukcinato dehidrogenazės aktyvu-mą. Šis tyrimas paremtas vandenyje tirpios metiltiazolio tetrazolio druskos virtimu į netirpų purpurinį foramazaną. Pastarasis ištirpinamas ir jo koncent-racija nustatoma spektrofotometru. Susidariusio formazano kiekis tiesiogiai proporcingas gyvų ląstelių skaičiui. Negyvos ląstelės nesugeba skaidyti įvairių tetrazolio druskų [25, 54].
22
1.4.3.2 lentelė. Prie ląstelės DNR prisitvirtinantys dažai, naudojami ląstelių
membranų pralaidumo tyrimams [25]
Prie ląstelės DNR
prisitvirtinantys dažai Ląstelės, kurias nudažo Spalva Gyvos ląstelės Negyvos ląstelės Branduolys(DNR) Citoplazma (RNR) Akrilino oranžinis (akriline orange)
Taip Taip Žalia Raudonai
oranžinė
Hoechst33342 Taip Taip Mėlyna Ne
Hoechst 33258 Ne Taip Mėlyna Ne
DAPI Ne Taip Ryškiai mėlyna Ne
Etidžio bromidas (ethidium bromide)
Ne Taip Oranžinė Švelniai
raudona Propidžio jodidas
(propidium iodide)
Ne Taip Raudona Ne
Nekrozė – ląstelės žūtis, kuri ištinka ląstelę tuomet, kai žalingas poveikis būna labai stiprus ir viršija ląstelės galias išgyventi arba „žūti tvarkingai“ (apoptozė). Nekrozę gali sukelti staigus fiziologinių sąlygų pasikeitimas (pvz.: hipoksija ir ypač išemija), toksinai (bakteriniai, augaliniai, gyvūnų), cheminės medžiagos, fiziniai veiksniai, mechaniniai sužalojimai, kiti fakto-riai (virusai, imuniniai faktofakto-riai, aktyvavęsi fermentai). Nekrozės metu padi-dėja ląstelės organelės, ypač mitochondrijos, vėliau pratrūksta plazminė membrana (ląstelės lizė). Ląstelė išskiria citoplazmos komponentus į tarp-ląstelinę ertmę, todėl pakenkia aplinkinėms ląstelėms sukeldama uždegi-minę reakciją [25]. Apoptozė labai svarbi reguliuojant ląstelių augimą ir diferenciaciją. Ją gali sukelti tie patys ląstelę žalojantys veiksniai, kaip ir nekrozę, tik silpnesni. Šiam procesui būdingi morfologiniai požymiai – ląstelės susitraukimas, branduolio chromatino sutankėjimas, branduolio bei citoplazmos kondensacija ir branduolio bei citoplazmos susiskirstymas į membrana dengtus fragmentus – apoptozinius kūnelius [44] (1.4.3 pav.). Pastaruosius greitai atpažįsta ir fagocituoja gretimos ląstelės ir makrofagai [182]. Apoptozė – aktyvi ląstelės žūties forma, kuriai reikalinga ląstelės apykaita. Taigi ląstelių funkcijų, kaip ir membranos pralaidumo, tyrimai, gali nepakankamai įvertinti ląstelės pažeidimus ir nustatyti žūtį tik vėlesnėse apoptozės stadijose, kada sulėtėja ląstelės apykaita. Nepaisant šio trūkumo, šie tyrimai labai naudingi įvertinant medžiagų toksinį poveikį ląstelių kultū-roje 24–96 val. laikotarpyje [25]. Dažniausiai apoptozė nustatoma nudažius gyvas ląsteles fluorescuojančiais dažais, kurie prisijungia prie DNR. Pro fluorescencinį mikroskopą matomos ryškios kondensuoto ir fragmentuoto chromatino sankaupos (1.4.3 pav.). Taip pat apoptozę galima nustatyti ir
23
ląstelių branduolius dažant rūgštiniais dažais, norint nustatyti pažeistą DNR (angl. Single-Cell Gel Electrophoresis), panaudojant Annexin V, mito-chondrijų dažus, jonų indikatorius, įvertinant kaspazių aktyvumą [148].
