CAPITOLO 4: RISULTATI

CAPITOLO 4: RISULTATI

I vettori utilizzati per far esprimere il peptide ETrp44m e il gene reporter GFP sono stati realizzati a partire dal clone pFeFv-7 di FFV. La costruzione dei vettori è stata eseguita dal gruppo di ricerca del Prof. Loechelt (German Cancer Researh Center, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany). Le prime modifiche effettuate sono state la sostituzione della regione U3 dell’LTR in 5’ col promotore del CMV e la delezione di una regione dell’LTR in 3’ (da -308 a -725) nel quale è stato inserito poi un corto mcs. Il clone risultante è il pCF-7∆U3 nel quale sono stati poi clonati il peptide e il gene reporter. Entrambi i transgeni sono inseriti in frame col gene bet al quale è stato deleto il codone di stop. È stato scelto questo gene in quanto è fondamentale per l’infettività del virus e abbondantemente espresso dal virus nelle cellule. Fra i transgeni e il gene bet è inserita una sequenza linker che contiene il sito di taglio per una proteasi cellulare per far sì che la forma wild-type venga rilasciata (figura 3.1 nella sezione materiali e metodi). Oltre a questi costrutti replicazione-competente, in quanto non mancanti di alcuna parte necessaria alla formazione di una nuova particella virale infettante sono stati realizzati anche i rispettivi costrutti di tipo SIN: il Bet-FIV44m SIN e il Bet-GFP SIN (figura 3.2 nella sezione materiali e metodi). In questi costrutti la regione U3 dell’LTR in 3’ è stata quasi completamente deleta (da -725 a -18), comprensiva quindi della TATA box e di tutte le regioni necessarie all’attacco dei vari fattori di trascrizione cellulari. In tal modo il virus è reso incapace di replicare. I costrutti Bet-FIV44m, Bet-GFP e i relativi costrutti SIN, oltre al clone wild-type, sono stati trasfettati su CrFK. Il surnatante a quattro giorni dalla trasfezione è stato poi raccolto, chiarificato e utilizzato per infettare nuove cellule precedentemente seminate e non infette. Il surnatante di queste è stato poi utilizzato per l’infezione di altre cellule

e così per successivi passaggi seriali d’infezione. Le cellule trasfettate e infettate sono state di volta in volta staccate e utilizzate per effettuare l’analisi su western blot e quelle trasdotte col costrutto GFP e Bet-GFP SIN anche per l’analisi al FACS.

La prima prova effettuata è stata quella di confrontare, tramite analisi al FACS, l’espressione della GFP del vettore Bet-GFP replicazione-competente rispetto al relativo costrutto Bet-GFP SIN per vedere quale dei due costrutti fosse più efficiente nell’espressione della GFP.

L’analisi al FACS è stata fatta sulle cellule a 2 e 5 giorni dopo la trasfezione e per il primo e secondo passaggio d’infezione (figura 4.1 e 4.2). Mentre l’efficienza di trasfezione dei due costrutti a due giorni dalla trasfezione è simile, già a cinque giorni il costrutto Bet-GFP mostra un’efficienza di espressione della GFP molto maggiore rispetto al SIN, risultato atteso in quanto il vettore essendo replicazione–competente produce particelle virali che infettano nuove cellule aumentando così l’espressione del transgene. Ancora più evidente è la differenza fra i due costrutti tra il primo e secondo passaggio d’infezione, dove l’espressione della GFP del SIN è minima.

La ridotta efficienza di veicolazione del transgene da parte dei costrutti SIN rispetto ai replicazione-competente è stata confermata anche tramite analisi su western blot: a quattro giorni dalla trasfezione l’espressione dei cloni 4 e 8 replicazione-competenti (colonna 1 e 2) risulta simile al clone 13 del SIN (colonna 4) mentre dopo il primo passaggio d’infezione si vede invece che la quantità di peptide espressa dal costrutto SIN (colonna 9 e 10) è minore rispetto al Bet-FIV44m dei due cloni (colonna 7 e 8) a conferma dei risultati ottenuti dall’analisi al FACS per la GFP (figura 4.3).

Per seguire l’efficienza di espressione dei transgeni nel tempo abbiamo propagato serialmente le colture infette da Bet-GFP e analizzato le cellule al FACS a diversi passaggi. È stato notato che l’espressione di GFP tende a diminuire nel tempo: la percentuale di cellule esprimenti GFP va diminuendo dal primo passaggio (85% di cellule positive) al

+2 gg post-trasfezione Bet-GFP Bet-GFP SIN + 5gg post-trasfezione Bet-GFP Bet GFP SIN

Figura 4.1: Espressione di GFP in CrFK trasfettare con Bet-GFP SIN a +2 e +5 giorni. La percentuale di cellule esprimenti GFP è evidenziata dal riquadro rosso.

