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5. DISCUSSIONE
Una volta identificati, i geni la cui espressione è modulata dal CFC a 48 ore dal condizionamento sono stati raggruppati in classi funzionali. In questa tesi sperimentale è stata presa in considerazione la classe dei geni che codificano per proteine implicate nella modulazione dell’attività sinaptica. In seguito ad analisi traduzionale tra campioni di ratti condizionati e naïve è stata dimostrata una variazione della concentrazione delle proteine amfifisina 1, stathmina 1 e profilina 2. Le analisi sono state eseguite su preparati di espianti delle strutture corticali e sottocorticali della porzione medio-temporale del cervello di ratto. Come detto, gli espianti sono stati eseguiti a 48 h dall’acquisizione del condizionamento contestuale alla paura.
5.1. Stathmina 1
Per quanto riguarda la proteina stathmina 1, l’analisi degli estratti proteici ha evidenziato un aumento della sua concentrazione nei campioni prelevati dai ratti condizionati rispetto ai naïve.
Le proteine associate alla crescita neuronale (neuronal growth-associated proteins, nGAPs) sono i prodotti di geni neurone-specifici, la cui espressione è strettamente correlata ai processi di formazione e rigenerazione dei prolungamenti neuronali (Mori and Morii, 2002). Infatti, in seguito a lesioni corticali e ippocampali in cervelli di ratti
69 adulti, è possibile osservare una attivazione della trascrizione dei geni che codificano per nGAPs come stathmina, GAP-43 e SCG10.
La stathmina, detta anche P19 (Pasmantier, Danoff, Fleischer and Schubart, 1986), metaplastina (Schubart, Yu, Amat, Wang, Hoffmann and Edelmann, 1996), pp17 (Braverman, Bhattacharya, Feuerstein and Cooper, 1986), prosolina (Cooper, Fuldner, McDuffie and Braverman, 1991) e oncoproteina18 (Hanash, Strahler, Kuick, Chu and Nichols, 1988), è una fosfoproteina ubiquitaria citoplasmatica di peso molecolare di 19 kDa che regola la dinamica dei microtubuli (Belmont and Mitchison, 1996; Curmi, Andersen, Lachkar, Gavet, Karsenti, Knossow and Sobel, 1997) e integra diversi segnali di secondi messaggeri (Leighton, Curmi, Campbell, Cohen and Sobel, 1993; Ozon, Maucuer and Sobel, 1997). La stathmina ha una struttura molecolare altamente conservata nei vertebrati e prende il suo nome da una famiglia di proteine che hanno in comune un dominio ad α-elica (Bräuer, Savaskan, Plaschke, Ninnemann and Nitsch, 2001). La struttura tridimensionale della stathmina contiene tre regioni distinte: una regione regolatoria N-terminale (N: 1-44) con i siti di fosforilazione, una regione con un’alta tendenza a formare α-eliche (H1: 45-89, elica 1) e una regione con una bassa tendenza a formare α-eliche (H2: 90-142, elica 2). L’intera proteina e la combinazione di H1 e H2 inibiscono la polimerizzazione della tubulina, mentre la combinazione di H1 con la porzione N-terminale risulta meno efficiente. Le tre regioni da sole non sono in grado di svolgere la funzione della proteina assemblata, sebbene siano tutte in grado di interagire con l’α-tubulina. La stathmina si lega a livello dell’elica 10 dell’α-tubulina, la regione coinvolta nelle interazioni longitudinali dei microtubuli, isolando l’eterodimero e prevenendo la formazione di polimeri di α-βtubulina (figura 15). Quando manca della
70 porzione N-terminale, la stathmina si lega costitutivamente alla molecola di α-tubulina sulla cima dell’eterodimero, impedendone la polimerizzazione (Wallon, Rappsilber, Mann and Serrano, 2000).
Fig.15: modello della regolazione della dinamica della rete di microtubuli. La
stathmina promuove la depolimerizzazione legando gli eterodimeri liberi di tubulina e inducendo cambiamenti conformazionali alle estremità dei microtubuli polimerizzati (tratto da Rubin and Atweh, 2004).
Vari studi hanno dimostrato che la stathmina viene prodotta precocemente nel corso dello sviluppo del sistema nervoso e gioca un ruolo importante nella crescita assonale (Amat, Fields and Schubart, 1991; Di Paolo, Lutjens, Osen Sand, Sobel, Catsicas and Grenningloh, 1997; Sugiura and Mori, 1995). Infatti le proiezioni neuronali esprimono questa proteina durante la crescita assonale e la differenziazione sinaptica. Nel cervello di ratto, l’mRNA della stathmina è isolato a
71 partire dal giorno 12 dello sviluppo embrionale (Amat, Fields and Schubart, 1991; Sugiura and Mori, 1995). In seguito, la concentrazione dell’mRNA aumenta nel cervello fino alla nascita, per poi decrescere a livelli 20 volte inferiori a partire dal decimo giorno postnatale fino all’età adulta (Amat, Fields and Schubart, 1991; Sugiura and Mori, 1995). Durante lo sviluppo postnatale l’espressione della stathmina diminuisce drasticamente (Sugiura and Mori, 1995), sebbene negli adulti permangano ancora livelli significativi della proteina (Himi, Okazaki, Wang, McNeill and Mori, 1994). In generale l’espressione genica delle nGAPs è variabile con l’età: nel topo adulto (3 mesi di età), l’espressione della stathmina è limitata a cervello e testicoli (Schubart, Xu, Fan, Cheng, Goldstein, Alpini, Shafritz, Amat, Farooq and Norton, 1992), mentre nel cervello di animali anziani l’mRNA della stathmina è ridotto in varie aree che comprendono corteccia, ippocampo, talamo, ipotalamo e cervelletto. La stathmina è stata proposta come efficiente marker della plasticità sinaptica neuronale (Mori, 1997). La sua sintesi è indotta in seguito a LTP durante il periodo critico di apprendimento del canto negli uccelli, nonché in quello di formazione delle colonne di dominanza oculare nel gatto (Mori and Morii, 2002) e nelle scimmie (Higo, Oishi, Yamashita, Matsuda and Hayashi, 2000).