1.4.3 pav. Kultyvuojamos žiurkių požandikaulinės seilių liaukos
ląstelės (SM 10-12). Fluorescencinė mikroskopija, dažyta propidžio jodidu ir Hoechst 33342 dažais. Nuotraukoje matomos tik gyvos ir
apoptozinės ląstelės.
Nedaug literatūroje aptikta duomenų apie dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų sukeliamą ląstelių nekrozę [92] ar apoptozę [18].
1.4.4. Dantų šaknų kanalų minkštųjų užpildų citotoksiškumo tyrimai 1.4.4.1. Epoksidinių dervų pagrindu pagaminto AH Plus citotoksinis poveikis
Kadangi epoksidinių dervų pagrindu pagamintas AH Plus gana seniai naudojama klinikinėje praktikoje, tyrimai apie šios medžiagos citotoksinį poveikį gana plačiai aprašyti. Dažniausiai šio poveikio nustatymui buvo atliekami ląstelių gyvybingumo, panaudojant įvarius dažus, filtro difuzijos, MTT tyrimai (1.4.4.1.A. ir B lentelės).
„Ką tik sumaišytas“, nepolimerizuotas epoksidinių dervų pagrindu pagamintas dantų šaknų kanalų minkštasis užpildas AH Plus pasižymėjo nuo silpno iki stipraus citotoksiniu poveikiu [94, 141, 142, 188, 192, 243]. Ši medžiaga [134, 141, 192, 243] ar jos ištraukos [92, 143, 188] tiesiogiai kontaktuodamos toksiškai veikė ląstelių kultūras. Citotoksinis šios medžia-gos poveikis priklausė nuo koncentracijos ir poveikio laiko. Kuo didesnė tiriamosios medžiagos koncentracija, tuo stipresnis toksinis poveikis tiria-mųjų ląstelių kultūroms [92, 94]. Azar su bendraautoriais nustatė nepolime-rizuoto AH Plus toksinį poveikį žmogaus dantenų fibroblastams, kuris išnyko praėjus 4 val. [17]. Miletić su bendraautoriais (2005) nustatė
stipres-24
nį AH Plus citotoksiniu poveikį po 1, 24 ir 48 val. nei po 7 d. ir 1 mėn. [142]. Citotoksinio „ką tik sumaišytos“, nepolimerizuotos būsenos AH Plus poveikio tyrimų apžvalga išdėstyta 1.4.4.1.A lentelėje.
„Sutingusios“, polimerizuotos būsenos AH Plus netoksiška ląstelėms arba citotoksinis poveikis minimalus [7, 56, 102, 122, 134, 158, 188, 197, 243]. Literatūroje aptikta prieštaringų rezultatų, kuriuose aprašomas nuo vidutinio iki stipraus AH Plus toksinis poveikis ląstelėms [42, 93, 94, 141].
Polimerizuotos būsenos AH Plus citotoksinio poveikio tyrimų apžvalga išdėstyta 1.4.4.1.B lentelėje.
25
1.4.4.1.A lentelė. Nepolimerizuotos būsenos AH Plus toksinio poveikio ląstelių kultūroms tyrimų apžvalga.
Tyrimai Tiriamosios medžiagos
būsena
Koncentracija Inkubacinis
periodas
Citotoksinis poveikis Literatūra
1 2 3 4 5 6 I. Ląstelių gyvybingumo nustatymas, panaudojant dažus Tiesioginis/ netiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra
--- 30 min., 1 val., 4 val., 24 val.
Citotoksiška [192]
Ištraukos po 24 val. Neskiesta 10%, 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001%, 0,0001%
24 val. Tik neskiesta ir 10% AH Plus ištrauka sukėlė citotoksinį poveikį
[45]
Tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra po 1 val., 24 val., 48 val., 7d., 1 mėn.
--- 5 d. Stiprus citotoksinis poveikis po 1, 24, 48 val., kuris laikui bėgant (po 7 d. ir 1 mėn.) silpnėjo
[142]
Ištraukos po 1val., 24 val., 7d. 1,67 g/ml, 5,57 g/ml, 16,7 g/ml, 55,7, g/ml 167 g/ml
72 val. Stiprus citotoksinis poveikis [143]
Ištraukos po 24 val. --- 24 val. Silpnas toksinis poveikis [188] Tiesioginis kontaktas su
ląstelių kultūra
--- 24 val.
