In vitro odos ir melanomos modelio kūrimas ir vertinimas Baigiamasis magistro projektas

Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Farmacijos fakultetas

In vitro odos ir melanomos modelio kūrimas ir vertinimas

Baigiamasis magistro projektas

Gabija Stašytė Projekto autorė

Dr. Aistė Jekabsone Vadovė

Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Farmacijos fakultetas

In vitro odos ir melanomos modelio kūrimas ir vertinimas

Baigiamasis magistro projektas

Medicininė chemija (6281CX001)

Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas

Lietuvos sveikatos mokslų fakultetas Farmacijos fakultetas

Gabija Stašytė

In vitro odos ir melanomos modelio kūrimas ir vertinimas

Akademinio sąžiningumo deklaracija

Patvirtinu, kad mano, Gabijos Stašytės, baigiamasis projektas tema „In vitro odos ir melanomos kūrimas ir vertimas“ yra parašytas visiškai savarankiškai ir visi pateikti duomenys ar tyrimų rezultatai yra teisingi ir gauti sąžiningai. Šiame darbe nei viena dalis nėra plagijuota nuo jokių spausdintinių ar internetinių šaltinių, visos kitų šaltinių tiesioginės ir netiesioginės citatos nurodytos literatūros nuorodose. Įstatymų nenumatytų piniginių sumų už šį darbą niekam nesu mokėjęs.

Aš suprantu, kad išaiškėjus nesąžiningumo faktui, man bus taikomos nuobaudos, remiantis Kauno technologijos universitete galiojančia tvarka.

Gabija Stašytė

Gabija Stašytė. In vitro odos ir melanomos modelio kūrimas ir vertinimas. Baigiamasis magistro projektas / vadovė Dr. A. Jekabsone; Kauno technologijos universitetas, Cheminės technologijos fakultetas; Lietuvos sveikatos mokslų fakultetas, Farmacijos fakultetas.

Studijų kryptis ir sritis (studijų krypčių grupė): chemija, fiziniai mokslai.

Reikšminiai žodžiai: in vitro odos modeliai, sintetiniai peptidiniai hidrogeliai, užląstelinis užpildas. Kaunas, 2020. 53 p.

Santrauka

Melanoma yra viena grėsmingiausių odos vėžio formų. Siekiant sukurti efektyvius vaistus kovoti su šia liga laboratorijose yra naudojami gyvūnai. Tačiau kai kurios gyvūnų organizmo fiziologinės savybės skiriasi nuo žmogaus, todėl tokiuose modeliuose gaunami rezultatai dažnai nepasitvirtina klinikiniuose tyrimuose. Be to, laboratorinių gyvūnų naudojimą siekiama apriboti dėl etinių aspektų. Todėl yra tikslinga kurti melanomos modelius iš žmogaus ląstelių. Ilgą laiką buvo naudojimi dvidimensiniai (2D) vienoje plokštumoje išsidėstę ląstelių monosluoksniai, tačiau atliekant įvairius tyrimus pastebėtas ryškus rezultatų neatitikimas lyginant su gaunamais in vivo sąlygomis. Todėl labratorijose siekiama sukurti efektyvius in vitro tridimensinius (3D) melanomos modelius, auginant iš šių ląstelių suformuotus sferoidus hidrogelinėse aplinkose.

Sekantis žingsnis kuriant į in vivo panašesnę biologinę mikroaplinką būtų tokius sferoidus kultivuoti ląstelių daugiasluoksniuose panašiuose į natūralią odą. Todėl šiame darbe buvo siekiama sukurti būtent tokį pilno storio odos modelį su melanomos sferoidais iš žmogaus ląstelių. Taip pat, siekiant sukurti lengviau standartizuojamą odos ir melanomos modelį preliminariesiems didelės apimties vaistų efektyvumo tyrimams, šiame tyrime pritaikėme sintetinius odos audinį imituojančius hidrogelius, kaip matricas melanomos sferoidams.

Pirmiausia, kabančių lašų ir kultivavimo ant nekibaus paviršiaus būdu buvo suformuoti A375 žmogaus melanomos ląstelių linijos sferoidai, kurie vėliau įterpiami į ties oro–skysčio sąlyčio riba (angl. air-liquid interface) audinių kultūrų įdėkluose sukurtą ląstelinį in vitro odos daugiasluoksnį, sudarytą iš žmogaus epidermio keratinocitų ir žmogaus dermos fibroblastų. Kaip neląstelinės odos alternatyva melanomos sferoidams, buvo pasirinktos sintetinės chemiškai susiūtos hidrogelinės odą imituojančios matricos, pagamintos iš polietilenglikolio konjunguoto su kolageną imituojančiu peptidu (angl. collagen like peptide, arba CLP, pilnas trumpinys – PEG-CLP), taip pat PEG-CLP, kuris buvo funkcionalizuotas fibronektino aktyviąja seka RGD arba laminino aktyviąja seka IKVAV. Buvo vertinama ląstelių iš sferoidų migracija ir proliferacija, fokalinių sukibimų skaičius, transepitelinė varža ir atlikta histologinė analizė. Apibendrinant tyrimų duomenis, sferoidų morfologija, struktūra, sąveika su aplinka bei artimesnės natūralioms sąlygoms buvo ląsteliniame modelyje, tačiau sintetiniai modeliai buvo palankesni ląstelių stebėjimui ir skirtingų užląstelinio užpildo peptidų signalų vertinimui.

Gabija Stašytė. Design and evaluation of in vitro skin and melanoma model. Master's Final Degree Project / supervisor PhD Aistė Jekabsone; Faculty of Chemical Technology, Kaunas University of Technology; Faculty of Pharmacy, Lithuanian Health Science University.

Study field and area (study field group): Chemistry, Physical Sciences.

Keywords: in vitro skin model, synthetic peptide hydrogels, extracellular matrix. Kaunas, 2020. 53 pages.

Summary

Melanoma is one of the most aggressive skin cancers. To design effective treatment for this condition, drug candidates are evaluated on animal models. However, the physiology of an animal organism in some aspects is different from that of a human, and this is the cause why many results obtained in such models are not confirmed in clinical trials. In addition, animal research has ethical issues. Therefore, there is a need of melanoma models made from human cells. Monolayer cell cultures are commonly used in laboratory practice, however, during recent years there has been increase in evidence that such planar 2D cell cultures fail to generate in vivo-relevant results due to the absence of natural tissue-mimicking environment. Therefore, there is an effort to design efficient in vitro 3D melanoma models by growing hydrogel-encapsulated spheroids of these cells.

The next step towards a more in vivo-relevant biological microenvironment would be the cultivation of such spheroids in cell multilayers similar to natural skin. Thus, the aim of this study was to elaborate a full thickness skin model with melanoma spheroids from human cells. Also, for early-phase high throughput drug efficiency screening, synthetic skin tissue mimicking crosslinked hydrogels made from polyethylene glycol conjugated with collagen like peptide (PEG-CLP), and PEG-CLP functionalized with fibronectin active sequence RGD, or laminin active sequence IKVAV, were applied as matrices for melanoma spheroids.

The samples were evaluated for melanoma cell migration from spheroids, cell proliferation, focal contact number, cell shape index, projected cell area, distribution of individual focal contact size in cells, cell viability, transepithelial resistance and histology. Sumarising the research data, spheroid morphology, structure, interaction with surrounding environment and more close to natural conditions were in the cellular skin model, however, synthetic models were more favourable for cell monitoring and evaluation of different extracellular matrix peptide signals.

Turinys

Lentelių sąrašas ... 8

Paveikslų sąrašas ... 9

Santrumpų ir terminų sąrašas ... 10

Įvadas ... 11

1. Literatūros apžvalga ... 13

1.1. Žmogaus odos sudėtis ir funkcijos ... 13

1.1.1. Epidermis ... 13 1.1.2. Derma ... 14 1.1.3. Hipoderma ... 14 1.2. Melanoma ... 14 1.3. Ląstelių kultūra ... 15 1.3.1. 2D ląstelių kultūra ... 16 1.3.2. 3D ląstelių kultūra ... 17

1.3.3. Mišrios kultūros sistema ... 18

1.4. Organotipinis modelis ... 18

1.5. Hidrogelis ... 19

1.5.1. Užląstelinio užpildo baltymai ... 20

1.5.2. Užląstelinio užpildo baltymus imituojantys peptidai ... 22

1.5.3. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 22

2. Medžiagos ir tyrimų metodai ... 24

2.1. Reagentai, priemonės ir aparatūra ... 24

2.2. Melanomos auginimas ... 25

2.2.1. Melanomos 2D ląstelių kultivavimas ... 25

2.2.2. Melanomos 3D ląstelių sferoidų formavimas ... 27

2.3. In vitro odos modelio formavimas ... 28

2.3.1. Pirminių žmogaus odos ląstelių kultivavimas ... 28

2.3.2. Odos dermos sluoksnio formavimas ... 28

2.3.3. Odos dermos sluoksnis su sferoidais ... 29

2.3.4. Odos epidermio sluoksnio formavimas ... 29

2.4. Melanomos augimas ir invazyvumas sintetiniame modelyje ... 30

2.4.1. Melanomos sferoidų migracija ... 30

2.4.2. Melanomos ląstelių proliferacija ... 31

2.4.3. Fokalinių sukibimų nustatymas imunocitochemijos būdu ... 31

2.5. Melanomos augimas ir invazyvumas ląsteliniame modelyje ... 32

2.5.1. Transepitelinė elektrinė varža ... 32

2.5.2. Imunohistocheminė analizė ... 33

2.5.3. Hematoksilino ir eozino dažymo metodas ... 33

2.5.4. Imunofluorescencija ... 34

2.6. Statistinė analizė ... 34

3. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas ... 35

3.1. Melanomos vertinimas ant sintetinio modelio ... 35

3.1.1. Melanomos A375 ląstelių migracija ant CLP, RGD ir IKVAV kolageno hidrogelių ... 35

3.1.3. Fokalinių sukibimų ir ląstelių morfologijos vertinimas ... 38

3.1.4. Koreliacinė analizė ... 40

3.2. Melanomos vertinimas ląsteliniame modelyje ... 40

3.2.1. Transepitelines elektrinės varžos vertinimas ... 40

3.2.2. Odos modelio imunohistocheminis dažymas ir vaizdinimas konfokaliniu mikroskopu ... 41

3.3. Tyrimų rezultatų apibendrinimas ... 44

Išvados ... 46

Literatūros sąrašas ... 47

Lentelių sąrašas

1 lentelė. Žmogaus melanomos A375 ląstelių kultūros sferoidai ant CLP, CLP-RGD ir CLP-IKVAV

hidrogelių po 24val ...30

2 lentelė. Daugiafunkcinio plokštelių skaitytuvo parametrai ...31

3 lentelė. Deparafinizavimo eiga ...33

4 lentelė. Dažymo eiga ...33

Paveikslų sąrašas

1 pav. Odos sandara [1] ...13

2 pav. (A) oda su išplitusia melanoma, (B) sveikos odos sluoksnis ...14

3 pav. Dvimatė (2D) ląstelių kultūra ...16

4 pav. Trimatė (3D) ląstelių kultūra ...17

5 pav. Sferoido kultivavimo metodai ...18

6 pav. Kolageno molekulės struktūra [55] ...21

7 pav. Melanomos A375 ląstelių vaizdas per šviesinį mikroskopą. Mastelis 100 µm ...25