L’espressione di mRNA di stathmina è stata principalmente osservata in neuroni con piccoli corpi cellulari e processi brevi, come cellule dei granuli e interneuroni di corteccia, striato e talamo. Inoltre una popolazione di neuroni lungo la parti interne del giro dentato, presumibilmente cellule staminali nervose, hanno mostrato un’alta espressione di mRNA di stathmina , indicando che questa proteina è coinvolta nella differenziazione e nella proliferazione neuronale (Himi, Okazaki, Wang, McNeill and Mori, 1994).
72 Per quanto riguarda il ruolo della stathmina nel disassemblaggio dei microtubuli le prime evidenze derivano dagli studi effettuati da Belmont e Mitchison (1996). Questi esperimenti hanno dimostrato che la purificazione di questa proteina in estratti cell-free di Xenopus laevis promuove cambiamenti importanti nei microtubuli del fuso mitotico. Questa azione è stata in seguito confermata da altri studi (Larsson, Marklund, Gradin, Brattsand and Gullberg, 1997; Curmi, Andersens, Lachkar, Gavet, Karsenti, Knossow and Sobela, 1997; Horwitz, Shen, He, Dittmar, Neef, Chen and Schubart, 1997) e la stathmina si è rivelata essere uno dei maggiori regolatori negativi della struttura microtubulare, sia in vivo che in vitro (Lawler, 1998).
Topi knockout (KO) per la stathmina si sviluppano normalmente e non mostrano anomalie anatomiche, del cervello (Schubart, Yu, Amat, Yang, Hoffmann and Edelmann, 1996) e neppure nella morfologia dei neuroni (Shumyatsky, Malleret, Shin, Takizawa, Tully, Tsvetkov, Zakharenko, Joseph, Vronskaya, Yin, Schubart, Kandel and Bolshakov, 2005). Invece, a livello molecolare, la quantità di α-tubulina nei microtubuli dei topi KO aumenta del 50% rispetto ai controlli. L’aumento del livello della tubulina polimerizzata conferma che la dinamica microtubulare subisce una diminuzione in seguito alla mancanza di stathmina (Shumyatsky, Malleret, Shin, Takizawa, Tully, Tsvetkov, Zakharenko, Joseph, Vronskaya, Yin, Schubart, Kandel and Bolshakov, 2005); il corrispondente aumento della loro stabilità comporta un accumulo delle strutture microtubulari nell’amigdala (Westermann and Weber, 2003). Inoltre la stathmina ha un qualche ruolo nella regolazione dei microtubuli del fuso durante il ciclo cellulare (Mori and Morii, 2002). I microtubuli sono coinvolti nell’attività sinaptica cerebrale, trasportando differenti molecole e organelli in prossimità delle sinapsi (Hirokawa and
73 Takemura, 2005). Altri studi indicano che il controllo della dinamica dei microtubuli da parte della stathmina è un evento necessario alla crescita e al rimaneggiamento dei prolungamenti neuronali (Belmont and Mitchison, 1996).
L’attività di depolimerizzazione dei microtubuli viene fortemente inibita dalla fosforilazione di specifici residui di serina della stathmina (Larsson, Melander, Marklund, Osterman and Gullberg, 1995; Marklund, Larsson, Gradin, Brattsand and Gullberg, 1996). Questa fosforilazione promuove la dissociazione della stathmina dai dimeri di tubulina, permettendo la formazione dei microtubuli. Sebbene la Stathmina contenga vari residui di serina come siti di fosforilazione, quelli critici per la regolazione attività-dipendente dei microtubuli sono Ser16, Ser25, Ser38 e Ser63. I mutanti A4 che hanno tutti e quattro questi residui di serina rimpiazzati da alanina, mostrano una destabilizzazione costitutiva dei microtubuli, attività non controllata da stimoli extracellulari (Gavet, El Messari, Ozon and Sobel, 2002). Osservazioni in vitro e in omogenati di cervello hanno dimostrato che la stathmina viene fosforilata dalla chinasi-ciclina-dipendente 5 (Cdk5) sui residui Ser25 e Ser38. Questi residui servono come substrato anche per l’attività della MAPK e della p38 MAPKδ (Leighton, Curmi, Campbell, Cohen and Sobel, 1993; Parker, Hunt, Diener et al., 1998). La Cdk5 fosforila preferenzialmente il residuo Ser38: infatti la fosforilazione della Ser38 è ridotta nei topi KO per Cdk5. La delezione del gene che codifica per la Cdk5 mostra inoltre diverse anomalie nella dinamicità microtubulare e nello sviluppo nervoso (Ohshima, Ward, Huh, Longenecker, Veeranna Pant, Brady, Martin and Kulkarni, 1996). Per quanto riguarda le MAPK invece, entrambe fosforilano soprattutto il residuo Ser25. La stathmina viene inoltre fosforilata dalla PKA sui
74 residui Ser16 e Ser63 (Beretta, Dobransky and Sobel, 1993), dalla Pak1, dalla CaMKII e IV/Gr sul residuo Ser16 (Wittmann, Bokoch and Waterman-Storer, 2004; Marklund, Larsson, Brattsand, Osterman, Chatila and Gullberg, 1994; Le Gouvello, Manceau and Sobel, 1998), e dalla Cdk1/cdc2 sui residui Ser25 e Ser38 (Beretta, Dubois, Sobel and Bensaude, 1995). La fosforilazione di Ser16 e Ser63 riduce l’affinità di legame della stathmina per gli eterodimeri di tubulina (Di Paolo, Lutjens, Osen Sand, Sobel, Catsicas and Grenningloh, 1997; Larsson, Marklund, Gradin, Brattsand and Gullberg, 1997). Inoltre è stato ipotizzato che le fosforilazioni di Ser25 e Ser38 regolino a loro volta lo stato di fosforilazione di Ser16 e Ser63, anche se apparentemente hanno solo un lieve effetto sulla capacità di legame della tubulina (Larsson, Melander, Marklund, Osterman and Gullberg, 1995; Larsson, Marklund, Gradin, Brattsand and Gullberg, 1997). Quindi la stathmina sarebbe un punto di convergenza di una serie di vie di segnalazione coinvolte nella modulazione della dinamicità citoscheletrica.