48 val. 120 val.
Stiprus citotoksinis poveikis [141]
Ištraukos po 1, 4, 8, 24, 48 val., 5d., 1, 2, 4, 5 sav.
Neskiesta 22 val. Pradinis citotoksinis poveikis (iki 4 val.), vėliau necitotoksiška
[17] Tiesioginis kontaktas su
ląstelių kultūra
--- 24 val.
48 val.
Silpnas toksinis poveikis [112] II. Millipore filtro difuzijos testas Netiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra
--- 2 val. Vidutinis citotoksinis poveikis [243] Tiesioginis/netiesioginis
kontaktas su ląstelių kultūra
26
1.4.4.1.A lentelės tęsinys.
1 2 3 4 5 6
III. MTT Ištraukos po 7d. Neskiesta
1:10
48 val. Neskiesta - silpnai citotoksiška. Skiesta - necitotoksiška
[7] Ištraukos po 24 val. 0,02; 0,1; 0,5; 2,5;
12,5 mg/100 μl
24 val. Citotoksinis poveikis priklauso nuo koncentracijos. Mažos koncentra-cijos necitotoksiška ar poveikis silpnas
[92]
Ištraukos po 24 val. 0,01; 0,02; 0,04; 0,08; 0,1 mg/ml
24 val. Citotoksinis poveikis priklauso nuo koncentracijos. Didinant koncentra-ciją – citotoksinis poveikis stiprėja
[94] IV. Kiti tyrimai Laktato dehidrogenaz ės išsiskyrimas Ištraukos po 24 val. 0,01; 0,025; 0,04; 0,05; 0,1%
1 val. Silpnas citotoksinis poveikis, priklauso nuo koncentracijos
[96]
Laktato dehidrogenaz ės
išsiskyrimas
Ištraukos po 24 val. 0,01; 0,04; 0,1% 4 val., 10 val., 24 val.
Citotoksiška, poveikis priklauso nuo laiko ir koncentracijos
[93]
Sulforhodami no B tyrimas
27
1.4.4.1.B lentelė. Polimerizuotos būsenos AH Plus toksinio poveikio ląstelių kultūroms tyrimų apžvalga.
Tyrimai Tiriamosios medžiagos
būsena
Koncentracija Inkubacinis
periodas
Citotoksinis poveikis Literatūra
1 2 3 4 5 6 I. Ląstelių gyvybingumo nustatymas, panaudojant dažus Ištraukos po 24 val. 1:1; 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32
24 val. Tik 1:1 ir 1:2 koncentracijos AH Plus ištrauka sukėlė citotoksinį poveikį
[35]
Ištraukos po 1 val., 24 val., 7 d.
1,67; 5,57; 16,7 ; 55,7; 167 g/ml
72 val. Citotoksinis poveikis nuo vidutinio iki stipraus
[143]
Ištraukos po 24 val. --- 24 val. Necitotoksiška [188]
II. Milliporo/ agaro filtro difuzijos testas
Netiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra
--- 2 val. Silpnas citotoksinis poveikis [243] Tiesioginis/netiesiogini
kontaktas su ląstelių kultūra
--- 2 val. Necitotoksiška [134]
Tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra
--- 48 val. Stiprus citotoksinis poveikis [42] III. MTT/MTS
tyrimas
Ištraukos po 1, 4, 7 d. Neskiesta, 25%, 50% 24 val. 72 val.
Necitotoksiška arba toksinis poveikis silpnas
[102] Ištraukos po 72 val. Neskiesta, 50%, 25%
12,5%
24 val. 72 val.
Silpnai citotoksiška [240]
--- Neskiesta 24 val. Silpnai citotoksiška [243]
Ištraukos 10% 1 val. Necitotoksiška [197]
Ištraukos po 7 d. Neskiesta 72 val., 1,2 3, 4, 5 sav.
Stiprus pradinis citotoksinis poveikis
[167] Tiesioginis kontaktas su
ląstelių kultūra
--- 72 val. Stiprus pradinis toksinis poveikis, kuris palaipsniui mažėjo
28
1.4.4.1.B lentelės tęsinys.