8 pav. Ląstelių persėjimo eigos schema ...26

9 pav. Hemocitometro kamera ...26

10 pav. Pavaizduotos ląstelės nudažytos tripano mėliu hemocitometro kameroje ...26

11 pav. Schema parodanti, kaip skaičiuojamos ląstelės ...27

12 pav. „Kabančio lašo“ metodo schema ...27

13 pav. Žmogaus odos fibroblastai (viršuje) ir keratinocitai (apačioje). Mastelis 100 µm ...28

14 pav. In vitro odos modelio formavimas ląstelių kultūrų auginimo įdėkle ...29

15 pav. Keratinocitų sluoksnis (viršuje) ir fibroblastų su kolagenu I sluoksnis (apačioje) ...30

16 pav. Matavimui paruošta 6 šulinėlių plokštelė su įdėklais viduje ...32

17 pav. Voltommetro veikimo schema ...32

18 pav. Melanomos A375 ląstelių pasklidimo plotas ant sintetinių hidrogelių ...35

19 pav. Melanomos A375 pasklidusių ląstelių skaičius ant sintetinių hidrogelių ...36

20 pav. Skirtingos sudėties hidrogelinių paviršių įtaka melanomos proliferacijai po 24 val. ...37

21 pav. Skirtingos sudėties hidrogelinių paviršių įtaka melanomos proliferacijai po 48 val. ...37

22 pav. Skirtingos sudėties hidrogelinių paviršių įtaka melanomos fokalinių sukibimu skaičiui vienoje ląstelėje ...38

23 pav. A375 ląstelės konfokalinės fluorescencijos mikroskopija ...39

24 pav. Odos ir odos su melanoma modelių transepitelinė elektrinė varža ...41

25 pav. Odos ir melanoma modelio vaizdas nudažius hematoksilino ir eozino metodu ...42

26 pav. Odos ir melanomos konfokalinės fluorescencijos mikroskopija ...43

Santrumpų ir terminų sąrašas Santrumpos:

2D – dviejų dimensijų, plokštuminė (ląstelių kultūra); 3D – trijų dimensijų, erdvinė (ląstelių kultūra);

BSA – jaučio serumo albuminas (angl. Bovine Serum Albumin); CLP – kolageną imituojantys peptidas (angl. Collagen Like Peptide);

DMEM – Dulbecco modifikuota eagle ląstelių auginimo terpė (angl. Dulbecco’s Modified Eagle

Medium);

DMSO – dimetilsulfoksidas (angl. Dimethyl Sulfoxide); DNR – deoksiribonukleorūgštis;

EDTA – etilendiamintetraacetatas;

FBS – fetalinis veršelio serumas (angl. Fetal Bovine Serum); NGS – blokavimo serumas (angl. Normal Goat Serum);

PBS – fosfatinis druskos buferis (angl. Phosphate Buffered Saline); PEG – polietileno glikolis;

RNR – ribonukleino rūgštis;

RPMI – roswello parko memorialinio instituto ląstelių auginimo terpė (angl. Roswell Park Memorial

Institute);

Įvadas

Odos melanoma yra reta vėžio forma, bet nuo jos miršta daugiausiai sergančiųjų žmonių. Kasmet Lietuvoje užfiksuojama apie 320 naujų susirgimų. Statistikos duomenimis du trečdaliai iš jų yra moterys. Įrodyta, jog odos melanomai išsivystyti didžiausią poveikį turi saulė, nes intensyvus ultravioletinių spindulių kiekis yra didžiausias rizikos veiksnys odos vėžio vystymuisi. Melanomos gydymui priskiriamos keturios sritys – chirurgija, radioterapija, chemoterapija ir imunoterapija. Kol kas nei vienas iš šių būdu negali užkirsti kelio ligos atsinaujinimui.

Melanoma yra agresyvi odos vėžio forma, kurią vėlesnėse stadijose sunku gydyti įprastiniais chemoterapiniais vaistais. Ankstyvosios stadijos radialinio augimo fazės (RGP) melanoma gydoma chirurginiu būdu [2], tuo tarpu vertikaliosios augimo fazės (VGP) melanoma linkusi metastazuoti. Metastazavusi melanoma yra atspari vaistams ir būdingas vidutinis išgyvenimo laikas 6–10 mėnesių [1].

Siekiant sukurti veiksmingus vaistus prieš šią ligą, reikia atlikti daug ikiklininių ir klinikinių tyrimų. Būtina įdiegti pažangiausią programinę įrangą, kad būtų galima ištestuoti daugybę molekulių, kurias vėliau galima būtų panaudoti in vitro ir in vivo tyrimams [2].

Iki šiol laboratorijose naudojamos jūrų kiaulytės ir pelės. Su jomis atliekami toksiškumo ir jautrumo odai tyrimai in vivo. Tačiau, dėl etikos aspektų ir gyvūno fiziologijos neatitikimo žmogaus organizmui pradėta ieškoti kitų alternatyvų [3, 4]. Tokiems tyrimams atlikti didėja odos ir jos ligų in

vitro modelių poreikis. Ypač daug dėmesio skiriama ląsteliniam modelio formavimui su užląstelinio

užpildo matrica, kurie, kaip tikimąsi, ateityje galėtų pakeisti gyvūnų modelius [5].

Pilno storio odos ir melanomos modeliai gerai atspindi natūralią aplinką ir puikiai tinka vėlesniems farmakologinio efektyvumo testavimo etapams, kuriuose vertinamas jau atrinktų preparatų poveikis. Tačiau jie yra sudėtingi ir ilgai formuojami, be to, juos sunkiau standartizuoti – ir jų gamyba yra brangi. Dėl šių priežasčių juos sunkiau pritaikyti didelės apimties farmakologiniams testams (angl.

high throughput screening), kuriuose tiriamos didelės nenustatyto arba preliminariai nustatyto

efektyvumo junginių bibliotekos.

Šiame darbe buvo sukurtas tridimensinis (3D) odos modelis, panaudojant fibroblastų ir kolegano suspensiją kaip matrica, o jos paviršių padengiant keratinocitų ląstelėmis. Sukurtas konstruktas įvertintas imunohistologiniu tyrimu naudojant hematoksilino ir eozino dažymo metodą ir imunofluorescencijos būdu naudojant antikūnus prieš citokeratiną 14 (kuris būdingas nepilnai diferencijuotoms epidermio ląstelėms) ir prieš citokeratiną 10 (kuris būdingas diferencijuotoms suprabazalinių epidermio sluoksnių ląstelėms) [9]. Melanomos modelį sudaro žmogaus piktybinės melanomos (A375) ląstelės. Suformuoti vėžinių ląstelių sferoidai įterpti į pilno odos storio modelį. Daugiasluoksnis audinys auginamas ląstelių kultūros įdėkluose oro–skysčio sąlyčio riboje. Tridimensinis (3D) melanomos modelis struktūriškai artimas biologinėje aplinkoje augančiam navikui ir jo progresavimui in vivo [6, 7].

Alternatyvus metodas in vitro odos modeliui sudaryti yra hidrogelis, įmituojantis dermos sluoksnio matricą. Norint ištirti užląstelinio užpildo signalų reišmę melanomai, galima pritaikyti peptidais funkcionalizuotus sintetinius hidrogelius, atkartojančius odos audiniui būdingą cheminę sudėtį [8, 9]. Šiame darbe buvo pritaikyta sintetinė hidrogelinė matrica, pagaminta iš kolageną imituojančio peptido ir du jos analogai, papildyti laminino funkcionalia seka IKVAV ir fibronektino seka RGD.

Buvo ištirta žmogaus piktybinės melanomos ląstelių (A375) ląstelių sąveika su šiomis matricomis, analizuojant migraciją, proliferaciją ir fokalinius sukibimus [7, 8].

Darbo tikslas – sukurti in vitro pilno storio odos ir melanomos modelius, įvertinti jų funkcionalumą ir invazyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. panaudojant pirmines žmogaus melanomos A375 ląstelių liniją suformuoti integralius sferoidus;

2. pritaikant žmogaus odos ląstelių linijas suformuoti in vitro pilno storio odos modelį su melanomos sferoidais, įvertinti jo transepitelinę varžą, storį, struktūrą, specifinius žymenis; 3. įvertinti melanomos ląstelių migraciją, proliferaciją ir fokalinius sukibimus ant sintetinių odos

1. Literatūros apžvalga

1.1. Žmogaus odos sudėtis ir funkcijos

Oda yra didžiausias žmogaus organas, kuris sudaro apie 15 % viso suaugusio kūno svorio. Jo bendras plotas yra apie 2 m2_{. Fiziologinė odos struktūra susideda iš trijų sluoksnių: epidermio, dermos ir} hipodermos. Oda sudaryta iš dviejų rūšių pirminių ląstelių sluoksnių, kurie anatomiškai ir funkciškai sąveikauja tarpusavyje. Ji atlieka pasyvias ir aktyvias funkcijas, tokias kaip fizinio barjero užtikrinimas, temperatūros reguliavimas, apsauga nuo įvairių aplinkos teršalų bei šilumos ir drėgmės praradimo. Taip pat oda prakaito sekreciją, reguliuoja kraujotakos cirkuliaciją ir atlieka jutiminę funkciją [1].