Nel sistema nervoso, la stathmina è stata rinvenuta in diversi nuclei dell’amigdala (nucleo laterale, basolaterale e basomediale); la sua espressione è particolarmente elevata nell’amigdala laterale. Inoltre la stathmina è espressa nelle regioni deputate al processamento delle informazioni relative all’US e al CS prima che queste vengano inviate all’amigdala. Le aree relative al CS sono il nucleo posteriore intralaminare, il nucleo genicolato mediale e il nucleo genicolato superiore del talamo uditivo, nonché l’area TE3 della corteccia uditiva. La stathmina è inoltre localizzata anche nelle aree S1 e S2 della corteccia somatosensoriale, della corteccia parietale e parieto-insulare. Dunque la stathmina è espressa in quelle regioni che ritrasmettono le informazioni relative a CS e US all’amigdala. Altre aree dove è rilevabile la presenza
75 della stathmina sono la corteccia piriforme ed endopiriforme, le quali sono reciprocamente connesse all’amigdala (Majak, Pikkarainen, Kemppainen, Jolkkonen and Pitkanen, 2002). Nello sviluppo del sistema nervoso, la stathmina compare inizialmente nei giorni 12-13 embrionali, nei neuroni post-mitotici della zona del mantello, ed è abbondante nelle forme immature più precoci di neuroni e astrociti (Amat, Fields and Schubart, 1991). In seguito alla comparazione di cervelli di topo prelevati subito dopo la nascita con altri prelevati all’età di 2 settimane e di 2mesi, è stato determinato che la stathmina è presente in molte aree dei cervelli postnatali, ma la sua presenza diminuisce progressivamente nei cervelli giovanili e adulti. In questi ultimi la stathmina rimane solo a livello dell’amigdala e dei circuiti suddetti deputati al CS e all’US (Shumyatsky, Malleret, Shin, Takizawa, Tully, Tsvetkov, Zakharenko, Joseph, Vronskaya, Yin, Schubart, Kandel and Bolshakov, 2005). Nei ratti adulti la stathmina è localizzata prevalentemente nel giro dentato, nell’ilo e nello strato CA1 dell’ippocampo. In seguito a lesioni della via perforante, la trascrizione della stathmina aumenta in maniera rilevante nel giro dentato ipsilaterale alla lesione, nell’ilo e nel campo CA1. L’mRNA di stathmina aumenta in seguito a lesioni da 3 a 21 giorni nelle formazioni ippocampali ipsilaterali e controlaterali (Bräuer, Savaskan, Plaschke, Ninnemanno and Nitsch, 2001). Queste lesioni sono sufficienti a indurre un aumento significativo di stathmina nei neuroni ippocampali. L’elongazione dei neuriti è caratteristica nei neuroni durante la loro fase di differenziazione e maturazione. Durante l’elongazione neuritica, la dinamica dei microtubuli è critica per lo sviluppo e la maturazione del sistema nervoso (Melander Gradin, Marklund, Larsson, Chatila and Gullberg, 1997). I riarrangiamenti microtubulari sono cruciali inoltre per il mantenimento e il rimodellamento del sistema nervoso durante la vita
76 adulta, e sono modulati in particolar modo durante il processo adattativo in seguito a lesioni (Kwak and Matus, 1988).
Altri studi indicano che i livelli di mRNA di stathmina sono selettivamente e significativamente ridotti nei cervelli di ratti anziani (Mori and Morii, 2002). L’mRNA codificante per la stathmina è indotto in seguito a deafferentazione neuronale nel cervello di animali giovani maturi (McNeill, Mori and Cheng, 1999), sebbene l’induzione di mRNA si riduce significativamente durante l’invecchiamento. In seguito a lesioni dell’asse corticostriatale, che portano a deafferentazione neuronale, i cervelli di ratti giovani mostrano un aumento dell’espressione dell’mRNA di stathmina, mentre con la stessa procedura eseguita in cervelli di animali anziani l’induzione di mRNA subisce una riduzione drammatica. I cervelli anziani mostrano una riduzione anche della responsività, dovuta a una riduzione della sinaptogenesi (Mori and Morii, 2002).
L’espressione della stathmina si riduce non solo nel corso dell’invecchiamento ma anche nel caso di patologie neurodegenerative legate all’età, come nella malattia di Alzheimer (AD) (Mori and Morii, 2002). Dati sperimentali indicano un aumento dell’espressione genica della stathmina nei cervelli dei malati di AD, mentre la presenza della proteina diminuisce (Jin, Masliah, Iimoto, Deteresa, Mallory, Sundsmo, Mori, Sobel and Saitoh, 1996). Alla base di questa discordanza potrebbero esserci varie cause, come un malfunzionamento dell’apparato traduzionale ribosomale, che potrebbe a sua volta essere correlato all’aumento della densità dei grovigli neurofibrillari (NFT) presenti nel citoplasma dei neuroni. Varie osservazioni sperimentali suggeriscono infatti una possibile produzione anormale delle nGAPs nei neuroni che presentano tali accumuli citoplasmatici che, com’è noto, accompagnano
77 il decorso della malattia dell’AD (Mori and Morii, 2002). Inoltre questa espressione genica anormale della stathmina è stata osservata nell’ippocampo, nella corteccia cerebrale, nella corteccia temporale e nell’amigdala, le regioni cerebrali maggiormente coinvolte nell’AD (Mori and Morii, 2002). Questi dati evidenziano una possibile correlazione tra la mancanza della stathmina e i danni mnestici relativi soprattutto alle informazioni apprese in seguito al manifestarsi della patologia. E’ interessante inoltre notare una diminuzione della stathmina anche nei cervelli di pazienti affetti da sindrome di Down (Cheon, Fountoulakis, Cairns, Dierssen, Herkner and Lubec, 2001).
Altri studi sottolineano come la presenza della stathmina sia necessaria per l’espressione della paura innata e per la formazione della memoria nella paura appresa. La stathmina è fortemente presente nell’amigdala laterale, il centro principale che riceve informazioni relative all’US e al CS durante l’apprendimento della paura. Inoltre, il profilo di espressione della stathmina riflette l’anatomia dei circuiti neuronali che portano le informazioni correlate alla paura di US e CS all’amigdala. Sebbene la trasmissione sinaptica basale e la funzionalità dei recettori NMDA siano normali, nei topi KO non è possibile indurre l’ LTP nei circuiti cortico-amigdaloideo e talamo-cortico-amigdaloideo. Stesso risultato si ottiene trattando topi wild-type con taxolo, uno stabilizzatore microtubulare. In accordo con la mancanza di LTP, topi KO per la stathmina mancano della paura appresa sia in seguito a FC che a CFC quando testati a 24 h dal training di condizionamento. Questa mancanza di apprendimento non è dovuta a una generale diminuzione della sensibilità al dolore o dell’attività locomotoria (Shumyatsky, Malleret, Shin, Takizawa, Tully, Tsvetkov, Zakharenko, Joseph, Vronskaya, Yin, Schubart, Kandel and Bolshakov, 2005).
