CAPITOLO 4 RISULTATI

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CAPITOLO 4

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Capitolo 4

RISULTATI

All’esame coprodiagnostico, il 20,53% dei campioni esaminati è risultato positivo per la presenza di uova di A. perfoliata (Figura 4.1) per dimensione e morfologia, (a forma di “D”con 65-80 µm di diametro, French e Chapman 1992).

Un solo campione è risultato positivo per le uova di Anoplocephalides (Paranoplocephala) mamillana (Figura 4.2) per dimensione e morfologia (forma ovale da 5 a 37 µm di diametro, French e Chapman 1992) nel primo campionamento di novembre-dicembre 2004.

Lo stesso animale è risultato positivo sia per A. perfoliata che per A. mamillana. La prevalenza di questa ultima specie risulta pertanto essere molto bassa con un solo campione positivo sui 224 campioni analizzati.

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Figura 4.1:Uovo di Anoplocephala perfoliata

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4.1 RISULTATI DELL’ESAME COPRO-DIAGNOSTICO E VALUTAZIONE DELLA PREVALENZA DEI CESTODI NEI TRE DIVERSI ALLEVAMENTI ANALIZZATI

4.1.1 Allevamento 1

Nel periodo considerato, la prevalenza di A .perfoliata in questa tipologia di allevamento è stata del 16, 19 %, con prevalenza maggiore nei mesi di maggio-giugno di entrambi gli anni.

Nel periodo novembre-dicembre di entrambi gli anni non sono stati effettuati trattamenti; inoltre, i cavalli sono cambiati tra i due anni successivi.

I dati relativi al numero di animali controllati, risultati positivi e/o negativi e le prevalenze per ciascun periodo sono riportati in Tabella 4.1 e Figure 4.3 e 4.4.

All’analisi statistica non sono risultate differenze significative né tra i due campionamenti successivi (nov-dic / magg-giugno), né tra lo stesso periodo dei due anni consecutivi.

Tabella 4.1: Risultati dell’analisi coprologica e delle prevalenze per ciascun periodo

Allevamento 1

Totale Positivi Negativi Prevalenza

nov-dic 04 36 4 32 11,11

magg-giugno 05 35 9 24 25,71

nov-dic 05 18 0 18 0,00

magg-giugno 06 16 4 12 25,00

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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 nov-dic 04 magg-giugno 05 nov-dic 05 magg-giugno 06 Totale Positivi Negativi

Figura 4.3: Grafico con i risultati dell’analisi copromicroscopica dei cavalli dell’

Allevamento 1 Prevalenza 0 5 10 15 20 25 30 nov-dic 04 magg-giugno 05 nov-dic 05 magg-giugno 06 Prevalenza

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4.1.2 Allevamento 2

La prevalenza per A. perfoliata in questo tipo di allevamento è stata del 13,63%.

I cavalli non sono stati sottoposti ad alcun trattamento antiparassitario; nel corso del periodo considerato, inoltre, non sono state registrate introduzioni di nuovi cavalli.

All’analisi statistica non sono risultate differenze significative né tra i due campionamenti successivi (nov-dic / magg-giugno), né tra lo stesso periodo dei due anni consecutivi.

Allevamento 2

nov-dic 04 14 2 12 14,29

magg-giugno 05 9 3 6 25,00

nov-dic 05 12 1 11 8,33

magg-giugno 06 9 0 9 0,00

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0 5 10 15 20 25 30 35 40 nov-dic 04 magg-giugno 05 nov-dic 05 magg-giugno 06 Totale Positivi Negativi

Figura 4.5: Grafico con i risultati dell’analisi copromicroscopica dei cavalli dell’Allevamento 2 Prevalenza 0 5 10 15 20 25 30 nov-dic 04 magg-giugno 05 nov-dic 05 magg-giugno 06 Prevalenza

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4.1.3 Allevamento 3

La prevalenza per A. perfoliata in questo tipo di allevamento è stata dell’48,42%. In questo allevamento è stato trovato un soggetto positivo all’esame copromicroscopico per il cestode (Paranoplocephala) mamillana.

I cavalli risultati positivi sono sempre stati sottoposti al trattamento farmacologico dopo ogni campionamento.

I mesi di maggio e giugno presentano una diminuzione della prevalenza rispetto al periodo precedente.

All’analisi statistica sono risultate differenze significative (P<0.05) tra i due campionamenti successivi (nov-dic / magg-giugno) del primo anno di osservazione dell’allevamento; non sono state invece rilevate differenze significative né tra i due campionamenti successivi (nov-dic/magg-giugno) del secondo anno di osservazione, né tra lo stesso periodo dei due anni consecutivi.