1.1.1. Epidermis

Paviršinis epitelinis odos sluoksnis vadinamas epidermiu, jis susidaro iš embrioninės ektodermos. Tai plonas ląstelių sluoksnis, kurį sukuria epidermio bazinio sluoksnio keratinocitai, sudarantys 95 % šio sluoksnio ląstelių. Likusius 5 % sudaro melanocitai, Langerhanso ir Merkel ląstelės.

Melanocitai – sintetina melaniną, ir nuo jo intensyvumo priklauso odos pigmentacija. Langerhanso ląstelės kitaip vadinamos – dendritiniais makrofagais. Tai antigeną atpažįstančios ir kitiems imuninės sistemos komponentams tiekiančios ląstelės. Merkelio ląstelės priklauso difuzinei neuroendokrininei sistemai [9-11].

Pagal keratinocitų diferenciaciją epidermis skirstomas į penkis pagrindinius sluoksnius: – Pamatinis (lot. stratum germinativum);

– Dygliuotasis (lot. stratum spinosum); – Grūdėtasis (lot. stratum granulosum); – Blizgusis (lot. stratum lucidum); – Raginis (lot. stratum corneum).

Epidermio sluoksnis sudaro ploną apsauginį apvalkalą, kuris lengvai atsinaujina po traumos ir padeda išlaikyti drėgmę kūno viduje, tuo pačiu yra atsparus išorinei cheminei ir mikrobiologinei taršai. Epidermio sluoksnis yra labai svarbi apsaugine odos funkcija [9].

1.1.2. Derma

Tarp epidermio ir hipodermos esantis sluoksnis vadinamas derma arba tikrąją oda. Žmogaus odos dermos sluoksnis yra 0,5–5 mm storio. Sluoksnio storis atitinkamai skiriasi pagal kūno vietą – plonesnė derma yra akies voko srityje, o storesnė – nugaroje [1].

Derma skirstoma į du sluoksnius:

– Spenelinį (lot. stratum papillare); – Tinklinį (lot. stratum reticulare).

Pagrindinės sudėtinės amorfines medžiagos yra proteoglikanai ir gliukozoaminoglikanai. Sluoksnio sandara susideda iš elastino skaidulų (suteikia elastingumo), kolageno (suteikia stiprumo) ir kitų matricos baltymų [12].

Pagrindinės dermos ląstelės yra fibroblastai. Taip pat šiame sluoksnyje yra putliųjų ląstelių, makrofagų ir limfocitų. Derma yra stora pluoštinė dalis, suteikianti odai tvirtumo ir turinti kraujagysles, nervus bei papildomas struktūras, tokias kaip plaukų folikulai, prakaito liaukos ir riebalinės liaukos. Odos dermos sluoksnis maitina epidermį, nes pastarasis neturi kraujagyslių. Dermą nuo viršutinio epidermio skiria suprabazalinis sluoksnis (angl. supra-basal layers), susidarantis kaip užląstelinė matrica dėl nuolatinės sąveikos tarp abiejų odos sluoksnių [1, 13].

1.1.3. Hipoderma

Hipodermos sluoksnis dar vadinamas poodiniu sluoksniu, kurį sudaro jungiamojo audinio tinklas. Jis yra retos struktūros, o jo tarpus užpildo riebalų ląstelės, kurios organizmui sudaro termoreguliacinę apsaugą. Šis sluoksnis suteikia kūnui forma. Jame kaupiasi maistinės medžiagos, kurios vėliau tampa energijos šaltiniu. Poodinis sluoksnis amortizuoja mechaninius smūgius, bei suteikia odai stangrumo. Atsiradus didelėms riebalų sankaupoms formuojasi raukšlės [13].

1.2. Melanoma

Melanoma – piktybinis navikas, susidarantis iš melanocitų, kurie virsta vėžinėmis ląstelėmis dėl vidinių molekulinių ir biocheminių pokyčių. Melanocitai – ląstelės esančios pamatiniame sluoksnyje, giliausioje epidermio dalyje (2 pav). Jų pagrindinė funkcija – gaminti pigmentą melaniną, kuris apsaugo audinius nuo neigiamo UV spinduliuotės poveikio [14].

Melanomai progresuojant skirtingomis stadijomis pasireiškia būdingi genetiniai, morfologiniai ir histologiniai pokyčiai. Pirminė melanomos stadija prasideda tada, kai melanocitai ima nevaldomai daugintis. Padidėjusi proliferacija gėrybiniame navike gali tęstis iki pirmosios piktybinės stadijos, vadinamos radialine augimo faze. Šiame etape naviko ląstelės plečiasi epidermio sluoksnyje [1, 67]. Vėlesnė vertikalaus augimo stadija, kurios metu melanomos ląstelės invazyviai plečiasi į gilesnius odos sluoksnius link hipodermos. Galiausiai melanoma metastazuoja. Ši forma yra agresyviausia, nes ląstelės plinta visoje kraujotakos ir limfinėje sistemoje. Skverbiasi į tolimiausius organus, tokius kaip, kepenys, plaučiai ir smegenys. Iki šiol veiksmingiausia piktybinės melanomos terapija yra ankstyva diagnozė ir operacija [15].

Statistiniais duomenimis patvirtinta, jog melanoma sukelia mažiausią odos vėžio atvejų skaičių, tai yra mažiau nei < 10 %, bet jos agresyvumas ir didelis mirštamumas daro ją pavojingiausia odos vėžio forma [16].

Per pastaruosius penkis dešimtmečius buvo užfiksuotas nuolatinis melanomos susirgimų atvejų padidėjimas. Šis piktybinis sutrikimas buvo 19-oje vietoje tarp labiausiai paplitusių vėžio rūšių, kalbant apie atskiras šalis, didžiausias sergamumas užfiksuotas Australijoje, Naujojoje Zelandijoje, JAV (Šiaurės regionas) ir Europos šalyse (Šiaurės ir Vakarų regionai), o mažesnis sergamumas Pietryčių Azijoje ir Pietų Centrinėje Azijoje [17].

Melanomos atsiradimui reikšmingi rizikos veiksniai: – Odos tipas;

– Saulės spindulių poveikis; – Amžius;

– Lytis;

– Imuninė būklė; – Šeimos istorija;

– Anksčiau pašalinti odos apgamai [18]. 1.3. Ląstelių kultūra

1907 m. pirmąsias ląstelių kultūras aprašė Harisonas, kuris tyrinėjo nervinių ląstelių kilmę [19]. Nuo to laiko buvo atlikta daugybę in vitro eksperimentų, stebint ląstelių augimą dvidimensinėse kultūrose. Šiuolaikinių technologijų dėka, eksperimentus galima atlikti naudojant pirmines ląsteles, išskirtas tiesiai iš donoro audinių, arba naudojant žinomas ląstelių linijas, kurios laikomos ląstelių bankuose [20]. Bioresursų centrai, tokie kaip ATCC (Amerikos tipo kultūros kolekcija), siūlo įvairių rūšių vėžio ląstelių linijų modelius, kuriuos galima naudoti tyrimuose.

Ląstelių kultūros leidžia pažinti ląstelių biologinę sandarą, audinių morfologiją, ligų veikimo principus, vaistų veikimą, baltymų gamybą ir skatina audinių inžinerijos vystymąsi. Jos naudojamos ikiklinikiniuose farmakologiniuose, onkologiniuose ir genų inžinerijos tyrimuose. Pasirinkus

tinkamus ląstelių kultūros metodus vėžio tyrimų srityje, galima geriau suprasti navikų biologiją ir tokiu būdu patobulinti radioterapijos ir chemoterapijos gydymo veiksmingumą [21].

Pirminės ląstelių kultūros dažniausiai kultivuojamos kaip dvidimensiniai (2D) monosluoksniai stikliniuose arba plastikiniuose induose. Tačiau pastaruoju metu tridimensinės (3D) kultūros metodas populiarėja dėl to, jog tokiu būdų kultivuojamų ląstelių mikroaplinka yra artimesnė natūraliai biologinei aplinkai, o tai sąlygoja ląstelių elgseną, būdingą ląstelėms gyvame organizme. Tyrimus, lyginančius ląstelių elgsenos skirtumus vienasluoksniuose ir erdviniuose modeliose, apibendrinančios apžvalgos rodo, kad skirtingose aplinkose ląstelių fiziologija, morfologija, genų raiška ir kitos savybės skiriasi daugeliu aspektų [22].

1.3.1. 2D ląstelių kultūra

Dažniausiai tyrimai atliekami su dvimate (2D) ląstelių kultūra dėl tokių metodų kainos, paprastumo ir patogumo. Ląstelės auginamos plastikiniuose audinių kultūros induose suteikiant joms pakankamai maistinių medžiagų ir deguonies. Tokio tipo ląstelių kultūra naudojama baltymų ekspresijos, citotoksiškumo, ląstelių sukibimo, migracijos, proliferacijos ir kituose tyrimuose.

Dvidimensiniai (2D) ląstelių esminiai privalumai yra jų auginimo paprastumas ir gerai standartizuoti kultivavimo bei vertinimo protokolai. Ląstelės monosluoksniuose (3 pav.) gerai matomos šviesiniu mikroskopu, nes pro jas, priešingai nei pro audinius ar storesnius ląstelių daugiasluoksnius, lengvai prasiskverbia šviesa. Taip pat šiose kultūrose nėra autofluorescencijos dėl kitų neląstelinių struktūrų, kurios būna audinių mėginiuose. Didelės skiriamosios gebos gyvų ląstelių vaizdinimas yra būtinas norint analizuoti dinaminius procesus, svarbius vėžio progresavimui, tokius kaip ląstelių migracija ir invazija [23].

Monokultūrinių melanomos modelių pranašumas yra jų grynumas, leidžiantis nustatyti konkrečioms ląstelėms būdingus molekulinius pokyčius. Tačiau kitos mikroaplinkos ląstelės taip pat gali įtakoti baltymų sintezę ar genų raišką. Norint sumodeliuoti panašią aplinką in vitro sąlygomis, tenka pasitelkti 3D mišrių kultūrų modelius. Yra duomenų, kad monokultūrose auginamos melanomos ląstelių proliferacija, morfologija, RNR ekspresija ir baltymų sintezė mažiau atitinka in vivo modelį, negu kultūroje kartu su su keratinocitais ir fibrobastais [24].

Taigi, 2D ląstelių kultūros turi trūkumų. Pirmiausia, šios kultūros neimituoja natūralių audinių ar naviko struktūros. Taikant šį auginimo metodą, tarpląstelinė sąveika bei sąveika su aplinka nėra tokios, kaip tikrame auglyje. Nesant tokios tarpusavio sąveikoms negalima įvertinti ląstelių diferenciacijos, dauginimosi, gyvybingumo, reakcijos į aplinkos veiksnius, vaistų metabolizmo ir kitų ląstelinių funkcijų [25].