78 Dai risultati ottenuti in questa tesi sperimentale è stato osservato un aumento della quantità della proteina stathmina1 nelle regioni medio-temporali del cervello di ratto a 48 ore di distanza dal paradigma del contextual fear conditioning. Questo risultato e quelli di altri studi permettono di ipotizzare un ruolo fondamentale della proteina stathmina nel mantenimento dell’LTP nel sistema nervoso del ratto, nonché di attribuire una funzione cruciale a questa proteina nei fenomeni di plasticità sinaptica alla base dell’apprendimento e del consolidamento della memoria a lungo termine relativi alla paura contestuale. Importante sembra anche il suo ruolo nella formazione della struttura fibrillare degli assoni. La sua mancanza, quindi, si tradurrebbe in un minore trasporto assonale e in una diminuzione della intercomunicabilità cellulare.
5.2. Amfifisina 1
Per quanto riguarda la proteina amfifisina 1, l’analisi degli estratti proteici ha evidenziato una diminuzione della sua concentrazione nei campioni prelevati dai ratti condizionati rispetto ai naïve.
In seguito al rilascio del neurotrasmettitore le vescicole sinaptiche vengono continuamente riformate per endocitosi dalla membrana presinaptica. Indipendentemente dal tipo cellulare l’endocitosi comprende una serie di passaggi. Innanzitutto avviene il raggruppamento dei recettori in specifiche regioni della membrana plasmatica (clustering), siti che in seguito vengono rivestiti di clatrina. Un altro evento importante è l’attivazione della dinamina: questa proteina va ad assemblarsi in una struttura ad anello che circonda il collo delle vescicole endocitiche in formazione e lo stringe progressivamente fino a
79 determinare l’entrata delle vescicole (Hinshaw and Schmid, 1995; De Camilli, Takei and McPherson, 1995). Il legame della dinamina ai siti specifici delle cavità rivestite di clatrina e la sua attivazione enzimatica vengono regolati a loro volta dalle amfifisine, proteine che rivestono un ruolo molto importante in questi processi.
La famiglia delle amfifisine comprende diverse isoforme ritrovate nei vertebrati, nei nematodi e nel lievito, che condividono una natura idrofilica e fortemente acida, sebbene la loro sequenza aminoacidica sia solo debolmente correlata.
L’amfifisina 1(Amph1) è stata identificata per la prima volta nel 1992 come una proteina presente nel cervello di ratto e di pollo, a livello delle sinapsi, e parzialmente associata alle vescicole sinaptiche (Lichte, Veh, Meyer and Kilimann, 1992). La Amph1 ha quattro domini primari. All’estremità N-terminale si trova il dominio BAR (Bin-Amphiphysin-Rvs) (Elliott, Sakamuro, Basu, Du, Wunner, Staller, Gaubatz, Zhang, Prochownik, Eilers and Prendergast, 1999), evolutivamente conservato nelle diverse isoforme, in grado di captare le deformazioni della membrana plasmatica in vitro e in vivo (Peter, Kent, Mills, Vallis, Butler, Evans and McMahon, 2004; Takei, Slepnev, Haucke and De Camilli, 1999). All’estremità C-terminale si trova il dominio SH3 (Src homology 3), presente in tutte le isoforme tranne che nell’omologo Rvs161 del lievito. Nella regione centrale dei vertebrati e nematodi sono presenti due domini: uno ricco in prolina (PRD) che non è presente nel lievito, anche se la regione corrispondente dell’omologo Rvs167 è ricca in glicina, prolina e alanina (per questo viene anche detta GPA region); il domino adiacente ( CLAP) è in grado di legare la clatrina e il complesso adattatore della membrana plasmatica (AP-2) (Micheva, Ramjaun, Kay
80 (fig.16). L’interazione tra il dominio SH3 della Amph1 e il dominio ricco in prolina della dinamina ha suggerito il coinvolgimento della Amph1 nell’endocitosi delle vescicole sinaptiche (David, McPherson, Mundigl and De Camilli, 1996). La microiniezione nelle sinapsi reticolospinali giganti di lampreda di domini SH3 ricombinanti di Amph1, che agiscono alterando la corretta formazione del complesso Amph1-dinamina, mostra un blocco significativo dell’endocitosi delle vescicole sinaptiche e un accumulo a livello della membrana plasmatica
Fig. 16: sommario dei domini e dei siti di fosforilazione di Amph1 (A) e Amph2 (B)
(tratto da Craft et al., 2008).
di cavità rivestite di clatrina (Shupliakov, Löw, Grabs, Gad, Chen, David, Takei, De Camilli and Brodin 1997). L’endocitosi delle vescicole sinaptiche è responsabile del recupero delle vescicole dalla membrana
81 plasmatica in seguito all’esocitosi (Cousin and Robinson, 2001). La sua attivazione a livello dei terminali assonali avviene in seguito all’entrata di Calcio nel citoplasma dovuta a depolarizzazione. Il Ca2+ stimola la proteina calcineurina (Marks,1998), una fosfatasi che defosforila le defosfine, un gruppo di proteine costitutivamente fosforilate che comprende, tra l’altro, amfifisina1, amfifisina2, dinamina1 e sinaptoianina (Cousin and Robinson, 2001). In seguito a depolarizzazione del terminale sinaptico e durante l’endocitosi delle vescicole, la Amph1 viene defosforilata dalla calcineurina, la quale viene attivata dall’entrata di Ca2+ nel citoplasma. Studi in vitro effettuati su neuroni di ratto hanno individuato 13 siti di fosforilazione della Amph1, utilizzando 32P come marcatore: serine 250, 252, 262, 268,272, 276, 285, 293, 496, 514, 539, 626 e treonina 310. Gli stessi esperimenti hanno evidenziato che i residui Thr-310, Ser-293, Ser-285, Ser-272, Ser-276 e Ser-268 mostrano un più alto contenuto di 32P e sono più facilmente defosforilati in seguito a stimolazione (Craft, Graham, Bache, Larsen and Robinson, 2008) (fig.16).