1 2 3 4 5 6
III. MTT/MTS tyrimas
Ištraukos po 8 val. ir 7d. Neskiesta 24 val. Stiprus padinis toksinis poveikis, vėliau necitotoksiška arba toksinis poveikis silpnas
[56]
Tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra
--- 24 val., 72 val. Citotoksinis poveikis - nuo vidutinio iki stipraus
[27] Ištraukos po 24 val. 0,02; 0,1; 0,5; 2,5;
12,5 mg/100μl
24 val. Citotoksinis poveikis priklauso nuo koncentracijos. Mažos
koncentracijos necitotoksiška ar poveikis silpnas
[92]
Ištraukos po 48 val. Neskiesta 24 val. 48 val. 72 val.
Silpnas citotoksinis poveikis [158] Ištraukos po 24 val., 48 val.,
72 val., 7 d.
Neskiesta 24 val. Vidutiniškai citotoksiškas pirmą parą, vėliau - citotoksinis poveikis sparčiai silpnėjo
[91]
Ištraukos po 7 d. 1/2; 1/4; 1/8; 24 val. Silpnas citotoksinis poveikis [94] Ištraukos po 24 ir 72 val. Neskiesta 20 val. Silpnas citotoksinis poveikis [210] IV. Kiti
tyrimai Tėkmės citometrija
Ištraukos po 72 val. Neskiesta 72 val. Sulėtėjęs ląstelių dauginiamasis [240] Ištraukos po 24 val. Neskiesta
1:2
24 val. Neskiesta – silpnas citotoksinis poveikis, skiesta - necitotoksiška
29
1.4.4.2. Metakrilatų polimerų pagrindu pagaminto EndoREZ citotoksinis poveikis
Pastarąjį dešimtmetį pradėti gaminti ir naudoti klinikinėje praktikoje metakrilatų polimerų pagrindu pagaminti dantų šaknų kanalų minkštieji užpil-dai. Gana plačiai naudojami – II kartos – nereikalaujantys ėsdinimo (EndoREZ (Ultradent Products Inc, South Jordan, UT, JAV), III kartos – savaime besijungiantys (Epiphany (SybronEndo, Orange, CA, JAV) ir IV kartos – savaime besiėsdinantys ir besijungiantys Epiphany SE (SybronEndo, Orange, CA, JAV).
Nedaug atlikta tyrimų, kurie nustatė metakrilatų polimerų pagrindu paga-minto minkštojo užpildo EndoREZ toksinį poveikį ląstelėms [47, 56, 12, 7, 102, 26]. Aprašytas nuo vidutinio iki stipraus toksinis poveikis įvairioms ląstelių kultūroms, nepriklausomai nuo medžiagos polimerizacijos laipsnio ar kontakto su ląstelių kultūra, kuris laikui bėgant nesilpnėjo [7, 12, 26, 47, 26]. Tik Karapınar-Kazandağ su bendraautoriais atliktame tyrime nenusta-tytas EndoREZ citotoksinis poveikis arba jis buvo minimalus [102]. EndoREZ citotoksiškumo tyrimų apžvalga išdėstyta 1.4.4.2. A ir B lentelėse.
1.4.4.2.A lentelė. Nepolimerizuotos būsenos EndoREZ toksinio poveikio
ląstelių kultūroms tyrimų apžvalga.
Tyri-mai Būsena Koncent-racija Inkubacinis periodas Citotoksinis poveikis Literatūra MTT Tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra 24 val., 48 val., 1 sav. Vidutinis citotoksinis poveikis, po 1 sav. – stiprus [26] Ištraukos po 7 d. --- 24 val., 72 val. Stiprus citotoksinis poveikis [117] Tiesioginis kon-taktas su ląstelių kultūra, ištraukos po 7 d. Neskiesta 1:10
48 val. Neskiesta – viduti-niškai citotoksiška Skiesta – silpnai citotoksiška
30
1.4.4.2.B lentelė. Polimerizuotos būsenos EndoREZ toksinio poveikio
ląste-lių kultūroms tyrimų apžvalga.