Tyrimais parodyta, kad po išskyrimo iš audinio ir perkėlimo į 2D sąlygas keičiasi ląstelių morfologija, o taip pat ir ląstelių dalijimosi būdas. Pasikeitusi ląstelių morfologija gali paveikti jų funkciją. Jos praranda poliškumą, o tai keičia reakciją į aplinkos veiksnius.

Kitas 2D kultūros neatitikimas in vivo sąlygoms yra tai, kad monosluoksnio ląstelės turi neribotą prieigą prie terpės ingredientų, tokių kaip deguonis, maistinės medžiagos, metabolitai ir signalinės molekulės. Vėžinėse ląstelėse in vivo maistingųjų medžiagų, deguonies ir kt. prieinamumas yra žymiai labiau apribotas dėl natūralios naviko struktūros [26].

1.3.2. 3D ląstelių kultūra

1970 m. Hamburgas ir Salmonas atliko pirmuosius bandymus su tridimensinėmis (3D) kultūromis ant ląstelėms nekibaus agaro sluoksnio. Nuo to laiko pradėtas plačiai taikyti šis erdvinis ląstelių kultūrų auginimo metodas siekiant išsiaiškinti 3D sąlygomis auginamų ląstelių morfologiją ir elgseną [27].

Sferoidas – tai ląstelių mikrotinklas, susidarantis savaime sukimbant ląstelėms terpėje (4 pav.) veikiant gravitacijai. 3D sferoidinė struktūra daugeliu atžvilgiu atitinka naviko audinio ypatybes, įskaitant ląstelių tarpusavio sąveiką, maistinių medžiagų ir deguonies prieinamumą [28].

Šiuo metu literatūroje jau yra aprašyti įvairūs 3D sferoido sąlygomis kultivuojamų navikinių ląstelių, tokių kaip glioblastomos, astrocitomos, Wilmso naviko, neuroblastomos, galvos ir kaklo plokščiųjų ląstelių karcinomos, melanomos, plaučių, krūties, storosios žarnos, prostatos, kiaušidžių, kepenų, ląstelių ir kasos vėžio, modeliai [29].

Šiose 3D kultūrose ląstelės iš donoro audinių yra auginamos daugialąstelinėse, trimatėse struktūrose, imituojant biologinę audinio architektūrą tiksliau, nei tai įmanoma 2D modeliuose. Tai nulemia artimos natūralioms tarpląstelinės bei ląstelės–aplinkos sąveikos. 3D kultūros privalumas – jose išlaikoma artima natūraliai ląstelių morfologija ir poliškumas [30].

3D ląstelių kultūra turi ir trūkumų. Šių kultūrų auginimas yra žymiai sudėtingesnis, jas sunkiau standartizuoti ir analizuoti, sunkiau atlikti atskirų sluoksnių skaidymą, norint atskirti ląsteles nuo sferinės struktūros. Daugelio 3D metodų efektyvumas vertinant pagal tokius parametrus, kaip ląstelių gyvenimo trukmė, pakartojamumas, imlumas darbui bei analitinis patogumas, yra mažesnis, nei 2D sistemų atveju [31].

1.3.3. Mišrios kultūros sistema

Navikas – tai audinio masė, kuri susideda iš kelių tipų ląstelių. Mišriose kultūrose skirtingos ląstelių rūšys auginamos toje pačioje aplinkoje. Aštuntajame dešimtmetyje toks kultūros tipas buvo apibūdintas kaip sistema, kuria tyrinėjamas ryšys tarp ląstelių.

Mišriai kultūrai būdingos trys tarpląstelines sąveikos: ląstelės–ląstelės, ląstelės–mikroaplinkos ir parakrininiai signaliai su ištirpusiais veiksniais. Mišrios kultūros leidžia stebėti sąveiką funkcinėse struktūrose, panašiose į in vivo. Šiose kultūrose galima išskirti tikslines ląsteles, kurios yra pagrindinis stebėjimo objektas, ir pagalbines ląsteles, palaikančias jų augimą ir vystymąsi [32, 33].

Mišrias kultūras galima suskirstyti į dvi rūšis: tiesioginę ir netiesioginę. Pirmajame modelyje skirtingų rūšių ląstelės sumaišomos ir auginamos kartu. Antrame ląstelės vienos nuo kitų yra atskirtos fiziniu barjeru. Abiejų tipų kultūrą galima auginti tiek 2D sistemose, tiek 3D modeliuose. Tiesioginėse kultūrose galime pastebėti visus aukščiau aprašytus sąveikos tipus [34, 35].

Priešingai nei tiesioginėje sistemoje, netiesioginiame modelyje ląstelės tiesiogiai nesąveikauja, nes yra fizinis barjeras. Mišriųjų kultūrų neigiama pusė yra ta, kad reikia pritaikyti sąlygas visoms naudojamoms ląstelėms, išrinkti tinkamiausią mitybinę terpę su reikiamais komponentais, nustatyti auginimo trukmę ir parinkti kitus bendram auginimui tinkamus parametrus. Optimalios sąlygos yra tos, kurios suteikia galimybę vienodai augti visoms ląstelėms [36].

1.4. Organotipinis modelis

Dažniausia alternatyva organotipiniams modeliams pasirenkami gyvūnai chirurginiu būdu įmplantuojant navikines ląsteles ir stebint jų augimą ir metastazavimą organizme. Visgi šie bandymai ne visada atspindi vėžinio susirgimo vystymąsi bei terapinį atsaką žmogaus organizme. Be to, šiuolainėse laboratorijose atliekami bandymai su gyvūnais yra etinė problema, nes eksperimentai gali sukelti skausmą naudojamiems gyvūnams arba sumažinti jų gyvenimo trukmę. Dėl šių priežasčių, organotipinių in vitro modelių vystymas yra reikalingas ir perspektyvus [37].

Nors anksčiau aprašyti monosluoksniai 2D ląstelių kultūrų modeliai yra naudingi tiriant naviko ląstelių biologijos principus, bet jie negali parodyti jo invazyvumo biologinėje aplinkoje. 3D ląstelių kultūra gali sukurti nuolatinę dinaminę sąveiką su užląsteliniu užpildu ir kitomis ląstelėmis, pavyzdžiui, fibroblastais, keratinocitais ar endotelio ląstelėmis. Mokslinėje literatūroje tai vadinama „naviko organu“ [38].

In vitro organotipinis modelis formuojamas tam tikra tvarka. Pirmiausia suformuojamas naviko

sferoidas. Kadangi ląstelės turi natūralų polinkis kauptis, sudaryti tarpusavio ryšius ir suformuoti speficinę aplinką, tai panaudojama savaiminiam tridimensinio modelio formavimui. Naudojami keli sferoidų kultivavimo (5 pav.) būdai – bioreaktoriuose (1), V (2) arba U (3) formos šulinėliai bei ,,kabančio lašo“ metodas (4). Pagal auginamų ląstelių tipą parenkama tinkama sferoidui mikroaplinka. Melanomos sferoidams tokia aplinka yra odos jungiamojo audinio sluoksnis.

Jungiamojo audinio ląstelėms fibroblastams kultivuoti 3D sąlygomis dažniausiai naudojama I tipo kolageno matrica. Formuojant organotipinį melanomos modelį, melanomos sferoidai turi būti įterpiami į I tipo kolageno suspensiją kartu su fibroblastais. Trečiasis organotipinio modelio kūrimo etapas – odos epidermio sluoksnio suformavimas iš odos keratinocitų ant fibroblastų su melanomos sferoidais sluoksnio.

Organotipiniam odos modeliui formuoti dažniausiai naudojami audinių kultūros įdėklai su polikarbonatine membrana pasirenkant tinkamą porų dydį. Užsėjus odos fibroblastus, visas įdėklo turinys užpildomas mitybine terpe kol ląstelės suauga nepalikdamos tarpų. Tada sėjami keratinocitai ir dalis terpės nusiurbiama taip, kad auginamas duagiasluoksnis atsidurtų ties oro–skysčio sąlyčio riba, kad auginimo sąlygos atitiktų natūralias odai būdingas aplinkos sąlygas. Tokiame odos modelyje suformuoti vėžio sferoidai leidžia nustatyti morfologinius pakitimus, ląstelių migraciją, diferenciaciją, gyvybingumą ir kitus svarbius parametrus sąlygomis, kurios atitinka auginimą audinyje [39, 40].

1.5. Hidrogelis

Mokslinėje literatūroje dažnai minima in vitro odos modeliui naudojama sistema – hidrogelis. Jie naudojami kaip fibroblastų kultivavimo aplinka, ant kurios paviršiaus vėliau kultivuojami keratinocitai. I tipo kolageno medžiaga naudojama, kaip užląstelinis užpildas. Fibroblastų ląstelės pasiskirsto kolageno gelyje taip įmituodamos dermos sluoksnį [41]. Pirmąjį tokio tipo tyrimą aprašė tyrėjas Bell su kolegomis. Jie panaudojo hidrogelio sistemą su epidermio ląstelėmis ant pirminių žiurkės fibroblastų turinčio kolageno pagrindo [42].

Po daugelio atliktų tyrimų su odos modeliais, kurių pagrindą sudaro hidrogelis, jie tapo komerciškai prieinami tokių įmonių, kaip „EpiDerm“ („MatTek“, Ashland, MA, JAV), „Episkin“ („L'Oreal“; „SkinEthic“, Nica, Prancūzija), „Apligraf“ („Organogenesis Inc.“), Canton, MA, JAV) ir ,,Labskin“ (Innovenn, Dublinas, Airija).

Odos ląstelių tyrimams gali būti naudojamos ir beląstelinės hidrogelinės sistemos. Hidrogeliai apibūdinami, kaip kelių komponentų sistema, susidedanti iš polimerines grandinės ir vandens, kuris yra kaip užpildas erdvėje tarp makromolekulių. Hidrogeliai sudaryti iš polimerinių medžiagų grupių, kurios turi hidrofilinę struktūrą ir gali išlaikyti vandens kiekį 3D ląstelių tinkluose. Taip pat jie yra lankstūs ir primena natūralų audinį.