Allevamento 3

nov-dic 04 23 12 11 52,17

magg-giugno 05 22 3 17 13,63

nov-dic 05 15 3 11 20,00

magg-giugno 06 15 5 10 33,33

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0 10 20 30 40 50 60 nov-dic 04 magg-giugno 05 nov-dic 05 magg-giugno 06 Totale Positivi Negativi

Figura 4.7: Grafico con i risultati dell’analisi copromicroscopica dei cavalli dell’Allevamento 3 Prevalenza 0 10 20 30 40 50 60 nov-dic 04 magg-giugno 05 nov-dic 05 magg-giugno 06 Prevalenza

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4.2 PREVALENZA

Dall’analisi complessiva dei tre allevamenti analizzati, utilizzando il metodo coprodiagnostico è risultata una prevalenza del 20,53. La prevalenza totale dei periodi di osservazione è risultata piuttosto omogenea risultando intorno al 20% escluso il campionamento di novembre-dicembre 2005. Al contrario, la prevalenza nelle tre tipologie di allevamento è risultata maggiore nell’allevamento tre con differenza significativa (P<0.05) sia verso l’allevamento 1 che l’allevamento 2. Questi ultimi due allevamenti, al contrario, non presentano differenze significative relative alla loro prevalenza sebbene la loro tipologia sia diversa. I dati relativi alle prevalenze dei singoli allevamenti nei vari periodi e la loro prevalenza complessiva sono riportati in Tabella 4.4 e Figura 4.9.

Tabella 4.4: Prevalenza

Periodo Allevamento 1 Allevamento 2 Allevamento 3 Prevalenza totale nov-dic 04 11,11 14,29 52,17 24,66 magg-giugno 05 25,71 25,00 13,64 22,73 nov-dic 05 0,00 8,33 20,00 8,89 magg-giugno 06 25,00 0,00 33,33 22,50 Prevalenza totale 16, 19 13,64 30,67 20,53

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0 10 20 30 40 50 60 nov-dic 04 magg-giugno 05 nov-dic 05 magg-giugno 06 Allevamento 1 Allevamento 2 Allevamento 3

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4.3 RISULTATI DEL TRATTAMENTO FARMACOLOGICO

Per quanto riguarda il trattamento farmacologico, sono stati trattati 41 dei 46 animali risultati positivi per i cestodi Anoplocefalidi. Il controllo dei campioni ha evidenziato la persistenza di negatività dei soggetti entro un mese dalla somministrazione del farmaco all’esame coprologico. Solo 4 campioni/41 sono risultati positivi all’esame coprologico eseguito dopo il trattamento; in questi casi, però, la raccolta del campione dopo il trattamento aveva superato il mese di attesa previsto dallo studio.

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4.4 RISULTATI DELL’ESAME SIEROLOGICO

I risultati dell’esame sierologico ed il confronto con le altre tecniche diagnostiche utilizzate nel presente studio sono riportati in Tabella 4.5. L’esame sierologico conferma la positività dei campioni riportando un titolo anticorpale corrispondente ad un’infestazione alta associata ad un alto rischio di colica, i dati relativi ai cavalli negativi alle altre tecniche e dopo il trattamento risultano alquanto discordanti. Per quanto riguarda il controllo degli animali trattati, dai dati ottenuti sembra che un titolo anticorpale alto persista anche dopo tre mesi dal trattamento nel 50% dei campioni di siero testati. Nessuno dei cavalli inclusi nella ricerca, dei tre diversi allevamenti ha presentato sintomatologia colica durante tutta la durata dello studio.

4.4.1 Risultati esame sierologico Allevamento 1

Cinque dei cavalli positivi all’esame coprologico dell’ Allevamento 1 sono stati sottoposti ad analisi sierologica con test (ELISA). Tutti e cinque i campioni hanno dato un’interpretazione del risultato di densità ottica ad alto rischio di colica (vedi tabella 4.5 i cavalli n° 3, 5, 6, 7, 8).

Quattro cavalli negativi all’esame coprologico dell’ Allevamento 1 sono stati sottoposti ad analisi sierologica con test (ELISA), solo uno di loro ha avuto un’interpretazione della densità ottica con basso rischio di colica, gli altri tre un rischio moderato (vedi tabella 4.5 i cavalli n° 11, 13, 14, 17).

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4.4.2 Risultati esame sierologico Allevamento 2

Uno dei cavalli positivi all’esame coprologico dell’ Allevamento 2 è stato sottoposto ad analisi sierologica con test (ELISA). Il campione ha dato un’interpretazione del risultato di densità ottica ad alto rischio di colica (vedi tabella 4.5 i cavalli n° 4).

