CAPITOLO 3: RISULTATI
3.1 STUDIO DEL MODULO ELASTICO DELLE STRUTTURE DEI
POLIMERI SINTETICI E NATURALI.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato la realizzazione di matrici di origine sintetica e/o naturale come scaffold per l’ingegnerizzazione del muscolo. Per tale motivo una delle fasi fondamentali è stata la caratterizzazione del loro modulo elastico. Le proprietà meccaniche dei provini realizzati naturale, sono state svolte tramite prove di stress-strain in compressione o in trazione per mezzo dello strumento Zwick / Roell mod. Z005 (Fig. 1A). I dati ricavati vengono espressi tramite una curva stress su strain (Fig. 1B) dalla quale è stato valutato il primo tratto lineare, che fornisce il valore del modulo elastico del provino. Esso viene calcolato dal rapporto tra la deformazione e stress E=σ/Ɛ, dove Ɛ rappresenta il rapporto tra il tratto deformato ed la lunghezza iniziale e σ è dato dal rapporto tra il diametro del provino e la forza applicata.
Per primi sono stati realizzati i polimeri di natura sintetica sotto forma di film (Fig. 2A) a base di PCL 20%, PLLA10%, PLGA 20% ed un blend PCL 20%-PLLA 10% e questi sono stati caratterizzati per mezzo di prove di trazione. L’analisi ha mostrato che il valore di modulo elastico di questi materiali è dell’ordine nel MegaPa, e in particolare PLGA 42,3 MegaPa, PCL 38 MegaPa, blend 34,7 MegaPa e PLLA 23,46 MegaPa. Oltre ai materiali sintetici, in questo lavoro di tesi, sono stati realizzati polimeri naturali a base di gelatina in diverse concentrazioni cross-linkata con genepina al livello intramolecolare. La reazione avviene per via del legame formatosi tra il composto eterociclico della genepina e i residui amminici primari della gelatina (Fig. 3A). Una volta avvenuta la reazione tra le due sostanze, la preparazione è stata colata nei pozzetti di una multiwell e lasciata a temperatura ambiente per 48 ore.
Alla fine di questo tempo, la soluzione assume un colore blu-scuro, segno che la polimerizzazione è completata. Le preparazioni in qui la reticolazione è avvenuta in presenza del collagene, assumono un colore blu più chiaro (Fig. 3B).
I dati ottenuti, hanno mostrato che all’aumentare della concentrazione di gelatina e mantenendo fissa la concentrazione di cross-linkante, aumenta il valore del modulo elastico. Modulando la concentrazione di gelatina è possibile ottenere materiali con modulo elastico da circa 3KPa, come nel caso di soluzioni allo 2 e 2,5% di gelatina, fino ad 80 KPa, ottenute con concentrazioni di gelatina del 10%. Inoltre, non sembra esserci differenza significativa tra l’utilizzo della genipina allo 0,1% e allo 0,2% per basse concentrazioni di gelatina. Al contrario questa differenza diventa significativa allo 7,5 e 10% di gelatina. Interessantemente la gelatina 3%-genepina 0,2% è caratterizzata da un modulo di Young di 8,7 e gelatina 4%-genepina 0,2% da un modulo di Young di 14,4. Le proprietà meccaniche di queste due preparazioni sono simili al modulo di Young misurato su un muscolo scheletrico sano, ovvero 12 kPa (Fig. 3C).
3.2 ANALISI DELL’ANDAMENTO DELLA CRESCITA CELLULARE SU
POLIMERI SINTETICI ATTRAVERSO ALAMAR BLUE TEST.
Allo scopo di valutare l’attività metabolica delle cellule sugli scaffolds polimerici (Fig. 4A), la proliferazione cellulare è stata valutata attraverso il saggio Alamar blue con una coltura cellulare di cellule murine muscolari C2C12 (§2.5.1) per una durata totale di 7 giorni. L’assorbanza valutata a 560 nm è stata misurata a 1, 2, 3 e 7 giorni dalla semina. I risultati del saggio fluorimetrico sono mostrati nella Fig. 4B e confermano la biocompatibilità di tutti i materiali. Nel tempo, le cellule cresciute su scaffolds mostrato attività metabolica notevolmente inferiore rispetto
al controllo. Nel primo giorno si è notato una migliore crescita su PLGA e blend rispetto agli altri polimeri. Tale differenza si perde a due giorni, dove non c’è più differenza significativa tra le strutture. A 3 giorni e a 7 giorni, il blend risulta essere il biopolimero con maggiore biocompatibilità rispetto agli altri.