Un’altra proteina legata dalla Amph1 è la sinaptoianina, una proteina presinaptica di 145 kDa con attività 5’ fosfatasica che agisce su vari fosfolipidi, incluso il fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PIP2) (McPherson, Garcia, Slepnev, David, Zhang, Grabs, Sossin, Bauerfeind, Nemoto and De Camilli, 1996). La sinaptoianina presenta all’estremità C-terminale un dominio ricco in prolina molto simile a quello della dinamina, ed è proprio questo sito che viene legato dal dominio SH3 della amfifisina1 (McPherson, Garcia, Slepnev, David, Zhang, Grabs, Sossin, Bauerfeind, Nemoto and De Camilli, 1996). Il legame del dominio SH3 da parte della sinaptoianina previene l’attivazione della dinamina da parte dell’amfifisina. La dinamina presenta inoltre un
82 dominio PH con un’alta affinità per il PIP2, ma non per il prodotto della sua idrolisi, il fosfatidilinositolo 4-fosfato (PIP). L’interazione della dinamina con questi fosfolipidi di membrana e con l’amfifisina viene dunque modulata dalla sinaptoianina. L’altra isoforma presente nei mammiferi è quella dell’amfifisina2 (Amph2), le cui diverse forme predominanti derivanti da splicing alternativo sono dette anche BIN-1, SH3P9, BRAMP-2 o ALP-1. Nel cervello l’amfifisina2 è altamente concentrata a livello dei terminali assonali, mostrando una distribuzione molto simile, se non identica, a quella dell’amfifisina1 (Wigge, Kohler, Vallis, Doyle, Owen, Hunt and McMahon, 1997; Ramjaun, Micheva, Bouchelet and McPherson, 1997). Amph1 e Amph2 formano solitamente uno stabile eterodimero, che è infatti la forma predominante osservabile nel sistema nervoso. Inoltre anche il dominio SH3 della Amph2 si lega alla dinamina, essendo molto simile a quello della Amph1. E’ stato dunque ipotizzato che sia l’eterodimero Amph1-Amph2 a guidare le molecole di dinamina ai siti di endocitosi a livello delle terminazioni sinaptiche (Wigge, Kohler, Vallis, Doyle, Owen, Hunt and McMahon, 1997).
Una volta raggiunte le cavità rivestite di clatrina, l’amfifisina deve dissociarsi dalla dinamina affinché l’endocitosi possa proseguire. Secondo un possibile modello, l’amfifisina recluterebbe la dinamina nella forma di dimeri (Tuma and Collins, 1995) e tetrameri (Muhlberg, Warnock and Schmid, 1998) e li manterrebbe in questa forma fino ai siti target di membrana dove, una volta dissociati dall’amfifisina, andrebbero a costituire la tipica struttura ad anello attorno alle vescicole in formazione (Wigge and McMahon,1998).
Un’altra evidenza sperimentale che sottolinea l’importanza della Amph1 è l’attivazione della calpaina: in seguito a stimolazione ad alta frequenza
83 (HFS) in slices di ippocampo di ratto, questa proteasi porta alla produzione di forme tronche di Amph1, fenomeno che inibisce l’ endocitosi delle vescicole (Wu, Liang, Oda, Ohmori, Nishiki, Takei, Matsui and Tomizawa, 2007).
Sia la Amph1 che la Amph2 interagiscono inoltre con altri importanti fattori implicati nell’endocitosi mediata da clatrina. Uno di questi è il complesso adattatore della membrana plasmatica (AP-2), un eterotetramero che interagisce tramite la sua subunità α con la amfifisina (Wigge, Kohler, Vallis, Doyle, Owen, Hunt and McMahon, 1997; Leprince, Romero, Cussac, Vayssiere, Berger, Tavitian and Camonis, 1997; Wang and Strittmatter, 1997), ma legandosi a un dominio diverso di quello SH3 (David, McPherson, Mundigl and De Camilli, 1996). Infatti la Amph1 può legare contemporaneamente sia l’AP-2 che la dinamina (Wigge, Kohler, Vallis, Doyle, Owen, Hunt and McMahon, 1997). Un altro fattore importante legato sia dalla Amph1 che dalla Amph2 è la clatrina. Questa molecola sembra interagire con una sequenza conservata della regione centrale dell’amfifisina (Ramjaun and McPherson, 1998), e questo legame, sebbene avvenga su un dominio diverso, è mutuamente esclusivo con quello amfifisina-dinamina (McMahon, Wigge and Smith, 1997). Le interazioni dell’amfifisina con queste diverse molecole regolano l’endocitosi a livello del terminale sinaptico (figura 17).
La Amph1 riveste un ruolo importante non solo nei compartimenti presinaptici maturi, ma anche nella plasticità neuronale, fenomeno proprio dell’apprendimento e della memoria a lungo termine. Esperimenti condotti in vitro su neuroni di mutanti shibire (inattivazione temperatura-sensibile della dinamina) di Drosophila sottoposti a temperature restrittive hanno mostrato una diminuzione della crescita
84 neuritica (Masur, Kim and Wu,1990). Inoltre è stato osservato che l’inattivazione dell’espressione della dinamina1 tramite l’uso di oligonucleotidi antisenso ha un potente effetto inibitorio sulla crescita dei neuriti (Torre, McNiven and Urrutia, 1994).
Fig. 17: modello delle interazioni molecolari a livello del terminale sinaptico durante
l’endocitosi (tratto da Wigge and McMahon, 1998).
Dato che l’amfifisina1 è strettamente correlata alla dinamina è stato supposto che anche questa proteina avesse un ruolo fondamentale nella dinamica della crescita assonale e dendritica. A supporto di questa ipotesi, tramite l’uso di oligonucleotidi antisenso per sopprimere l’espressione della Amph1 è stata osservata una drastica diminuzione della crescita neuritica (Mundigl, Ochoa, David, Slepnev, Kabanov and De Camilli, 1998). Altri studi effettuati su neuroni ippocampali di ratto hanno dimostrato inoltre una correlazione tra l’aumento dei livelli di
85 Amph1e la progressione della crescita neuritica e della sinaptogenesi (Mundigl, Ochoa, David, Slepnev, Kabanov and De Camilli, 1998). Alla base del controllo della sinaptogenesi da parte della Amph1 c’è la sua possibile relazione con l’actina e gli elementi citoscheletrici, come suggerito da studi sugli omologhi di lievito Rvs167 e Rvs161, riguardanti le loro relazioni con l’actina nella polarità della crescita cellulare e nella morfologia cellulare (Munn, Stevenson, Geli and Riezman, 1995; crouzet et al, 1991; sivadon et al, 1995). La Amph1 può interagire indirettamente con l’actina attraverso il suo legame con la sinaptoianina che, tramite la sua azione 5’-fosfatasica, taglia i fosfoinositidi, potenti regolatori delle funzioni dell’actina (Janmey, 1994).