Hidrogeliai – tai yra polimerinė medžiaga, pasižyminti savybe išlaikyti didelį vandens kiekį savyje, tačiau vandenyje neištirpsta. Hidrogeliai klasifikuojami pagal juos sudarančias medžiagas, paruošimo būdą, jonų krūvį, cheminį susiuvimą ir fizikines savybes [43-45].

Hidrogeliai naudojami įvairiose srityse, tokiose kaip žemės ūkis, maisto pramonė, biomedicina ir kt. Nors jų panaudojimo spektras platus, biomedicinos taikymo srityje atliekama daugiausiai tyrimų.

Daugumos hidrogelių sistemos yra patogios molekulinei analizei, o jų skaidrumas leidžia atlikti šviesinės, fluorescencinės bei konfokalinės mikroskopijos analizę. Savo struktūra jie primena gyvuosius audinius, turinčius tokias savybes, kaip biologinį suderinamumą ir biologinį skaidomumą. [46].

Hidrogeliai gali būti sudaryti iš natūralių ir sintetinių medžiagų. Natūralūs polimerai sudarantys hidrogelį, yra baltymai, pavyzdžiui kolagenas, želatina, fibrinas, lamininas, ir polisacharidai – krakmolas, alginatas ir agarozė.

Sintetiniai polimerai iš kurių formuojami hidrogeliai, gaminami naudojant cheminės polimerizacijos metodus. Suformuoti geliai pasižymi stabilumu, atsparumu temperatūros svyravimui, vandens absorbcinėmis savybėmis ir ilgu tarnavimo laiku. Jie turi aiškiai apibrėžtą struktūrą, kurią galima lengvai modifikuoti [47].

Hidrogeliai taip pat klasifikuojami pagal sandarą: homopolimeriniai, kopolimeriniai ir daugiapolimeriniai hidrogeliai. Homopolimerai gaunami iš vienos rūšies monomero, kuris yra pagrindinis struktūrinis vienetas, susidedantis iš bet kurio polimero tinklo. Kopolimerus sudaro dvi ar daugiau skirtingų monomerų rūšių, turinčių bent vieną hidrofilinį komponentą, išdėstytą atsitiktine, blokine ar kintama konfigūracija išilgai polimero tinklo grandinės [48, 49]. Daugiapolimeriniai hidrogeliai yra pagaminti iš dviejų nepriklausomų kryžmiškai sujungtų sintetinių ir (arba) natūralių polimerų komponentų, išsidėsčiusių tinklo pavidalu [50, 51].

Hidrogelių sudėtyje yra svarbūs ne tik fizikiniai parametrai, bet ir jų struktūra. Pagal tai hidrogeliai kirstomi į amorfinius, pusiau kristalinius ir kristalinius. Tokios sudėties hidrogelius sujungti galima dviem būdais atsižvelgiant į jungčių prigimtį. Galimi chemiškai susieti tinklai, turintys ilgalaikes jungtis, o fizikines – trumpalaikes jungtis, kurios atsiranda dėl fizikinių sąveikų tokių, kaip vandeniliniai ryšiai, joninės jėgos ar hidrofobinės sąveikos [52].

1.5.1. Užląstelinio užpildo baltymai

Siekiant sukurti audiniui artimą hidrogelinę matricą, jos sudėtis papildoma audiniui būdingais užląstelinio užpildo baltymais. Svarbiausi ir geriausia ištirti užląstelinio užpildo baltymai yra kolagenas, fibronektinas ir lamininas. Tai didelės molekulinės masės baltymai. Šios molekulės yra labai svarbios ląstelių sukibimui, migracijai ir diferenciacijai. [53].

I tipo kolagenas (I kolagenas) labiausiai paplitęs baltymas žmogaus kūne. Jis sudaro 30% baltymų. Kolagenai priskiriamas baltymų šeimai, kurios didžioji dalis makromolekulių, sudaro užląstelinį užpildą (angl. extracellular matrix arba ECM). Užląstelinio užpildo molekules sintetina ir egzocitozės būdu išskiria audinių ląstelės. Tokios molekulės sąveikauja sudarydamos tinklą, kuris veikia kaip atrama arba karkasas jį supančioms ląstelėms. Šiuo metu yra žinomi 28 kolageno baltymų tipai, kuriuos pagal struktūrą galima suskirstyti į 8 šeimas ir jie visi žymimi romėniškais skaitmenimis atitinkamai nuo I iki XXVIII [54].

Visų kolageno baltymų struktūra yra pagrįsta trimis spiralinių polipeptidų grandinėmis, kur glicinas (Gly) atsiranda kas tris aminorūgščių liekanas, o prolinas (Pro) ir hidroksiprolinas (Hyp) sudaro apie 1 / 6 visos kolageno sekos. Seka „Gly-Pro-X“ arba „Gly-X-Hyp“. Paveikslėlyje (6 pav.) vaizduojama alfa grandinės dalis, kuriose aminorūgštys pavaizduotos sferomis, kur X – prolinas (A) , arba bet kuri kita aminorūgščių liekana, o Y hidroksiprolino (B) amino rūgštys [54]. Glicinas – vienintelė iš amino

rūgščių savo šoninėje grupėje turinti tik vandenilio atomą ir atliekanti tarpinės funkciją α-grandinėje. Trys α-grandinės kompaktiškai susisuka į ilgą, standžią dešinio sukimosi trigubą spiralę, kurios skersmuo yra 1–2 nm, o ilgis siekia 300 nm [55].

Kolagenas ląstelėse gaminamas sujungiant tris grandines, tokias kaip dvi α1 ir viena α2 grandinės į prokolageno trigubą spiralę, kuri baigiasi trumpais nespiraliniais telopeptidais, po kurių eina rutiliniai propeptidai tiek N, tiek C galuose. N- ir C-galiniai rutuliniai propeptidai greitai fermentiškai suskaidomi, o susidariusios tropokolageninės spiralės kaupiasi į fibriles. Tipiškos kolageno trigubos spiralės struktūros skersmuo gali būti nuo 10 iki 500nm, apytikslė molekulinė masė − 285 kDa, ir ją sudaro 1400 aminorūgščių [61].

Kolageno I fibrilės sujungiamos su kitomis makromolekulėmis, kad susidarytų kolageno skaidulos, tokios kaip III, V, XII, XIV kolagenai, proteoglikanai. Taigi, nors kolageno skaidulos dažnai vadinamos „I tipo kolageno skaidulomis“, jos iš tikrųjų yra pagamintos iš daugiau baltymų nei tik I kolageno. Kolageno skaidulos yra atsakingos už kaulų, dantų, sausgyslių, raiščių ir odos funkcinį vientisumą. Sausgyslėse ir raiščiuose yra gana daug I kolageno, odoje yra palyginti daugiau ne kolagenozinių baltymų, tokių kaip elastinas ir lipidai, nei sausgyslėse, o žmogaus plaučiuose yra beveik tiek pat elastino kaip kolageno [62].

Lamininai yra pagrindiniai membranų pamatiniai komponentai, kuriuos sudaro didelių heterotrimerinių glikoproteinų grupę. Lamininas-1, susideda iš trijų grandinių, žymimų α1, β1 ir γ1, pasižymi įvairiausiu biologiniu aktyvumu, įskaitant ląstelių adhezijos, migracijos, neurito išaugimo, naviko metastazių ir angiogenezės skatinimą. Iki šiol buvo identifikuotos penkios α, trys β ir trys γ grandinės. Žinoma mažiausiai 15 izoformų, kurios yra suformuotos įvairiais kiekvieno subvieneto deriniais [63].

Laminino baltymas sudaro kryžiaus formos struktūrą, prie kurio ilgosios dalies gali jungtis kitų ląstelių membranos ir neląstelinio užpildo molekulės. Prie trumpesniųjų laminino molekulės galų jungiasi kitos laminino molekulės, sudarydamos pluoštus [64].

Fibronektinas yra didelės molekulinės masės glikoproteinas, kuris daugiausiai paplitęs užląstelinėje matricoje, kurioje jungiasi su kolageno skaidulomis. Fibroektinas yra neaktyvus, tačiau prisijungus prie integrinų suformuoja dimerus ir tampa aktyvia forma. Padeda ląstelėms judėti matricos

paviršiuje. Fibronektinų yra ir kraujo plazmoje. Pažeidus audinį, kraujo krešėjimo metu jie prisijungia prie trombocitų ir palengvina ląstelių judėjimą prie žaizdos [65, 66].

1.5.2. Užląstelinio užpildo baltymus imituojantys peptidai

Nors užląstelinio užpildo baltymai užtikrina cheminį aplinkos panašumą į natūralų audinį, jų išsidėstymą, tarpusavio ryšius bei konformaciją hidrogelyje sunku kontroliuoti. Be to, jų gamyba yra sudėtinga, todėl jie yra brangūs. Daugima šių baltymų yra tik biologinės kilmės, todėl jų savybės tarp skirtingų partijų šiek tiek skiriasi, be to, jie gali turėti biotechnologinės gamybos sąlygotų bakterinės kilmės priemaišų. Siekiant sukurti lengviau valdomus ir standartizuoatai gaminamus hidrogelius, yra pasitelkiami trumpi sintetiniai užląstelinio užpildo signalus imituojantys peptidai [45].

Pagrindinis sintetinių hidrogelio modelių pranašumas yra jų apibrėžtos ir kontroliuojamos biomimetinės funkcijos. Pavyzdžiui, ląstelių sukibimų (adhezijos) vietos gali būti keičiamos naudojant peptidus, tokius kaip kolageną imituojantis peptidas (angl. collagen like peptide arba CLP) RGD ar IKVAV [77].

CLP yra kolageno trigubos spiralės struktūrą imituojantis peptidas, kurio seka yra (Cys-Gly-(Pro-LysGly)4(Pro-Hyp-Gly)4(Asp-Hyp-Gly)4. Šie peptidai buvo chemiškai susiūti su polimerais sudarant homogeninį kolageną imituojantį sluoksnį. Šio hidrogelio savybės labai panašios į natūralaus kolageno. Pridedant papildomų amino rūgščių gerinamos hidrogelio savybės [54].

RGD (Arg-Gly-Asp) seka yra dažnai naudojama hidrogelių gamyboje, dėl savo ląstelių sukibimą gerinančių savybių. Hidrogeliai modifikuojami (RGD) Arg-Gly-Asp peptidų sekomis, siekiant suvaldyti ląstelių prikibimą, migraciją ir augimą. RGD seka yra pati efektyviausia ir dažniausiai naudojama peptido seka, sukelianti ląstelių adheziją ant sintetinių paviršių. Ji plačiai paplitusi visame organizme, tame tarpe ir odoje [55].