3.3 ANDAMENTO DELLA CRESCITA CELLULARE SU POLIMERI DI
ORIGINE NATURALE.
3.3.1 Analisi della proliferazione cellulare fatta con il saggio
Alamar blue.
Oltre agli scaffolds realizzati con i vari polimeri sintetici indagati, in questo lavoro di tesi sono stati preparati anche impalcature con polimeri di origine naturale. Dopo averli caratterizzati dal punto di vista del modulo elastico, siamo andati a valutare l’adesione cellulare su questi scaffolds. In questo modo si è cercato di valutare la preparazione migliore per la crescita cellulare, tenendo sempre presente anche i valori della stiffness.
Dopo aver eseguito la preparazione dei vetrini, gli scaffolds sono stati seminati con le cellule C2C12. Come per i polimeri sintetici, l’assorbanza è stata valutata a 560 nm e misurata a 1, 2, 3 e 7 giorni dalla semina. Sono state effettuate 2 letture, a 30 minuti ed a 150 minuti, e di seguito calcolata la slope.
In Fig. 5 viene mostrato il grafico ottenuto dall’elaborazione dei risultati. Dall’analisi del grafico si è visto che le cellule crescono su tutti i vetrini in maniera molto analoga al vetrino di controllo tranne a 2 e 3 giorni, dove il controllo ha un valore maggiore. Tuttavia, tra tutte le preparazioni, quelle con la stiffness 8,7 kPa specifica della 3% gelatina- 0,2% genepina e 14,4 specifica della 4% gelatina – 0,2% genepina si avvicinano più di tutte al valore visto per il controllo a 1, 2 e 7 giorni. Tuttavia, dagli esperimenti fatti e dai risultati, non c’è una differenza significativa tra
il substrato preparato con gelatina 4%- genepina 0,2% e gelatina 5%- genepina 0,2% nei primi 3 giorni. L’analisi effettuata a 7 giorni ha però evidenziato una crescita migliore sulla preparazione con gelatina 4%- genepina 0,2%.
È da notare il fatto che anche lo scaffold preparato con il collagene ha permesso una buona crescita cellulare, simile alle due preparazioni sopranominate.
3.3.2 Analisi della crescita cellulare con la microscopia a
fluorescenza.
Anche nel caso dei polimeri di origine naturale, l’analisi della crescita cellulare ottenuta tramite il saggio Alamar blue è stata confermata tramite la conta delle cellule presenti per unità di superficie (mm2 ) (fig. 6A e B).
Il grafico mostra che non ci sono differenze nel numero di nuclei per area nelle diverse strutture in tutti i tempi analizzati, però il numero di cellule è sempre significativamente inferiore rispetto al controllo. Si è inoltre osservato a 2 giorni un basso numero di cellule sulla preparazione con modulo di 55 kPa.
3.4 ANALISI DEI MIOBLASTI IN VITRO SULLE STRUTTURE
ALLINEATE.
3.4.1 Preparazione delle strutture allineate.
Al fine di riprodurre la struttura altamente organizzata del muscolo scheletrico in vitro, è necessario realizzare pattern che inducano l’allineamento delle cellule muscolari. Per realizzare queste strutture si è partito dalla fabbricazione dello stampo di PMDS (Fig. 7A) con struttura desiderata, sul quale è stata successivamente colata la soluzione del polimero naturale. La soluzione è stata poi
fatta polimerizzare, staccata e analizzata. Lo stampo di silicone è stato realizzato in modo tale da le strisce parallele di 50, 100, 200 micron di larghezza o in gradiente da 50-100-200 micron. Il canale che separa le strisce è stato fatto di 100 micron, mentre l’altezza misurava 40 micron (Fig. 7 B). In fig. 7 C sono riportate alcune immagini delle strutture allineate di gelatina-genepina acquisite al microscopio ottico. Esse mostrano come il pattern sia ben definito e conservato.
3.4.2 Colture di cellule C212 su scaffolds con pattern desiderato.
L’allineamento delle cellule svolge un ruolo chiave nella tecnica del tessuto muscolare scheletrico perché il tessuto muscolare scheletrico in vivo ha una struttura altamente organizzata costituita da lunghi miotubi multinucleati paralleli formati attraverso la differenziazione e la fusione dei mioblasti. Nel presente studio, dopo aver realizzato le strutture di gelatina-genepina allineate, ci siamo concentrati sull’effetto di tale pattern sull’orientamento dei nuclei e sull’analisi preliminare dell'allineamento delle cellule muscolari scheletriche. In questa fase preliminare ci siamo concentrati sull’utilizzo di campioni a base di gelatina 3%- genepina 0,2%.