Topi knockout che mancano della Amph1 mostrano diversi problemi, sebbene non siano evidenti cambiamenti anatomici né istologici e i ratti si riproducano e sviluppino normalmente. Innanzitutto è stato osservato un aumento della mortalità durante i primi due mesi dell’età adulta in seguito a strokes epilettici di grande intensità. I ratti inoltre mostrano deficit cognitivi e di memoria, sottolineando l’importanza della Amph1 nelle funzioni cerebrali più elevate (Di Paolo, Sankaranarayanan, Wenk, Daniell, Perucco, Caldarone, Flavell, Picciotto, Ryan, Cremona and De Camilli, 2002). Analisi proteomiche hanno rilevato in questi topi l’assenza della Amph2 nei neuroni, suggerendo che la Amph1 stabilizza la Amph2 in quelle popolazioni cellulari dove le due isoforme costituiscono un eterodimero. Il fatto che i topi knockout siano in grado di riprodursi e di svilupparsi normalmente mostra che l’assenza dell’amfifisina consente comunque un normale funzionamento basale del sistema nervoso. I deficit cognitivi derivanti dalla mancanza della Amph1 sono comunque importanti. I ratti esibiscono un deficit di
86 apprendimento severo quando sottoposti al test della piattaforma acquatica di Morris così come al fear conditioning (Di Paolo, Sankaranarayanan, Wenk, Daniell, Perucco, Caldarone, Flavell, Picciotto, Ryan, Cremona and De Camilli, 2002).
Dai risultati ottenuti in questa tesi sperimentale è stata osservata una diminuzione della presenza della proteina Amfifisina1 a 48 ore di distanza dal contextual fear conditioning. Come descritto nell’introduzione, il condizionamento contestuale alla paura comporta modificazioni dell’LTP a livello dell’ippocampo. L’LTP richiede una continua attivazione della funzionalità sinaptica durante la fase di formazione, di rilascio e di endocitosi delle vescicole sinaptiche. Essendo l’amfifisina coinvolta direttamente nell’endocitosi delle vescicole, la diminuzione della sua concentrazione si tradurrebbe in una riduzione del reuptake del neurotrasmettitore eccitatorio (glutammato). Il risultato sarebbe dunque un potenziamento della trasmissione sinaptica, evento fondamentale per il mantenimento dell’LTP alla base della memoria a lungo termine indotta da contextual fear conditioning.
5.3. Profilina 2
L’analisi degli estratti proteici ha evidenziato un aumento della concentrazione della proteina profilina 2 nei campioni prelevati dai ratti condizionati rispetto ai naïve.
I microfilamenti di actina del citoscheletro sono strutture altamente dinamiche. Nel sistema nervoso, queste strutture regolano la polarità e la crescita assonale, la motilità del cono di crescita, il prolungamento delle spine dendritiche e la migrazione dei precursori dei neuroni.
87 Le profiline sono una famiglia di proteine che , legando la G-actina, svolgono un ruolo chiave nella regolazione delle dinamiche citoscheletriche (Carlsson , Nystrom, Sundkvist, Markey and Lindberg, 1977). La profilina è una proteina di 15 kDa, abbondantemente espressa in tutte le cellule eucariotiche, dal lievito ai mammiferi, inizialmente isolata in complesso con monomeri di actina in rapporto 1:1. La caratterizzazione del suo effetto sulla polimerizzazione dell’actina ha stabilito il ruolo chiave della profilina nella regolazione delle dinamiche dei microfilamenti (Schluter, Jockusch and Rothkegel, 1997). L’importanza delle profiline è stata dimostrata da vari studi su lievito, sulle muffe, sulla mosca e sul topo (Cooley, Verheyen and Ayers, 1992; Balasubramanian, Hirani, Burke and Gould, 1994; Haugwitz, Noegel, Karakesisoglou and Schleicher, 1994; Witke, Sutherland, Sharpe, Arai and Kwiatkowski, 2001). Le profiline hanno tre siti di legame: il sito di binding per le sequenze proteiche ricche in prolina, il sito di binding per l’actina e il sito di binding per il fosfoinositidol 4,5 difosfato (PIP2)
(Bjorkegren, Rozycki, Schutt, Lindberg and Karlsson, 1993). La maggior parte degli organismi presenta più geni codificanti per le profiline: nel topo e nell’uomo sono stati identificati quattro geni che codificano per quattro diverse isoforme (1-4) della proteina. Mentre la profilina 3 e la profilina 4 sono prodotte soltanto a livello dei testicoli (Obermann, Raabe, Balvers, Brunswig, Schulze and Kirchhoff, 2005), il gene per la profilina 1 è espresso a tutti gli stadi dello sviluppo embrionale e si ritrova in tutti i tipi cellulari e tessuti (Witke, Podtelejnikov, Di Nardo, Sutherland, Gurniak, Dotti and Mann, 1998). Il gene della profilina 2 invece mostra la più alta espressione a livello dei tessuti cerebrali (Di Nardo, Gareus, Kwiatkowski and Witke, 2000). Topi knockout (KO) che mancano della profilina 2 non mostrano deficit
