Nuovi aspetti dell’efficacia recettoriale
Il modello di attivazione classica dei 7TMRs prevede che il legame dell’agonista a livello recettoriale porti ad un’attivazione delle proteine G trimeriche associate e si instaurino processi a cascata per l’attivazione della trasduzione del segnale. L’attivazione recettoriale quindi esita con il legame di β-arrestina che provoca desensibilizzazione ed internalizzazione recettoriale. Questo modello classico si è dimostrato troppo semplificato ed incompleto; non descrive alcuni aspetti che sono stati recentemente messi in evidenza, in particolare per quanto riguarda il ruolo di β-arrestina. Alla luce di queste evidenze è stato introdotto il concetto di “biased agonism” o “selettività funzionale” per definire la proprietà del complesso ligando-recettore che si estrinseca attraverso attivazione più o meno selettiva e preferenziale di pathways intracellulari, associati ad un determinato recettore.
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I 7TMRs sono proteine allosteriche che trasmettono il segnale in relazione a cambiamenti a livello della conformazione terziaria, in seguito al legame con l’agonista. Il recettore esiste in due stati “attivo” ed “inattivo”. Il recettore in stato inattivo non induce alcuna risposta cellulare, mentre il recettore in stato attivo stimola la risposta cellulare. Per descrivere il legame tra il ligando ed il recettore nello stato attivo sono stati proposti modelli di “induzione conformazionale” e “selezione conformazionale”. Il meccanismo di selezione fornisce una descrizione migliore del processo di stabilizzazione del recettore nello stato attivo da parte dell’agonista che sembra legarlo preferenzialmente. L’efficacia è quindi l’espressione dell’affinità dell’agonista per i due stati recettoriali che si trovano in equilibrio in relazione alla costante allosterica del recettore. La tendenza alla stabilizzazione preferenziale dello stato attivo da parte del ligando porta ad un effetto di agonismo, viceversa la stabilizzazione dello stato inattivo esiterà in agonismo inverso. Questo modello è una semplificazione che cercheremo di ampliare progressivamente [195].
Fig. 1.11 Rappresentazione dell’equilibrio allosterico tra lo stato recettoriale attivo ed inattivo controllato dalla costante allosterica L.
La stabilizzazione da parte del ligando dello stato attivo e la formazione del complesso ligando-recettore è il presupposto per lo sviluppo della risposta cellulare. E’ quindi possibile considerare il ligando come un modulatore allosterico del recettore. Il legame del modulatore altera l’affinità di legame delle proteine G (guests) associate al recettore. Questo meccanismo è descritto da un modello più complesso definito “extended ternary complex” (ETC) [195].
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Fig. 1.12 L’extended ternary complex (ETC) descrive l’estensione della rappresentazione
dell’equilibrio recettoriale; questo modello multi-state introduce il concetto dell’influenza della modulazione allosterica indotta dal ligando (γ) nel rapporto tra il recettore e le proteine G.
Da questo si evince che diversi ligandi sono in grado di modulare la conformazione allosterica recettoriale ed il rapporto con i guests in modo del tutto peculiare. Il signaling non solo dipende dalla variabile α, anche dalla variabile γ. Questa rappresenta l’affinità di legame tra la proteina G ed il recettore, il quale risente naturalmente dei cambiamenti allosterici impartiti dal legame con il ligando. L’agonismo è quindi definibile come un vettore allosterico diretto attraverso il citosol dove il ligando svolge il ruolo di modulatore e le proteine G sono i “guests”; gli effetti di un modulatore possono essere molto diversi per diversi guests recettoriali. I recettori possono formare numerosi stati attivi (proprio in relazione alla loro capacità di interagire con diversi guests) ed esiste l’evidenza che gli stati attivi del recettore associato al ligando sono differenti dallo stato attivo che si forma in maniera costitutiva. Diversi ligandi sono in grado di indurre differenti conformazioni recettoriali; il recettore può essere visto come un sistema dinamico di conformazioni intercambiabili con diversa probabilità di realizzazione [195]. In termini di efficacia di agonismo e signaling cellulare, l’alterazione del complesso recettoriale è compatibile con il concetto che diversi agonisti producono unici pattern di signaling entro la capacità di stabilizzare un set di conformazioni recettoriali che saranno presentati nel citosol per interagire con le proteine del signaling. Il biased agonism quindi può essere definito come la capacità di un agonista di attivare preferenzialmente determinati pathways cellulari piuttosto che altri in relazione al contesto cellulare in cui si sta verificando lo stimolo; il bias è quindi associato al ligando, ma anche al sistema in cui si verifica lo stimolo. Il fatto che certi agonisti possono stabilizzare differenti stati attivi associati in maniera pleiotropica, fa venir meno il concetto di relazione lineare e monotonica del legame recettore-ligando e risposta tissutale [195].