Tyrimai Būsena
Koncent-racija
Inkubacinis periodas
Citotoksinis poveikis Lite-ratūra I. MTT Ištraukos po 1,4,7 d. Neskiesta, 25%, 50% 24 val., 72 val. Necitotoksiška arba toksinis poveikis silpnas
[102] Ištraukos po 7 d. --- 24 val., 72 val. Stiprus citotoksinis poveikis [117] Tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra 4 d. Neskieta 72 val., 1, 2, 3, 4, 5 sav. Stiprus citotoksinis poveikis [12] Ištraukos po 8 val. ir 7d.
Neskiesta 24 val. Stiprus citotoksinis poveikis [56] Tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra Neskiesta 24 val., 48 val., 1 sav. Stiprus citotoksinis poveikis [26] II. Kiti tyrimai Aktyvių deguonies formų susi-darymas Suspencijos 9; 18 mg/ml 1 val. 24 val. Vidutinis citotoksinis poveikis [47]
1.4.4.3. Metakrilatų polimerų pagrindu pagaminto Epiphany citotoksinis poveikis
Metakrilatų polimerų pagrindu pagaminto minkštojo užpildo Epiphany citotoksiškumo tyrimuose gauti rezultatai panašūs. Ši medžiaga pasižymi toksiniu poveikiu įvairioms ląstelių kultūroms, nepriklausomai nuo tyrimo rūšies, medžiagos koncentracijos ar inkubacinio periodo [27, 28, 35, 56, 67, 85, 102, 107]. Laikui bėgant šios medžiagos toksinis poveikis mažėja, tačiau vis tiek išlieka vidutiniškai stiprus [85, 107]. Epiphany citotoksiškumo tyrimų apžvalga išdėstyta 1.4.4.3. A ir B lentelėse.
31
1.4.4.3.A lentelė. Nepolimerizuotos būsenos Epiphany toksinio poveikio
ląs-telių kultūroms tyrimų apžvalga.
Tyrimai Būsena
Koncent-racija Inkubacinis periodas Citotoksinis poveikis Lite-ratūra I. Ląstelių gyvybingumo nustatymas, panaudojant dažus Tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra
--- 1 val. Stiprus citotoksinis poveikis [107] Ištraukos 25, 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml 24 val., 48 val., 72 val. Citotoksinis povei-kis priklauso nuo koncentracijos. Mažos koncentra-cijos necitotoksiška ar poveikis silpnas [85] II. Milliporo/ agaro filtro difuzijos testas Tiesioginis/ne-tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra
--- 2 val. Vidutinis citotoksi-nis poveikis [134] III. MTT Ištraukos po 7 d. --- 24 val., 72 val. Vidutinis citotoksi-nis poveikis [117] Tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra, ištraukos po 7d. Neskiesta 1:10
48 val. Neskiesta – stiprus citotoksinis povei-kis, skiesta –necito-toksiška [7] IV. Kiti tyrimai CyQuant ląstelių gyvy-bingumo tyrimas Ištraukos 25, 50, 100, 200, 400, 800 μg/ml 24 val., 48 val., 72 val. Citotoksinis povei-kis priklauso nuo koncentracijos. Mažos koncentra-cijos necitotoksiška ar poveikis silpnas
32
1.4.4.3.B lentelė. Polimerizuotos būsenos Epiphany toksinio poveikio
ląste-lių kultūroms tyrimų apžvalga.
Tyrimai Būsena
Koncent-racija Inkuba-cinis pe-riodas Citotoksinis poveikis Lite-ratūra I. Ląstelių gyvybingumo nustatymas, panaudojant dažus Ištraukos po 24 val. 1:32; 1:16; 1:8; 1:4; 1:2; 1:1
24 val. Vidutinis citotoksi-nis poveikis, priklau-so nuo koncentra-cijos [35] Tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra
--- 24 val. Vidutinis citotok-sinis poveikis [107] Tiesioginis/ netiesiogini kontaktas su ląstelių kultūra --- 2 val. Necitotoksiška [134] II. Millipo-ro/agaro filtro difu-zijos testas Ištraukos po 1,4,7d. Neskiesta, 25%, 50% 24 val. 72 val. Stiprus citotoksinis poveikis, priklau-somas nuo inkuba-cijos ir ištraukų trukmės [102] II. MTT Ištraukos po 7 d. 24 val. 72 val. Stiprus citotoksinis poveikis [117] Tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra
--- 72 val. Stiprus citotoksinis poveikis
[28]
Ištraukos po 8 val. ir 7 d.