1.5.3. Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Ląstelių kultūros dažniausiai naudojamos genetiniams ir biologiniams vėžio tyrimams. Skirtingai imituodamos in vivo sąlygas, gali būti naudojama, kaip alternatyva gyvūnų modeliams. Dažniausiai tyrimuose taikoma dvidimensinė (2D) ląstelių kultūra, tačiau ji laikoma neveiksminga lyginant procesus susijusius su ląstelės reakcija jos biologinėje aplinkoje [25]. Dėl šios priežasties pradėta atlikti daugiau bandymų su tridimensine (3D) ląstelių kultūrą siekiant ištirti ląstelės−ląstelės ir ląstelės−mikroaplinkos sąveikas [30].

In vitro organotipinių vėžio modelių kūrimo tikslas yra suformuoti tinkamas ikiklinikinių tyrimų

sistemas, kurios pakartotinai atspindėtų žmogaus melanomos 3D struktūrą ir sudėtingumą in vivo. Tai leidžia lygiagrečiai ištirti terapinį poveikį navikui organotipinėje aplinkoje ir neigiamą poveikį aplinkiniams pirminiams audiniams [65]. Melanomos sferoidas taip gali būti įterpiamas į skirtingas matricas, kad būtų galima įvertinti melanomos augimą ir invazyvumą. Šiam tikslui buvo pasirinkti du skirtingi modeliai – ląstelinis odos modelis ir sintetinis odos užląstelinį užpildą imituojantis hidrogelis.

3D melanomos sferoido įterpimas į kolageno gelio matricą su fibroblastais labiau atspindi naviko struktūrą in vivo, nei monosluoksnėje kultūroje. Šis modelis imituoja naviko heterogeniškumą, matomą in vivo, nes jis atkuria deguonies ir maistinių medžiagų gradientą, leidžiančia sąveikauti tarp melanomos ląstelių ir aplinkos. Galima teigti, jog 3D sferoido modelis tiksliai atspindi melanomos

elgseną in vivo, kai skirtingos kilmės ląstelių linijos pasižymi skirtingomis augimo ir invazijos savybėmis, atspindinčiomis pradinę būseną [39, 40].

Šiame darbe siekiama palyginti, kuri užląstelinė matrica, imituojanti natūralią ląstelių aplinką, turėtų tiksliai kontroliuojama signalinių elementų sudėtį ir turėtų standartizuotą bei lengvai stebimą ir analizuojamą ląstelių kultūrą. Dažniausiai naudojami užląstelinio užpildo baltymai (ECM) yra kolagenas, fibronektinas ir lamininas [55], kurie sukuria ląstelių integrino receptorių surišimo vietas, kad jose susidarytų fokaliniai sukibimai. Dėl sukibimų ląstelės gali judėti matricoje bei gauti mechaninius dirgiklius iš aplinkos [69]. Ląstelių migracija tiesiogiai priklauso nuo ląstelių sukibimų skaičiaus [72]. Integrinai veikia kaip ECM taikinių receptoriai perduodantis signalus iš išorės ir iš vidaus, kurie apima daugiau nei 50 baltymų rūšių [70]. Sąveikos tarp ląstelių ir užląstelinio užpildo (ECM) baltymų kontroliuoja diferenciaciją, formą, judėjimą, ląstelių fenotipą ir gyvybingumą [73]. Užląstelinio užpildo ECM metodai pradėti taikyti atradus vadinamuosius ląstelių adhezijos peptidus, arba trumpas aminorūgščių sekas, turinčias reikiama specifinį prisijungimą prie ląstelės receptorių, atsakingų už ląstelės adheziją [74]. Kolagenas – sudarytas iš tryjų polipeptidinių grandinių ir sudarantis trečdalį visos žmogaus baltymų masės [71]. Tyrėjui O’Leary pavyko suprojektuoti sintetinį kolageną su savaime susidedančia triguba spiraline struktūra ir sukurti homogeninį kolageną imituojantį nanopluoštą [77]. Prieš šios sekos prijungti du jos analogai RGD ir IKVAV.

RGD seka skatina ląstelių prisirišimą, panašiai kaip fibronektinas . Tai įrodyta panaudojus RGD peptidą hidrogelio matricos projektavimui [75]. IKVAV peptido motyvas aprašomas, kaip seka, kuri atsakinga už neuritogeninį biologinį aktyvumą laminino alfa grandinėje. IKVAV hidrogeliai išbandyti neuroninių audinių inžinerijoje [76].

Hidrogeliai yra viena patraukliausių audinių inžinerijos medžiagų dėl savo panašumo į ląstelių mikroaplinką in vivo [78]. Sintetiniai hidrogeliai, turintys tokius ECM signalą imituojančius peptidus, yra laikomi nauja perspektyvia naviko modelio kūrimo priemone dėl savo aiškiai apibrėžtos sudėties, struktūrinio vientisumo, konstrukcijos tvirtumo, kontroliuojamo krūvio, standumo, poringumo, nanostruktūros, skaidomumo ir sukibimo savybių [79].

Šiame tyrime siekiama pritaikyti užląstelinio užpildo (ECM) hidrogelius, pagamintus iš kovalentiškai susiūtų kolageną imituojančių peptidų prijungtų prie polietilenglikolio (PEG), kaip vėžio in vitro modeliavimo matrica. Atliekami migracijos, proliferacijos ir fokalinių sukibimų ląstelėje susidarymas mėginiuose.

2. Medžiagos ir tyrimų metodai

2.1. Reagentai, priemonės ir aparatūra

In vitro odos ir melanomos modelio kūrimui ir vertinimui buvo naudotas II klasės biologinio saugumo

laminarinės traukos spinta (NuAire NU-480-400E, JAV), inkubatorius (New Brunswick™ Galaxy® 170 S CO2 JAV),centrifuga (BioSan Centrifuge LMC-4200R, Latvija), šviesaus lauko mikroskopas Leica DMi1 (Leica Microsystems GmbH, Vokietija) ir hemocitometras (Fuchs-Rosenthal, Vokietija). Atliekant tyrimus ant sintetinių hidrogelių matuojama proliferacija, migracija ir vertinti sukibimai ląstelėje, naudotas daugiafunkcinis plokštelių skaitytuvas Infinite 200 Pro M Nano Plex (Tecan Group Ltd.) 96 šulinėlių juodos ir skaidrios plokštelės (ThermoFisher Scientific, JAV). Sukibimai ląstelėje vertinti konfokaliniu mikroskopu Zeiss Axio Observer.Z1 (Karl Zeiss AG, Jena, Vokietija).

Formuojant tridimensinį odos modelį panaudota 6 šulinėlių plokštelė (Multiwell TM 6 Well Becton Dickinson Labware, JAV) ir Millicell kultūrų auginimo įdėklai 0,4 µm Ø 30 mm (Merck Milipore, Vokietija).

Transepitelinė elektrinė varža matuojamama su voltommetru (Millicell ERS-2 Volt-Ohm Meter, JAV) ir histologinė analizė atliekama parafino sistema su konfokaliniu mikroskopu Olympus Fluoview FV1000 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).

Imunohistochemine ląstelinio odos modelio analize atliekama automatinio parafino įliejimo į audinį prietaisu (Microm STP 120, ThermoFisher Scientific, JAV). Audinių įterpimas į parafino voneles ( Microm EC 350, ThermoFisher Scientific, JAV) ir automatinis mikrotomas (Microm HM 350 S ThermoFisher Scientific, JAV), kuris aštriais peiliukais supjausto audinį sluoksniais.

Hidrogeliai CLP (PEG-CLP), RGD (PEG-CLP-RGD) ir IKVAV (PEG-CLP-IKVAV) buvo įsigyti iš UAB „Ferentis“ , Lietuva.

Antikūnai citokeratinas 10 (Cytokeratin 10 Monoclonal Antibody DE-K10) ir citokeratinas 14 (Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody LL002) (Invitrogen, JAV).

Priemonės: – Dengiamasis stiklelis; – Eppendorf mėgintuvėliai; – Petri lėkštelės. Reagentai: – Agarozė (Sigma-Aldrich);

– Fetalinis veršelio serumas (angl. FBS) (Sigma-Aldrich);

– Fosfatinis druskos buferis (angl. PBS) pH 7,4 (Sigma-Aldrich);

– I tipo kolagenas (iš žiurkės uodegos, 3,5-4 mg / ml, 0,02 N acto rūgštyje) (ThermoFisher Scientific);

– Ląstelių auginimo terpė (DMEM) (Sigma-Aldrich); – Ląstelių auginimo terpė (RPMI 1640) (Sigma-Aldrich); – Paraformaldehidas 4 % (Sigma-Aldrich);

– Penicilino ir streptomicino antibiotikų sudėtinis tirpalas (Pen-Strep) (10000 vienetų / ml penicilino ir 10 mg / ml streptomicino) (Sigma-Aldrich) ;

– PrestoBlue reagentas (ThermoFisher Scientific);

– Tripsino / EDTA 10x tirpalas (0,5 % tripsinas ir 0,2 % EDTA) (Sigma-Aldrich); – Tripano mėlio dažų tirpalas (0,4 %) (Sigma-Aldrich);

– Etanolis (UAB „Stumbras“);

– Millipore aktino citoskeleto ir adhezijos dažymo rinkinys (katalogo numeris FAK100); – Hematoksilinas (Sigma-Aldrich);

– Eozinas (Sigma-Aldrich); – Ksilenas (Sigma-Aldrich). Ląstelių linija:

– Vėžinių ląstelių linija – žmogaus odos melanomos ląstelių linija A375 (RRID: CVCL_0132) ląstelių linijos buvo įsigytos iš „Cell Lines Service GmbH“ (Vokietija); – Žmogaus pirminiai imortalizuoti odos keratinocitai (KER-CT, hTERT, ATCC); – Žmogaus pirminiai imortalizuoti odos fibroblastai (BJ-5ta, hTERT, ATCC). 2.2. Melanomos auginimas

2.2.1. Melanomos 2D ląstelių kultivavimas

Ląstelių atšildymas. Procesas atliekamas ištraukus mėgintuvėlį iš skysto azoto talpos ir kuo greičiau patalpinus į šiltą mitybinę terpę, nes jame esantis DMSO gali toksiškai paveikti ląsteles. Paruošiama mitybine terpe, kuri sudaryta iš RPMI 1640 10 %, FBS 5 % ir 1 % antibiotikų tirpalo. Ištraukus iš azoto talpos, krio-mėgintuvėlis patalpinamas į šiltą vandens vonelę. Atitirpus mėginiui jis supilamas į centrifūginį mėgintuvėlį kartu su mitybine terpe. Suspensija centrifuguojama 3 min x 300 g. Supernatantas nupilamas, ląstelių sankaupa suspenduojama su 1ml auginimo terpe. Visą suspensija patalpinama į 75 cm2 _{arba 25cm}2 _{ląstelių auginimo inda. Užpilama auginimo terpės ir paliekama} inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje, 5 % CO2 atmosferoje. Po 24 valandų pakeičiama nauja mitybine terpe. A375 ląstelių padvigubėjimo laikas yra 18 valandų. Visi eksperimentai atliekami laminarinėje traukos spintoje.