88 durante lo sviluppo embrionale, e anche lo sviluppo del sistema nervoso sembra procedere normalmente. L’analisi ultrastrutturale conferma un numero e una morfologia normali delle sinapsi di ippocampo, cervelletto e striato, indicando che la profilina 2 non è fondamentale per la migrazione e la differenziazione neuronale in vivo. La migrazione, l’estensione neuritica e la polarità dei neuroni sembrano dipendere solo dalla profilina 1, mentre il controllo della polimerizzazione dell’actina nelle sinapsi sembra essere deputata esclusivamente alla profilina 2 (Pilo Boyl, Di Nardo, Mulle, Sassoè-Pognetto, Panzanelli, Mele, Kneussel, Costantini, Perlas, Massimi, Vara, Giustetto and Witke, 2007). Ciò spiega che l’isoforma 1 ha un ruolo soprattutto nel regolare lo sviluppo neuronale, mentre l’isoforma 2 della profilina agisce nel controllo dell’attività sinaptica promuovendo la polimerizzazione dell’actina. Sebbene nel cervello siano prodotte entrambe le isoforme, analisi su estratti cerebrali hanno evidenziato una presenza 2-3 volte maggiore della profilina 2 rispetto alla profilina 1 (Witke, Sutherland, Sharpe, Arai and Kwiatkowski, 2001). La profilina 2 è ampiamente prodotta in varie regioni come cervelletto, ippocampo, striato e bulbo olfattivo (Pilo Boyl, Di Nardo, Mulle, Sassoè-Pognetto, Panzanelli, Mele, Kneussel, Costantini, Perlas, Massimi, Vara, Giustetto and Witke, 2007). Le proprietà biochimiche della profilina 1 e della profilina 2 dei mammiferi sono simili (Gieselmann, Kwiatkowski, Janmey and Witke, 1995; Lambrechts, Van Damme, Goethals, Vandekerckhove and Ampe, 1995), ma un’importante differenza tra le due isoforme consiste nella loro ripartizione in diversi complessi proteici: in particolare, la profilina 2 si associa con sinapsina, dinamina 1 (Witke, Podtelejnikov, Di Nardo, Sutherland, Gurniak, Dotti and Mann, 1998), Azonina/Piccolo (Wang, Kibschull, Laue, Lichte, Petrasch-Parwez and Kilimann, 1999) e con
89 altre proteine (Nap1, Cyfip/Sra1 e WAVE1) che costituiscono il
complesso proteico definito come WAVE-complex (Witke,
Podtelejnikov, Di Nardo, Sutherland, Gurniak, Dotti and Mann, 1998). La profilina 2 è essenziale per promuovere la polimerizzazione dell’actina nelle sinapsi. Questa sua funzione sembra esplicarsi proprio tramite l’interazione con il WAVE-complex: nei neuroni, le proteine che costituiscono tale complesso si associano infatti con la profilina 2, ma non con la profilina 1. (Eden, Rohatgi, Podtelejnikov, Mann and Kirschner, 2002). Ciò indica che l’interazione a livello delle sinapsi potrebbe essere un evento importante nel controllo della polimerizzazione dell’actina, e quindi nel rilascio delle vescicole sinaptiche (Pilo Boyl, Di Nardo, Mulle, Sassoè-Pognetto, Panzanelli, Mele, Kneussel, Costantini, Perlas, Massimi, Vara, Giustetto and Witke, 2007). Come detto, questa proteina si lega alla G-actina in un complesso 1:1 e dunque sequestra i monomeri di actina. In seguito a questo legame, la profilina agisce come fattore di scambio nucleotidico, permettendo all’actina di legare ATP (Mockrin and Korn, 1980; Goldschmidt, Furman, Wachsstock, Safer, Nachmias and Pollard, 1992). Studi sulla cinetica della polimerizzazione dell’actina hanno messo in evidenza che la profilina di solito accelera la crescita dei filamenti di actina (Pantaloni and Carlier, 1993). L’interazione fra profilina e actina è inoltre regolata dai fosfoinositidi (Lassing and Lindberg, 1985). E’ stato osservato che il PIP2 disgrega il complesso profilina-actina, evento che, promuovendo il
rilascio dei monomeri di actina quando legati all’ATP, potrebbe portare alla polimerizzazione locale di actina (Pollard, Blanchoin and Mullins, 2001).
Un’altra caratteristica della profilina 2 è la capacità di interagire con ligandi come ROCK2, sinapsina, POP-130/CyFIP1 e dinamina, coinvolti
90 nella trasduzione del segnale, nel traffico di membrana e nel riciclo delle vescicole sinaptiche (Witke, Podtelejnikov, Di Nardo, Sutherland, Gurniak, Dotti and Mann, 1998). La dinamina 1 è una GTPasi neurone-specifica implicata nell’endocitosi delle vescicole tramite l’interazione con effettori molecolari, come descritto nel paragrafo relativo alla amfifisina 1. L’endocitosi e la polimerizzazione dell’actina sono strettamente correlate (Engqvist-Goldstein, Zhang, Carreno, Barroso, Heuser and Drubin ,2004; Yarar, Waterman-Storer and Schmid, 2005), ed è stato proposto che la polimerizzazione dell’actina possa contribuire a stabilizzare la curvatura della membrana durante l’endocitosi. Recenti studi supportano la stretta relazione tra dinamina 1 e il citoscheletro di actina. La dinamina 1 infatti è implicata nei riarrangiamenti di actina (Gomez, Hamann, McCarney, Savoy, Lubking, Heldebrant, Labno, McKean, McNiven, Burkhardt and Billadeau, 2005). Una funzione della profilina 2 è quella di controllare l’attività della dinamina 1 occupando i siti di legame per ligandi contenenti domini SH3, come endofilina e amfifisina. Il PIP2 inoltre è un segnale comune per il rilascio della
profilina 2 non solo dalla G-actina ma anche dalla dinamina 1. Queste evidenze forniscono un possibile modello che si basa sul controllo da parte dei domini di membrana ricchi di PIP2 sui meccanismi alla base
dell’endocitosi e della polimerizzazione dell’actina. La caratteristica della profilina 2 di formare complessi con sinapsina e dinamina la rende quindi un candidato ideale come regolatore del traffico di membrana. Come detto, sia l’interazione profilina actina che quella profilina 2-dinamina 1 sono regolate dal PIP2 (Gareus, Di Nardo, Rybin and Witke,
2006). Dunque la profilina 2 rappresenta un bersaglio comune dei meccanismi di rilascio della dinamina 1 e dell’actina monomerica. Ciò significa che nei siti di produzione del PIP2 la dinamina 1 viene resa
91 disponibile per la formazione di complessi coinvolti nell’endocitosi, e allo stesso tempo si ha un rilascio dell’actina che permette la sua polimerizzazione a livello della membrana (fig. 18). Questo meccanismo potrebbe spiegare perché cambiamenti localizzati di PIP2 sono
strettamente correlati temporalmente e spazialmente all’endocitosi e alla polimerizzazione dell’actina.