3.4.3 Analisi visiva del grado di allineamento su strutture
allineate
L'orientamento cellulare è rimasto casuale nelle strutturata non allineate mentre, per quanto riguarda le strutture allineate si è vista una diversa organizzazione (Fig. 8). Dalla disposizione dell’actina, osserviamo che le cellule si allineano all’interno delle strutture nella direzione voluta. Tuttavia sembrano più organizzate sulla striscia di larghezza 100 µm.
3.4.4 Analisi del grado dell’orientamento dei nuclei delle cellule
sulle strutture allineate e non allineate.
Per prima cosa abbiamo osservato com’e’ la distribuzione delle cellule dopo la semina, per capire se ci fosse una diversa distribuzione delle cellule nel canale o nella struttura a diversa dimensione (Fig. 9). Per fare questo, abbiamo marcato i nuclei sempre con l’Hoechst e contato il numero dei nuclei presenti sulla struttura superiore e normalizzati rispetto al canale di dimensioni 100 µm. Dall’analisi dei dati è risultato che la semina delle cellule è avvenuta in maniera omogenea, senza apparente preferenza di crescita sulla porzione superiore o inferiore. Infatti, il numero di cellule presenti su canale e struttura della stessa dimensione è uguale; al contrario le cellule crescono maggiormente sulla struttura di larghezza 200 µm, ma tale valore è quasi doppio rispetto a quello della struttura di 100µm, indicando una proporzionalità con lo spazio a disposizione. Le differenze sono significative sia tra strutture 200 µm- 50 µm, sia tra struttura 200 µm- canale.
Negli scaffolds caratterizzati dal pattern i mioblasti hanno la capacita di auto-organizzarsi, quindi di allinearsi e di allungarsi, ragione per la quale abbiamo proceduto con l’analisi del grado di allineamento delle cellule e l’indice di forma del nucleo marcato con l’Hoechst. Gli angoli di allineamento nucleari, definiti come l'orientamento dell'asse maggiore ellittica di singoli nuclei rispetto all'asse di orientamento del pattern, sono stati misurati utilizzando funzioni del software ImageJ. Tutti gli angoli di allineamento nucleari sono stati poi normalizzati al rispettivo orientamento nucleare preferito definito come l'orientamento medio di tutti i nuclei per campione. Per l'analisi, gli angoli di allineamento sono stati riportati per incrementi di 10°, dallo 0 ai 90°. Tutte le cellule con un grado di allineamento entro 10° sono state ritenute allineate.
Per le cellule coltivate sul substrato “flat” non patternato, dopo 5 giorni in mezzo di differenziazione, l'orientamento cellulare si è visto essere distribuito in
maniera casuale, con una percentuale di cellule distribuite omogeneamente da 0° a 90°. In particolar modo la percentuale di cellule considerate allineate è pari al 20% (Fig. 10). In netto contrasto, l'orientamento cellulare su strutture allineate è preferenzialmente limitato entro 20 ° rispetto alla direzione dei canali, con una percentuale di nuclei allineati pari al 50% circa in tutti i casi considerati. Tale aumento è significativo rispetto al controllo in tutte le condizioni. Il valore più alto di orientamento sotto i 10° è dato dalla struttura di larghezza 50 µm. Sebbene tale allineamento sia significativo rispetto alla struttura con 200 µm di spessore, non sembrano essere differenze significative nell’allineamento tra 50 e 100 µm e tra 100 e 200 µm.
Ulteriormente, è stato valutato l'indice di forma (ellicità= 2c/2a, dove a2=b2+c2, e dove 2b è l’asse minore e 2c l’asse maggiore del nucleo) di ogni singolo nucleo cellulare per determinare come il pattern sia in grado di influenzare l’allungamento nucleare. Per ottenere i risultati abbiamo utilizzato funzioni del software ImageJ, tenendo presente che un indice di forma 1 rappresentava un ellisse. I dati ottenuti mostrano come su tutte le strutture allineate i nuclei siano significativamente più allungati rispetto al controllo (Fig. 11). In particolar modo il miglior allungamento si ha apparentemente sulla struttura di larghezza 100 µm, tuttavia le differenze in allungamento tra le varie strutture non sono significativi tra loro.