Ląstelių persėjimas. Ląstelės auginamos kol pasiekiamas 70-80 % ląstelių suaugimas ant indo dugno. Visa ląstelių persėjimo eiga pavaizduota 8 paveikslėlyje. Pirmiausia išpilama auginimo terpė ir praplaunama su PBS du kartus, tam kad pašalinti auginimo terpės likučius. Į 75 cm2 indelį įpilama 4 ml tripsino. Indelis patalpinamas 5 minutėms į inkubatorių, ištraukus švelniai papurtoma, kad ląstelės atkibtų nuo dugno. Šviesinio mikroskopo pagalba patikrinama ar ląstelės plaukioja terpėje. Tripsiną užpiltą ant ląstelių reikia stengtis kuo greičiau neutralizuoti terpe, nes atkibusios ir tripsine plaukiančios ląstelės miršta. Užpilama 6 ml auginimo terpės ir serologine pipete įsiurbiamas ir vėl išleidžiamas ląstelių suspensija. Iš serologinės pipetės išleidžiamas stipria srove taip, kad atkibtų dar prikibusios ląsteles. Suspensija perkeliama į 15 ml centrifuginį mėgintuvėlį (1).

Centrifuguojama 3 min x 300 g (2). Po centrifugavimo išpilamas supernatantas (3), o ląstelių sankaupa suspenduojama su 1 ml ląstelių auginimo terpės (4), priklausomai nuo sankaupos. Esant didelei ląstelių sankaupai galima atlikti didesnį skiedimą.

Ląstelių skaičiavimas. Iš ląstelių suspensijos 20 µl ląstelių patalpinama į Eppendorf mėgintuvėlį. Šis mėgintuvėlis išnešamas iš sterilios laminarinės traukos spintos ir toliau ląstelių skaičiavimas vyksta nesteriliai. Ant hemocitometro (9 pav.) uždedamas dengiamasis stiklelis, taip kad jis prikibtų. Ląstelių suspensija 1:1 santykiu skiedžiama su tripano mėliu. Tirpalas suspenduojamas ir 20 µl patalpinama į hemocitometro kamerą – tarpą susidariusį tarp hemocitometro ir dengiamojo stiklelio. Stebint per šviesinį mikroskopą Leica DMil, skaičiuojamos hemocitometro kameroje matomos ląstelės: geltonai / baltai švytinčios – gyvos, o tamsiai mėlynos – negyvos (10 pav.).

8 pav. Ląstelių persėjimo eigos schema

9 pav. Hemocitometro kamera

Ląstelės skaičiuojamos įstrižai (11 pav.) per keturis mažus kvadratėlius. Jų skaičius padauginimas iš 4, nes iš viso yra 16 kvadratėlių. Tuomet dauginama iš 2, nes ląstelių suspensija skiesta du kartus su tripano mėliu. Tada dauginama iš 5000, nes Fuchs-Rosenthal hemocitometro didelio kvadratėlio paviršiaus plotas 1 mm2 _{ir kiekviename dideliame kvadratėlyje telpa 0,0002 ml. Taigi tūrio} koeficientas yra 1 / 0,0002 ml = 5000. Gautas skaičius yra ląstelių kiekis viename mililitre.

2.2.2. Melanomos 3D ląstelių sferoidų formavimas

Norint suformuoti panašaus dydžio sferoidus naudojamas “Kabančio lašo” metodas (12 pav.). Suformuojama 40 lašų po 25 µl (500 ląstelių) suspensijos (1) ant Petri lėkštelės dangtelio vidinės dalies. Dėl paviršiaus įtempimo greitu, bet švelniu mostu apvertus dangtelį ir uždarius (2) Petri lėkštelę lašai lieka kabėti. Į apatinę Petri lėkštelės dalį įpilama 10 ml PBS, kad terpe per daug nenugaruotų. Petri lėkštele laikoma ląstelių inkubatoriuje, esant 37 ° C temperatūrai ir 5 % CO2 atmosferoje. Po 4 dienų į kiekvieną lašą įlašinama 10 μl šviežios RPMI / 10 % FBS terpės. Vėliau kas antrą dieną papildoma po 10 μl terpės. Sferoidai susiformuoja per 10 dienų (3), tuomet perkeliami ant 2 % agarozės PBS tolimesniam augimui. Sferoidas susiformuoja maždaug 473 ± 96 µm skersmens. Po kelių dienų jis yra paruoštas tyrimams.

11 pav. Schema parodanti, kaip skaičiuojamos ląstelės

2.3. In vitro odos modelio formavimas

2.3.1. Pirminių žmogaus odos ląstelių kultivavimas

Kultivuojami du pagrindiniai žmogaus odos ląstelių (13 pav.) tipai: viršutinio odos sluoksnio ląstelės keratinocitai bei gilaus jungiamojo audinio ląstelės fibroblastai. Žmogaus fibroblastai ir keratinocitai auginami T75 ląstelių kultūrų induose su 20 ml terpės 37 ° C laipsnių temperatūroje, patalpinti inkubatoriuje 5 % CO2 oro atmosferoje. Ląstelių augimo terpę sudaro 10 % FBS, 1 % penicilino−streptomicino tirpalas ir 89 % DMEM augimo terpė. Prieš naudojimą terpė turi būti pašildoma 37 ° C temperatūros vandens vonelėje. Auginamos ląstelių kultūros induose iki 70-80 % susiliejimo.

Naudojant Tripsino / EDTA 10x tirpalą ląsteles atskiriamos nuo paviršiaus. Įpilama po 4 ml į T75 augimo indą. Paliekama 4 minutėms, jei patikrinus su šviesiniu mikroskopu matosi mažai plaukiančių ląstelių, tuomet įdedama kelioms minutėms į inkubatorių. Ląstelėms atlipus nuo dugno jos užpilamos 2,5 karto daugiau terpės ir centrifuguojamos 400 g x 4 min. Suskaičiuojamos hemocitometru nudažius tripano mėliu. Pasirinkta koncentracija keratinocitų (1 000 000 ląst / 1 ml), fibroblastų ( 800 000 ląst / 1 ml).

2.3.2. Odos dermos sluoksnio formavimas

Erdviniam modeliui suformuoti naudojami ląstelių kultūrų įdėklai 0,4 µm porų dydžio, 30 mm skersmens, su izoporinė membrana (polikarbonatas). Paruošiama 6 šulinėlių plokštelė. Viso proceso schema pavaizduota 14 paveikslėlyje. Steriliu įrankiu įdėklai atsargiai sudedami į plokštelę ir įpilama auginimo terpes po 1 ml į išorinę ir vidinę dalis (1), kad sudrėkintų membraną. Po kelių minučių terpe pašalinama. Ląstelės kultivuojamos ir paruošiamos atitinkamos jų koncentracijos. Fibroblastų suspensija, kurios koncentracija 800 000 ląst. / ml, sumaišomi su I tipo kolagenu santykiu 1:3, bendras tūris 3,5 ml. Atsargiai suspenduojama mėgintuvėlyje, kad nesusidarytų oro burbuliukai, nes jie gali

turėti neigiamą poveikį odos modeliui. Visas turinys perkeliamas į įdėklo vidinę dalį (2) nepažeidžiant jo membranos.

2.3.3. Odos dermos sluoksnis su sferoidais

Lygiagrečiai auginamas odos modelis su A375 žmogaus melanomos sferoidais. Surenkami sferoidai nuo nelipnaus agarozes paviršiaus. Praplaunama su PBS nuo terpės likučių. Atsargiai su Pastero pipete arba automatine pipete paimamas terpės tūris, kuriame būtų apie 100 sferoidų, santykiu 5:1 suspenduojama su fibroblastais ir centrifuguojama 200 g x 5min.

Po centrifugavimo sumaišoma su kolagenu I (bendras tūris 3,5 ml), santykiu 1:3 ir perkeliamas visas turinys į vidinę įdėklo dalį. Abu įdėklai paliekami inkubatoriuje 30 min be terpės padžiūti. Po inkubacijos, atsargiai įpilama po 1ml į vidinę ir išorinę dalį DMEM / 10 % FBS (3) ir paliekami inkubatoriuje 24 valandoms. Antibiotikų tirpalas nenaudojamas formuojant odos modelį, nes lėtina augimo procesą.

2.3.4. Odos epidermio sluoksnio formavimas

Sekančią dieną pašalinama terpė ir paliekama padžiūti keletą minučių. Keratinocitų suspensija, kurios koncentracija 1 000 000 ląst. / ml, suspenduojama ant odos gelio paviršiaus (tūris = 0,7 ml). Inkubuojama 1,5 valandos, kad keratinocitai priliptų prie dermos sluoksnio (4). Per šį laiką gelis pradeda trauktis dėl keratinocitų poveikio fibroblastams, ir kraštai atlimpa nuo įdėklo sienelių. Po inkubacijos, į įdėklo vidų įpilama apie į 1,5 ml šviežios terpės (5), o į tarpą tarp šulinėlio ir įdėklo 2 ml, ir paliekama inkubatoriuje 9 dienas, kas antrą dieną keičiant terpę. Praėjus šiam laikotarpiui, terpė pašalinama iš įdėklo vidinės dalies ir paliekama toliau augti oras–skystis būdu (6), kas antrą dieną pakeičiant tik išorinėje dalyje esančią terpę. Iš viso sveikos ir navikinės odos modelis auginamas 14 dienų.