Fig.18: Modello dell’interazione della prolina 2 con l’actina e la dinamina 1 (tratto
da Gareus et al., 2005)
Il legame tra la dinamina 1 e la profilina 2 richiede il dominio ricco di prolina (PRD) della profilina (Giesemann, Schwarz, Nawrotzki, Berhorster, Rothkegel, Schluter, Schrader, Schindelin, Mendel, Kirsch and Jockusch, 2003). Sebbene il legame tra le due proteine possa
92 avvenire anche su altri siti, il dominio PRD è quello biologicamente più rilevante, dato che occupa i siti di legame della dinamina1 con quelli di amfifisina, endofilina e Grb2 (Gareus, Di Nardo, Rybin and Witke, 2006). Il legame dell’actina con la profilina 2 inibisce l’interazione profilina 2-dinamina 1, sebbene i rispettivi legami avvengano su distinti domini (Schutt, Myslik, Rozycki, Goonesekere and Lindberg, 1993; Mahoney, Rozwarski, Fedorov, Fedorov and Almo, 1999). Ciò può essere dovuto all’interazione sterica tra la grande molecola della dinamina 1 e quella dell’actina. Mutazioni per la profilina 2 che impediscono il legame con la dinamina 1 ma che permettono il legame con l’actina non hanno effetto sul trasferimento delle vescicole. L’inibizione del trasferimento da parte della profilina 2 dipende dalla presenza di PRD integri. Ciò indica che la maturazione delle vescicole sinaptiche dipende unicamente dall’interazione tra profilina 2 e actina. La profilina 2 si trova comunemente nel sinaptosoma anche a livello della frazione extrasinaptica solubile, associata alla matrice presinaptica. Questa associazione e la sua localizzazione suggeriscono un ruolo di questa proteina sia nel funzionamento presinaptico che in quello postsinaptico (Pilo Boyl, Di Nardo, Mulle, Sassoè-Pognetto, Panzanelli, Mele, Kneussel, Costantini, Perlas, Massimi, Vara, Giustetto and Witke, 2007). Esperimenti su neuroni ippocampali in coltura (Ackermann and Matus, 2003) e su neuroni di amigdala (Lamprecht, Farb, Rodrigues and LeDoux, 2006) hanno inoltre suggerito una funzione postsinaptica della profilina 2 nella stabilizzazione delle spine dendritiche e nella plasticità sinaptica. Studi elettrofisiologici e comportamentali su topi KO per la profilina 2, comunque, non hanno evidenziato una compromissione postsinaptica o una mancanza di plasticità in seguito alla delezione del gene che codifica per questa proteina. Infatti non solo l’LTP e l’LTD
93 (long term depression) misurati nell’ippocampo appaiono indistinguibili fra i topi mutanti e i wild type, ma anche l’apprendimento e la memoria di topi KO sottoposti a fear conditioning appare normale (Pilo Boyl, Di Nardo, Mulle, Sassoè-Pognetto, Panzanelli, Mele, Kneussel, Costantini, Perlas, Massimi, Vara, Giustetto and Witke, 2007). Queste evidenze non escludono comunque un ruolo postsinaptico della profilina 2, ma evidenziano comunque che questa proteina svolge le sue funzioni principalmente a livello presinaptico, controllando il rilascio di vescicole di neurotrasmettitore e l’eccitabilità neuronale. Il ruolo della profilina 2 in meccanismi presinaptici, come il rilascio di neurotrasmettitori, così come in meccanismi postsinaptici è infatti comprovato da diverse osservazioni sperimentali (Dillon and Goda, 2005). La mancanza di profilina 2 porta a un aumento del rilascio di glutammato nei neuroni glutammatergici della neocortex, il che si traduce in un’iperattività dal punto di vista comportamentale. Infatti la profilina 2 ha un effetto inibitorio sul rilascio esocitotico delle vescicole. La sua assenza indebolisce la polimerizzazione dell’actina e porta a un aumento delle mEPSCs (miniature excitatory postsynaptic currents) e delle EPSCs evocate (Pilo Boyl, Di Nardo, Mulle, Sassoè-Pognetto, Panzanelli, Mele, Kneussel, Costantini, Perlas, Massimi, Vara, Giustetto and Witke, 2007) in maniera simile al blocco della polimerizzazione dell’actina tramite somministrazione di latrunculina (Morales, Colicos and Goda, 2000; Shupliakov, Bloom, Gustafsson, Kjaerulff, Low, Tomilin, Pieribone, Greengard and Brodin, 2002).
Dai risultati ottenuti in questa tesi sperimentale è stato osservato un aumento della quantità della proteina profilina 2 nelle regioni medio-temporali del cervello di ratto a 48 ore di distanza dal training del CFC. Dal coinvolgimento di questa proteina nell’inibizione del processo
94 dell’endocitosi tramite il suo legame con la dinamina 1, evidenze di vari studi sperimentali, si può ipotizzare una diminuzione del reuptake del neurotrasmettitore eccitatorio glutammato a livello della regione CA1 dell’ippocampo, con conseguente aumento dell’eccitabilità dei neuroni ippocampali alla base del LTP. L’aumento di questa proteina è in accordo con la diminuzione della amfifisina 1; queste due proteine competono infatti per il lo stesso sito di binding della dinamina. Come detto la Amph1, una volta legata la dinamina, promuove l’endocitosi e quindi il reuptake del glutammato. La profilina 2 sequestra invece la dinamina, dunque impedisce il reuptake di neurotrasmettitore aumentando così l’eccitabilità ippocampale. L’induzione della polimerizzazione di actina in seguito a un aumento della profilina 2, e la conseguente inibizione del rilascio di vescicole sinaptiche, potrebbero sembrare in disaccordo con un aumento dell’eccitabilità ippocampale. Bisogna però considerare che questi meccanismi non sono ancora del tutto conosciuti. Da una parte, la profilina 2 potrebbe essere coinvolta nella maturazione delle vescicole sinaptiche tramite la regolazione dei microfilamenti di actina a livello del terminale sinaptico. Inoltre è comprovato che le strutture citoscheletriche sono implicate nella polarità e nella crescita dei prolungamenti neuronali di nuova sintesi, evento alla base dell’apprendimento e della memoria a lungo termine.