Tre cavalli negativi all’esame coprologico dell’ Allevamento 2 sono stati sottoposti ad analisi sierologica con test (ELISA). Tutti e tre i campioni hanno dato un’interpretazione del risultato di densità ottica ad alto rischio di colica (vedi tabella 4.5 i cavalli n° 9, 10,12).

4.4.3 Risultati esame sierologico Allevamento 3

Due dei cavalli positivi all’esame coprologico dell’ Allevamento 3 sono stati sottoposti ad analisi sierologica con test (ELISA). I campioni hanno dato un’interpretazione del risultato di densità ottica ad alto rischio di colica (vedi tabella 4.5 i cavalli n° 1 e 2).

Due cavalli negativi all’esame coprologico dell’ Allevamento 3 sono stati sottoposti ad analisi sierologica con test (ELISA) uno di loro ha avuto un’interpretazione del risultato di densità ottica basso per il rischio associato a colica (vedi tabella 4.5 cavallo n° 15), l’altro un rischio associato a colica moderato(vedi tabella 4.5 cavallo n° 16).

Da questo allevamento inoltre a distanza di tre mesi dopo il trattamento farmacologico è stato analizzato il siero di otto cavalli con test (ELISA) la metà di loro ha presentato un risultato di densità ottica con un ‘interpretazione di rischio associato a colica alto (vedi tabella 4.5 i cavalli n° 26, 27, 28, 31) l’altra metà di tipo moderato (vedi tabella 4.5 i cavalli n° 25, 29, 30, 32).

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4.5 RISULTATI DELLA TECNICA DIAGNOSTICA MOLECOLARE DI NESTED-PCR

I campioni positivi alla nested-PCR hanno tutti amplificato i prodotti nel secondo step di PCR che sono risultati essere delle dimensioni previste vale a dire di ∼250 pb (Drogemuller et al., 2004) cioè della regione appropriata interna alla ITS-2 di A. perfoliata (Figura 4.11) nessuna variazione in termini di dimensioni è apparsa sul gel di agarosio. La nested PCR non ha amplificato nessun prodotto dei 40 campioni di controllo da cavalli infetti con altri parassiti (Traversa et al., 2004) e non ci sono evidenze di inibitori di PCR nei campioni fecali risultati negativi all’esame coprologico.

Tutti i prodotti amplificati ottenuti sono risultati essere la regione specifica ITSs di A. perfoliata con un valore medio di ∼99,5% simile alle rispettive sequenze depositate nel GenBankTM da Drogemuller et al. (2004).

I campioni negativi alla nested-PCR non hanno amplificato nessun prodotto di PCR rilevabile sul gel di agarosio (Figura 4.10).

4.5.1 Risultati nested-PCR Allevamento 1

I 10 campioni fecali di cavalli dell’ Allevamento 1 risultati positivi per A. perfoliata all’esame coprologico, sono risultati positivi anche all’esame della nested-PCR (Figura 4.11 e Tabella 4.5, vedi cavalli n 3, 5, 6, 7, 8 e Tabella 4.5 a dal n 38 al n 42).

Dei 6 campioni fecali di cavalli provenienti dall’Allevamento 1 da cavalli risultati negativi all’esame coprologico, 5 sono risultati negativi alla nested PCR mentre uno è risultato

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all’Allevamento 1).

I 5 campioni fecali di cavalli provenienti dall’Allevamento 1, trattati con l’antielmintico sono risultati negativi sia all’analisi coprologica post-trattamento che alla nested PCR, in quanto non è stato amplificato nessun prodotto di PCR rilevabile sul gel di agarosio, (Figura 4.10 e Tabella 4.5 a vedi cavalli dal n 38 al n 42).

Un campione fecale di un cavallo dell’ Allevamento 2 risultato positivo per A. perfoliata all’esame coprologico è risultato positivo anche all’esame della nested-PCR (Figura 4.11 e Tabella 4.5 vedi cavallo n 4).

I 7 campioni fecali di cavalli provenienti dall’Allevamento 2 da cavalli risultati negativi all’esame coprologico, sono risultati negativi anche alla nested PCR ( Figura 4.10 e Tabella 4.5 vedi cavalli n 9, 10, 12, 18, 21, 22, 23).

Nessun cavallo proveniente da questo allevamento è stato sottoposto al trattamento farmacologico.

I 15 campioni fecali di cavalli dell’ Allevamento 3 risultati positivi per A. perfoliata all’esame coprologico, sono risultati positivi anche all’esame della nested-PCR (Figura 4.11 Tabella 4.5 vedi cavalli n 1, 2 e Tabella 4.5 a dal n 25 al n 37).