Dviejų sluoksnių pasiskirstymas (15 pav.) kultūrų auginimo įdekle.Vaizdas per šviesinį mikroskopą Leica DMil fazių kontrastiniu objektyvu stebimi vaizdai buvo fotografuoti ir išanalizuoti naudojant „Image J“ atviros prieigos programą. Nuotraukos mastelis 100 µm.

2.4. Melanomos augimas ir invazyvumas sintetiniame modelyje 2.4.1. Melanomos sferoidų migracija

Suformuoti ant Petri lėkštelės A375 žmogaus melanomos sferoidai patalpinami ant CLP, PEG-CLP-RGD ir PEG-CLP-IKVAV hidrogelių naudojant 96 šulinėlių (skaidri) plokštelę ir inkubuojami 24 valandas. Migracija buvo vertinama matuojant ploto dydį, kuriame buvo paplitusios ląstelės iš sferoido. Neskaičiuojamas tik pačio sferoido užimamas plotas. Taip pat buvo vertinamas ląstelių skaičius paplitimo srityje. Sferoidų ir jo ląstelių, migravusių ant hidrogelių, mikroskopu Leica DMil fazių kontrastiniu objektyvu stebimi vaizdai buvo fotografuoti ir išanalizuoti naudojant „Image J“ atviros prieigos programą. Nuotraukų mąstelis 100 µm.

1 lentelė. Žmogaus melanomos A375 ląstelių kultūros sferoidai ant CLP, CLP-RGD ir CLP-IKVAV

hidrogelių po 24val

PEG-CLP _PEG-CLP-RGD PEG-CLP-IKVAV

2.4.2. Melanomos ląstelių proliferacija

Naudojant 96 šulinėlių (juodą) plokštelę ant kiekvieno hidrogelio buvo pasėta A375 ląstelių po 3000 ląstelių į šulinėlį. Bendras šulinėlio tūris 200 µl. Ląstelių proliferacija vertinama su PrestoBlue ląstelių gyvybingumo / proliferacijos reagentu po 24 ir 48 valandų.

PrestoBlue – resazurino pagrindu pagamintas, membranai pralaidus tirpalas, kurio redukcija tiesiogiai proporcinga ląstelių metabolizmo intensyvumui, o redukcijos produktas rezorufinas – raudonas ir labai intensyvus fluoresuojantis junginys.

Po inkubacijos iš kiekvieno šulinėlio pašalinama visa terpė. Įpilama po 10 µl PrestoBlue reagento ir pridedama po 90 µl šviežios mitybinės terpės. Palaikoma 40 minučių 37 ° C temperatūroje ląstelių kultūros inkubatoriuje, apsaugotame nuo tiesioginės šviesos. Po inkubacijos rezorufino fluorescencija nustatoma naudojant daugiafunkcinį plokštelių skaitytuvą Infinite M Plex, esant sužadinimo ir emisijos bangų ilgiui atitinkamai 560 ir 590 nm.

2 lentelė. Daugiafunkcinio plokštelių skaitytuvo parametrai

Mode Fluorescence Top Reading

Excitation Wavelength 560 nm Emission Wavelength 590 nm Excitation Bandwidth 9 nm Emission Bandwidth 20 nm Gain 100 Manual Number of Flashes 25 Integration Time 20 µs Lag Time 0 µs Settle Time 0 ms Z-Position (Manual) 20000 µm

Fluorescencijos intensyvumas išmatuojamas ant visų rūšių hidrigelių. Atskaitos tašku laikomas PEG-CLP, jis prilyginamas 100 procentų.

2.4.3. Fokalinių sukibimų nustatymas imunocitochemijos būdu

Šiame darbe buvo naudojama Millipore fokalinių sukibimų žymėjimo rinkinys (katalogo numeris FAK100). Rinkinį sudaro raudonai fluorescuojančiu rodaminu pažymėtas faloidinas, kuris junigasi prie aktino citoskeleto, kad būtų galima nustatyti vietinę aktino gijų orientaciją ląstelėje ir monokloninis antikūnas prieš vinkuliną, kuris yra labai specifiškas fokalinių sukibimų dažymui. Rinkinyje taip pat yra DAPI, skirtas branduolių fluorescenciniam žymėjimui.

Į 96 šulinėlių (skaidri) plokštelę ant dugno įdedami hidrogeliai ir įpilama po 200 µl (konc. 15 000 ląstelių / ml) suspensijos. Plokštelė inkubuojama 48 val. 37 ° C temperatūroje, 5 proc. CO2 turinčioje aplinkoje. Pasiekiamas 50-60 % ląstelių paplitimas augimo indelyje. Tuomet terpe nusiurbiama ir praplaunama 2 kartus su fosfatiniu druskų buferiu (PBS), kad neliktų terpės likučių. Ląstelių sukibimams įvertinti ląstelės 5 minutes fiksuojamos 4 % paraformaldehidu. Du kartus praplaunama su PBS. Į melanomos A375 ląstelių kultūrą įpilama 0,1 % Triton X-100 ir laikoma 5 minutes kambario temperatūroje. Tada inkubuojama su 1 % jaučio serumo albuminu (BSA) 30 minučių, kad užkirstų kelią nespecifinei baltymo–baltymo sąveikai.

Ląstelės inkubuojamos su pirminiu vinkuliną surišančiu antikūnu (ab18058, RRID: AB_444215, praskiestas santykiu 1:200) ir laikomas 2 valandas kambario temperatūroje. Tuomet naudojamas antrinis antikūnas ab150113 Alexa Fluor® 488 ožkos anti-pelės IgG (H + L, RRID: AB_2576208), kurio koncentracija 2 µg / ml, buvo naudojama 45 minutes kartu su TEXred ™ -X Phaloidinu (Invitrogen, T7471, praskiestas 1:40 1 % BSA) F-aktino dažymui ir 1,43 µg DAPI branduolio vizualizacijai. Phaloidinas yra junginys, kuris specifiškai kimba prie f-aktino. Jis konjunguotas su TEXred fluorescenciniu dažu.

Ląstelės buvo vizualizuotos naudojant fluorescencinį mikroskopą Zeiss Axio Observer.Z1, stebint per x100 objektyvą. Nuotraukos analizuojamos ,,Image J“ atviros prieigos programa. Fokalinių sukibimų skaičius buvo įvertintas kaip vinkulino ir aktino kolokalizacijos taškų skaičius tenkantis vienai ląstelei.

2.5. Melanomos augimas ir invazyvumas ląsteliniame modelyje 2.5.1. Transepitelinė elektrinė varža

Šis metodas taikomas norint patikrinti 3D odos modelio integralumą. Varžos pokytis stebimas, kuomet ląstelės konfluentiškai suauga ir pro ją nepraleidžiama elektros srovė, tada varža, išreiškiama matavimo vienetais omais (simbolis Ω), didėja.

Prieš pradedant matavimą, paruošiama 6 šulinėlių plokštelė (16 pav.) su įdėklais viduje. Pakeičiama visa terpė vidinėje ir išorinėje įdėklo dalyje. Ši procedūra atliekama tam, kad būtų išlaikytos vienodos sąlygos visų matavimų metu, taip išvengiama paklaidos dėl skirtingos terpės nugaravimo kiekio.

Varžai matuoti naudojamas voltommetras. Preitaiso veikimo schema pavaizduota 17 paveikslėlyje. Elektrodai dezinfekuojami 70% etanolio tirpalu ir nuplaunama su PBS. Yra dvi elektrodo atšakos – trumpesnė talpinama į įdėklą neliečiant susifromavusio ląstelių sluoksnio, o ilgesnė merkiama į šulinėlį tik su terpe. Registruojami rodmenys prietaiso skydelyje.

16 pav. Matavimui paruošta 6 šulinėlių plokštelė su įdėklais viduje

2.5.2. Imunohistocheminė analizė

Imunohistocheminė odos modelių analizė buvo atliekama LSMU Anatomijos institute. Suformuotas ląstelinis 3D odos modelis buvo fiksuojamas su 4 % paraformaldehidu 15 min. Po to atlikti trys plovimai su PBS po 30 min. Audinio įliejimas yra automatizuotas naudojant automatinio parafino įliejimo prietaisą. Įdėjus mėginius nustatoma beveik 10 valandų programa, kurios metu mėginys veikiamas didėjančios alkoholio koncentracijos tirpalais, kol pasiekią beveik 100 % gynumą. Audinys yra dehidratuojamas, t.y. iš jo pašalinamas visas vanduo. Tada veikiamas ksilenu ir pabaigoje parafinu. Ištraukus mėginius jie sudedami į parafino voneles aparatą, kad būtų galima išlieti į vientisą parafino plokštelę. Tada įstatoma į mikrotomą, kuris aštriais peiliukais supjausto 5 µm storio sluoksniais, kurie vėliau sudedami ant stiklelių. Su šiais paruoštais mėginiais atliekamas hematoksilino ir eozino dažymo metodas ir imunofluorescencinė analizė naudojant pirminius ir antrinius antikūnius.

2.5.3. Hematoksilino ir eozino dažymo metodas

Dažymo metu ląstelės branduolys ir citoplazma nudažomi kontrastingomis spalvomis, kad būtų galima lengva atskirti ląstelinius komponentus. Baziniai hematoksilino dažai nudažo branduolio chromatiną ir kitus bazofilinus ląstelės komponentus mėlynai violetine spalva, o rūgštiniai eozino dažai nudažo citplazmą ir kitas acidofilines struktūras rožine spalva. Rausva arba raudona spalva rodo raumeninį audinį. Ryškiai radona – eritrocitus. Norint tinkamai paruošti audinį dažymui atliekamas deparafinizavimas pagal 3 lentelėje nurodytą eigą.

3 lentelė. Deparafinizavimo eiga

Eiliškumas Tirpalas Trukmė

1. Ksilenas 2 x 5 min

2. Etanolis 96 %

3 min

3. Etanolis 70 %

4. Etanolis 50 %

5. PBS arba vanduo 1 min

Pašalinus parafiną iš audinio galima pradėti dažymą pagal 4 lentelėje aprašytą protokolą. 4 lentelė. Dažymo eiga

Eiliškumas Tirpalas Trukmė

1. Hematoksilinas 5 min 2. Vanduo 1 min 3. Distiliuotas vanduo + HCl 1 % 4. Vanduo 5. Eozinas 30 sek. 6. Vanduo 1 min 7. Etanolis 70 % 2 x 1 min 8. Etanolis 96 % 9. Ksilenas 2 x 30 sek.