Neskiesta 24 val. Stiprus citotoksinis poveikis [56] Tiesioginis kontaktas su ląstelių kultūra --- 24 val. 72 val. Citotoksinis poveikis nuo vidutinio (24 val.) iki stipraus (72 val.)
[27]
1.4.5. Dujų ir skysčių chromatografijos, masės spektrofotometrijos tyrimai
Chromatografija – medžiagų atskyrimo metodas, kai medžiagos pasi-skirsto tarp dviejų fazių: nejudančiosios (sorbento) ir judančiosios (eliuento). Ji naudojama ir junginiams atskirti, ir analizei. Medžiagų atskyrimas pagrįstas skirtingu mišinio komponentų judėjimo greičiu nejudančioje fazėje. Atsižvelgiant į chromatografinio sluoksnio formą, skiriami du chro-matografijos tipai: kolonėlinė ir plokštuminė. Kolonėlinės chrochro-matografijos metu nejudančioji fazė dedama į metalinį ar stiklinį vemzdelį (kolonėlę), per
33
kurį leidžiama judančioji fazė (skysčių, dujų chromatografija). Atsižvelgiant į judančiosios fazės pobūdį, chromatografija skirstoma į dujų ir skysčių. Medžiagos komponentų atskyrimo sėkmė priklauso nuo tinkamo kolonėlės, sorbento (nejudančios fazės), eliuento (judančios fazės), tirpiklio ir eksperi-mento sąlygų pasirinkimo [139]. Šio tyrimo metodo galimybių ribos atski-riant medžiagas mišiniuose, jas identifikuojant, kiekybiškai nustatant gali būti praplečiamos derinant šį metodą su elektrokinetiniais, elektrochemi-niais matavimais, elektroforeze ir masių spektrofotometrija ir kt. Fiksuojant detektoriumi ištekančio iš kolonėlės srauto sudėties kitimą, gaunama chro-matograma. Komponento ištekėjimą iš kolonėlės rodo smailė. Smailių skai-čius atitinka komponentų skaičių mišinyje, o aukštis ar plotas – tų kompo-nentų koncentraciją [118]. Medžiagos susilaikymas kolonėlėje išreiškiamas susilaikymo trukme (min.) [128].
Masių spektroskopinė analizė – tai medžiagų tyrimo metodas, kuriuo nustatoma medžiagos molekulių masė ir santykinis kiekis. Šia analize galima nustatyti visus elementus ir junginius, kuriuos galima paversti dujo-mis. Šis tyrimo metodas taip pat naudojamas organiniams junginiams atpa-žinti ir jų sandarai nustatyti [139].
Dujų/skysčių chromatografijos (medžiagų atskyrimui) ir masių spektro-metrijos (komponentų nustatymui ir identifikavimui) metodų panaudojimas kartu plačiai naudojamas laboratoriniuose medžiagų tyrimuose.
Odontologinės medžiagos, pagamintos dervų pagrindu, susideda iš besi-polimerizuojančios organinės matricos, neorganinio užpildo ir medžiagos, jungiančios šias sudėtines dalis [61]. Organinę matricą sudaro keleto (ko)mo-nomerų mišinys (pvz., Bis-GMA, UDMA, TEGDMA) ir papildomos priemaišos – (ko)iniciatoriai, stabilizatoriai, slopikliai. Po polimerizacijos reakcijos nemažas kiekis organinių junginių lieka nesusijungusių. Įvairūs, dervų pagrindu pagamintų odontologinių medžiagų komponentai (pvz., monomerai, stabilizatoriai, sužadintojai), gali išsiskirti iš šių medžiagų po nepilnai įvykusios sustingimo reakcijos (polimerizacijos) [224, 61]. Nusta-tyta, kad 15–50 proc. metakrilatų grupės monomerų lieka nesusijungę [61].