I 3 campioni fecali di cavalli provenienti dall’Allevamento 3 da cavalli risultati negativi all’esame coprologico, sono risultati negativi anche alla nested PCR (Figura 4.10 e Tabella

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4.5 vedi cavalli n 15, 16, 20).

I 13 campioni fecali di cavalli provenienti dall’Allevamento 3, trattati con l’antielmintico sono risultati negativi sia all’analisi coprologica post-trattamento che alla nested PCR, in quanto non è stato amplificato nessun prodotto di PCR rilevabile sul gel di agarosio, tutti i risultati sono illustrati nella (Tabella 4.5 a vedi cavalli dal n 25 al n 37).

Figura 4.10: Esempio di gel di agarosio che mostra i prodotti amplificati di nested-PCR da un campione fecale raccolto da un cavallo negativo all’esame coprologico.

M: marker

1-3 controlli positivi (Anoplocephala perfoliata DNA) 2-4 campiome numero 17

5-6 controllo negativo 1,2-5 primo PCR round 3,4,6 secondo PCR round

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Figura 4.11: Esempio di gel di agarosio che mostra i prodotti amplificati dal secondo round di nested-PCR da campioni fecali raccolti da cavalli positivi all’esame coprologico. M: marker

1: campione n 3 2: campione n 7

3: controllo positivo (Anoplocephala perfoliata DNA) 4: controllo negativo

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Tabella 4.5: (N) Cavalli non trattati risultati alle analisi per la diagnosi di A. perfoliata positivi (+) e negativi (-) all’esame coprologico (C), molecolare (PCR) e sierologico (ELISA).

Cavalli non trattati

N C PCR ELISAa OD I 1 3 + + 1.858 High 2 3 + + 2.275 High 3 1 + + 2.443 High 4 2 + + 2.158 High 5 1 + + 2.248 High 6 1 + + 2.082 High 7 1 + + 2.198 High 8 1 + + 2.267 High 9 2 - - 2.482 High 10 2 - - 1.339 High 11 1 - - 0.117 Low 12 2 - - 1.373 High 13 1 - - 0.528 Moderate 14 1 - - 0.254 Moderate 15 3 - - 0.045 Low 16 3 - - 0.398 Moderate 17 1 - + 0.401 Moderate 18 2 - - n.a n.a 19 1 - - n.a n.a 20 3 - - n.a n.a 21 2 - - n.a n.a 22 2 - - n.a n.a 23 2 - - n.a n.a 24 1 - - n.a n.a 1

Allevamento 1, 2 Allevamento 2, 3 Allevamento 3 OD, ELISA: densità ottica;

I: interpretazione dei risultati ELISA; n.a: non analizzato;

a

siero raccolto allo stesso tempo del campionamento feci; b

siero raccolto 12 settimane dopo il trattamento farmacologico; c

campioni fecali raccolti 15 giorni dopo il trattamento farmacologico con associazione di ivermectina 18,7mg/g e praziquantel 140,3 mg/g (Equimax®,VIRBAC).

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Tabella 4.5a: (N) Cavalli trattati risultati alle analisi per la diagnosi di A. perfoliata positivi (+) e negativi (-) all’esame coprologico (C), molecolare (PCR) e sierologico (ELISA).

Cavalli trattati con il farmaco

Pre-trattamento Post-trattamentoc

N C PCR ELISAa, OD C PCR ELISAb,OD I

25 3 + + n.a - - 0.223 Moderate 26 3 + + n.a - - 2.423 High 27 3 + + 2.275 - - 1.084 High 28 3 + + 1.858 - - 0.659 High 29 3 + + n.a - - 0.574 Moderate 30 3 + + n.a - - 0.301 Moderate 31 3 + + n.a - - 0.600 High 32 3 + + n.a - - 0.302 Moderate

33 3 + + n.a - - n.a n.a

34 3 + + n.a - - n.a n.a

35 3 + + n.a - - n.a n.a

36 3 + + n.a - - n.a n.a

37 3 + + n.a - - n.a n.a

38 1 + + n.a - - n.a n.a

39 1 + + n.a - - n.a n.a

40 1 + + n.a - - n.a n.a

41 1 + + n.a - - n.a n.a

42 1 + + n.a - - n.a n.a

1

Allevamento 1, 2 Allevamento 2, 3 Allevamento 3 OD, ELISA: densità ottica;

I: interpretazione dei risultati ELISA; n.a: non analizzato;

a

siero raccolto allo stesso tempo del campionamento feci; b

siero raccolto 12 settimane dopo il trattamento farmacologico;

c campioni fecali raccolti 15 giorni dopo il trattamento farmacologico con associazione di ivermectina 18,7mg/g e praziquantel 140,3 mg/g (Equimax®,VIRBAC).