I passaggio II passaggio Bet-GFP Bet-GFP Bet-GFP SIN Bet-GFP SIN I passaggio II passaggio Bet-GFP Bet-GFP Bet-GFP SIN Bet-GFP SIN

Figura 4.2: Espressione di GFP in CrFK trasdotte con GFP e

Bet-GFP SIN al I e II passaggio d’infezione. La percentuale di cellule esprimenti GFP è evidenziata nel riquadro rosso.

+4gg post-trasfezione

I passaggio

+4gg post-trasfezione

I passaggio

quarto (circa 35%) (figura 4.2 e 4.4). Questo dato può essere indice o del

nfermato anche analizzando l’espressione della

si manifesta anche sui vettori ricombinanti per ETrp44m, abbiamo analizzato tramite western blot l’espressione dell’ETrp44m nei cloni Bet-FIV44m 4 e 8 nel tempo (figura fatto che il virus col tempo perde la propria infettività o che la proteina GFP venga in qualche modo persa. Analizzando al microscopio le cellule infettate al primo e al quarto passaggio si vede che l’effetto citopatico è ugualmente marcato e ciò tende a escludere che il virus perda l’infettività. L’ipotesi che la diminuizione d’espressione di GFP dipenda quindi da una delezione del gene è confermata da un saggio di immunofluorescenza nel quale si vede chiaramente che la fluorescenza della GFP diminuisce all’aumentare del numero di passaggi seriali d’infezione su cellule CrFK. Al contrario l’espressione della Bet, proteina fondamentale per l’infettività è invece costante dal primo all’ultimo passaggio (figura 4.5).

Questo dato è stato co

proteina di fusione Bet-GFP su western blot a quattro giorni dalla trasfezione ed al primo, secondo, terzo e quarto passaggio d’infezione tramite siero α-Bet. I risultati ottenuti mostrano chiaramente una delezione o un riarrangiamento della proteina nel tempo a causa probabilmente delle sue grosse dimensioni. A quattro giorni dalla trasfezione la forma predominante è la proteina di fusione Bet-GFP (seconda colonna) anche se è evidente la proteina Bet wild-type la cui presenza è dovuta al fatto che esiste un sito di taglio per una proteasi cellulare fra il gene bet e la GFP. Al secondo passaggio d’infezione (sesta colonna) la forma wild-type diventa prevalente rispetto a quella di fusione finchè, come si osserva nel terzo e quarto passaggio (decima e undicesima colonna), l’unica forma rimanente è quella della Bet wild-type a dimostrazione che la GFP viene persa o riarrangiata (figura 4.6). Infine la perdita della GFP è stata dimostrata anche tramite analisi diretta sul vettore tramite PCR usando specifici primer e sequenziamento (dati non mostrati).

III passaggio IV passaggio K- et FP B - G

Figura 4.4: Espressione di GFP in CrFK trasdotte con Bet-GFP al terzo e quarto passaggio d’infezione. La percentuale di cellule esprimenti GFP è evidenziata dal riquadro rosso.

GFP

Bet

merge

GFP

Bet

merge

1. passaggio

2. passaggio

3. passaggio

6. passaggio

10. passaggio

1. passaggio

2. passaggio

3. passaggio

6. passaggio

10. passaggio

igura 4.6: Western blot su CrFK con α-Bet e α-rabbit. Bet -IV°passaggio GFP αBet Bet-GFP Bet wt wt Bet-GFP wt Bet -GFP wt Bet -GFP wt Bet -GFP wt M +4gg

post-trasfezione I°passaggio II°passaggio III°passaggio

Bet -IV°passaggio GFP αBet Bet-GFP Bet wt wt Bet-GFP wt Bet -GFP wt Bet -GFP wt Bet -GFP wt M +4gg

post-trasfezione I°passaggio II°passaggio III°passaggio

4.7). Il risultato dimostra che entrambi i cloni 4 e 8 esprimono il peptide

Bet-wt e Bet-ETrp44mer abbiano dimensioni

banda evidenziata su western blot

fatta una valutazione sull’infettività dei costrutti Bet-GFP,

i della titolazione sono riportati nella seguente tabella:

sia a quattro giorni dalla trasfezione (prima e seconda colonna), al primo passaggio (quinta e sesta colonna) e al secondo passaggio (ottava e nona colonna). L’espressione del peptide è ancora evidente al terzo passaggio d’infezione (settima e ottava colonna) (figura 4.8), dato particolarmente interessante poiché confrontando i risultati dei western blot effettuati dopo 4 giorni dalla trasfezione (figura 4.9) con quelli del terzo passaggio d’infezione si può chiaramente vedere che mentre la GFP al terzo passaggio è già completamente riarrangiata rispetto a 4gg dalla trasfezione, il peptide è ancora mantenuto, probabilmente per le sue minori dimensioni.