Tobulėjant medžiagų kokybei, per pastaruosius 15 metų šis skaičius ženkliai sumažėjo, tačiau vis tiek išlieka 1,5–5 proc. [73]. Organizme cheminiai komponentai gali išsiskirti ir veikiant organiniams tirpikliams (pvz., seilėms [136] ar vykstant medžiagų erozijai ir irimui [155]. Cheminį medžiagų irimą sukelia hidrolizė ar fermentinė katalizė. Nespecifinės bei žmogaus seilių esterazės gali nesunkiai sukelti dervų pagrindu pagamintų medžiagų irimą [70, 99]. Nesureagavusių monomerų ar medžiagų priemaišų išsiskyrimą gali sąlygoti ir terminiai, mechaniniai ar cheminiai veiksniai [73]. Šie junginiai gali išsiskirti į burnos ertmę arba per dentino sluoksnį difunduoti į pulpos
34
audinį [79]. Laboratoriniu būdu šie junginiai po polimerizacijos gali būti išskirti tirpinant medžiagas įvairiuose tirpikliuose: metanolyje, vandenyje, Ringerio tirpale [125, 137, 168]. Nustatyta, kad iš odontologijoje naudojamų derviniu pagrindu pagamintų medžiagų, išsiskiria daugiau nei 10 proc. nesureagavusių metakrilatų monomerų [61,212]. Šie išsiskyrę cheminiai komponentai veikia toksiškai [72, 149]. Geurtsen su bendraautoriais (1998) ištyrė 35 monomerų ir sudėtinių dervų priemaišų toksinius poveikius 3T3 ląstelių ir pirminių burnos ertmės fibroblastų kultūroms. Nustatytas (ko)mo-nomerų ir (ko)iniciatorių sukeltas nuo vidutinio iki didelio citotoksinis po-veikis [72].
Iš odontologijoje naudojamų sudėtinių dervų išsiskyrę cheminiai junginiai nustatomi atliekant dujų ir skysčių chromatografijos/masės spektrometrijos tyrimus. Taikant kartu šiuos tyrimo metodus galima atlikti kokybinę ir kiekybinę dervų pagrindu pagamintų medžiagų analizę [199]. Nustatyta, kad cheminiai junginiai išsiskiria iš dervų pagrindu pagamintų odontologinių medžiagų: derva modifikuotų stiklojonomerinių cementų [72], kompomerų [72], kompozicinių dervų [52, 111, 125, 137, 168, 199], ortodontinių plokštelių pagrindui naudojamų plastmasių [110]. Gana nese-niai pradėti gaminti ir naudoti klinikinėje praktikoje metakrilatų polimerų pagrindu pagaminti dantų šaknų kanalų minkštieji užpildai. Literatūroje nerasta duomenų apie iš šių medžiagų išsiskyrusius cheminius junginius bei jų toksinį poveikį.
1.4.6. Oksidacinis stresas, aktyvios deguonies formos, antioksidantai
Molekulinis deguonis (O2) būtinas gyvybiniams procesams. Tačiau jis
gali sukelti ir kitus oksidacinius procesus, pažeidžiančius biologines molekules: DNR, lipidus ir baltymus. Dar 1956 m. Harman iškėlė hipotezę, kad fermentinių redukcijos ir oksidacijos reakcijų metu, kaip šalutiniai produktai, ląstelėse susidaro deguonies radikalai ir kitos aktyvios deguonies junginių formos [83]. Jos visos bendrai yra vadinamos aktyviomis deguo-nies formomis (ADF) [83]. Tai yra atomai, jonai ar molekulės su vienu ar keliais nesuporuotais elektronais, kurie padidina jų reaktyvumą. Aktyvioms deguonies formoms priskiriami laisvieji radikalai (superoksido anijonas, hidroksilo radikalas, peroksilas ir alkoksilo radikalas), vandenilio peroksidas, singuletinis deguonis, hipochloritinė rūgštis [72]. Aktyvios deguonies formos susidaro taip: redukuojant deguonį pirmiausia susidaro superoksido anijonas (O2) [144]. Du superoksido anijonai susijungia, veikiami fermento
superoksido dismutazės (SOD), ir susidaro mažiau reaktyvus vandenilio peroksidas (H2O2). Vandenilio peroksidas, veikiant fermentui katalazei