Nonostante la proteina

molto simili che non consentono una buona separazione su gel di acrilammide le due bande sono distinguibili se si effettua un western blot utilizzando i rispettivi sieri.

Inoltre per dimostrare che la

all’altezza di circa 50KDa è veramente l’espressione di ETrp44m è stato fatto un saggio di competizione nel quale il siero è stato preincubato per un’ora a 37°C con il peptide libero. In questo modo gli anticorpi presenti nel siero che riconoscono il peptide si legano a quest’ultimo e non sono più disponibili per il legame con quello prodotto dalle cellule. Facendo quindi in parallelo un western blot col siero tal quale e uno col siero preincubato col peptide si osserva la sparizione della banda nel western blot eseguito con quest’ultimo siero a dimostrazione che la banda riconosciuta nel western blot è effettivamente la sequenza Etrp44m (figura 4.10).

Infine è stata

Bet-GFP44m clone 4 e 8 andando a titolare le particelle virali infettanti tramite il saggio di infettività descritto nella sezione 3.2.8 in materiali e metodi.

I° pass III° pass V° pass I° pass III° pass V° pass

Bet-GFP

Bet-FIV44m #4

Bet-FIV44m #8

Bet-GFP

Bet-FIV44m #4

Bet-FIV44m #8

I dati mostrano che sia il costrutto Bet-GFP che i cloni con Bet-FIV44m mantengono nel tempo la loro capacità infettiva. Il clone 8 di Bet-FIV44m mostra tuttavia una tendenza all’aumento di infettività che potrebbe preludere alla riacquisizione della forma wild-type nel tempo. Questa ipotesi verrà valutata effettuando l’analisi con western blot e PCR di CrFk trasdotte e propagate serialmente a lungo termine.

I K

Figura 4.7: V44m 50 Da

Western blot su CrFK con siero anti FIV-Pet. Bet-F

1 2 3 4 5 6 7 8 9

+4gg post-trasfezione

_{I° passaggio}

_{II° passaggio}

50 DaIK

1 2 3 4 5 6 7 8 9

+4gg post-trasfezione

_{I° passaggio}

_{II° passaggio}

5 Bet-FIV44m #4 6 Bet-FIV44m #8 7 Bet-GFP 8 Bet-FIV44m #4 9 Bet-FIV44m #8 1 Bet-FIV44m #4 2 Bet-FIV44m #8 3 Bet-GFP 4 Marker 5 Bet-FIV44m #4 6 Bet-FIV44m #8 7 Bet-GFP 8 Bet-FIV44m #4 9 Bet-FIV44m #8 1 Bet-FIV44m #4 2 Bet-FIV44m #8 3 Bet-GFP 4 Marker

III passaggio

+ 4 gg post-trasfezione

Figura 4.9: Western blot su CrFK con siero α-Bet e siero anti FIV-Pet 4 iorni post-trasfezione. 1 FFV wt 2 Bet-GFP 3 FIV44m#4 4 FIV44m#8 5 FFV wt 6 Bet-GFP 7 FIV44m#4 8 FIV44m#8 9 M siero Pet αBet 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 FFV wt 2 Bet-GFP 3 FIV44m#4 4 FIV44m#8 5 FFV wt 6 Bet-GFP 7 FIV44m#4 8 FIV44m#8 9 M siero Pet αBet 1 2 3 4 5 6 7 8 9 siero Pet αBet 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Figura 4.8: Western blot su CrFK con siero α-Bet e siero anti FIV-Pet III passaggio d’infezione.

1 FFV wt 2 Bet-GFP 3 FIV44m#4 4 FIV44m#8 5 Marker 6 FFV wt 7 Bet-GFP 8 FIV44m#4 9 FIV44m#8 10 K-al

αBet siero Pet

αBet siero Pet

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 FFV wt 2 Bet-GFP 3 FIV44m#4 4 FIV44m#8 5 Marker 6 FFV wt 7 Bet-GFP 8 FIV44m#4 9 FIV44m#8 10 K-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 g

Bet-FIV44m 50KDa

siero

_{+ PEPT}

siero

FIV44m #4

4 gg post-trasfezione Bet-FIV44m

50KDa

siero

_{+ PEPT}

_{+ PEPT}

siero

siero

FIV44m #4

4 gg post-trasfezione

Figura 4.10: Saggio di immunocompetizione con siero anti peptide in assenza o previa incubazione con peptide libero (PEPT).