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Fig. 1.13 Distribuzione secondo frequenza probabilistica di differenti conformazioni recettoriali, in
assenza ed in presenza di differenti ligandi.
L’efficacia acquisisce una natura pluridimensionale; l’interazione del ligando con il recettore provoca cambiamenti conformazionali del recettore stesso che attiva preferenzialmente determinati pathways intracellulari. Questo aspetto è fondamentale nella comprensione del ruolo specifico di alcune vie del signaling implicate nella patogenesi delle malattie e delinea gli orizzonti per la costruzione di farmaci estremamente selettivi.
Le funzioni di β-arrestina
Uno tra i più importanti pathways, associato al concetto di biased agonism è quello mediato dalla proteina β-arrestina. β-arrestina è una proteina esistente in quattro isoforme; β-arrestina 1 e 4 sono espresse unicamente a livello della retina, mentre β-arrestina 2 e 3 sono espresse in maniera ubiquitaria (ci riferiamo rispettivamente ad esse per comodità, definendole β-arrestina 1 e 2). L’attività di β-arrestina, secondo le teorie classiche è stata per anni associata ai fenomeni di desensibilizzazione recettoriale, richiamo di enzimi per la degradazione dei secondi messaggeri ed internalizzazione recettoriale. Secondo studi più recenti riguardo l’attivazione dei 7TMRs, β-arrestina svolge, oltre alle funzioni di regolazione inibitoria, un attivo ruolo nel signaling cellulare.
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Fig. 1.14 Le due immagini rappresentano in maniera grafica ed analitica il concetto di segnale di
attivazione bilanciato contrapposto ad un’attivazione “biased”, ovvero indirizzata preferenzialmente verso un pathway di signaling piuttosto che un altro.
E’ stato dimostrato il ruolo di β-arrestina per quanto riguarda: la regolazione dell’attività di alcune famiglie di kinasi (MAPKs, SRC, PI3K e AKT); la regolazione della trascrizione a livello di NF-kB, dell’istone deacetilasi e del sistema della beta-catenina; la chemiotassi; il signalling pro/anti-apoptotico; la transattivazione di EGFR e la sintesi proteica. Le β-arrestine agiscono come proteine adattatrici multifunzionali con funzione di impalcatura di un gruppo eterogeneo di proteine e modulano l’attività a valle di un certo numero di segnali del network [194]. Il primo esempio di signalling β-arrestina dipendente messo in evidenza è stato il reclutamento da parte di β-arrestina 1 di SRC attivato per la cascata di attivazione delle chinasi regolate dai segnali extracellulari (ERK). L’attivazione di ERK mediata da β-arrestina, sembra comportare risposte a livello biochimico differenti rispetto all’attivazione mediata da parte delle proteine G. ERK fosforilato via β-arrestina è ritenuto in vescicole endocitiche; il picco di fosforilazione è
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tardivo e prolungato, raggiunge il 100% in 30 minuti ed inoltre non mostra localizzazione nucleare, caratteristica tipica dell’attivazione di ERK mediata dalle proteine G. Un altro esempio da menzionare riguarda AKT, un target a valle di PI3K, la cui attività può essere up- e down-regolata da meccanismi β-arrestina dipendenti. Sono stati anche in questo caso identificati meccanismi di attivazione dipendenti sia da β-arrestina che da parte delle proteine G. Le β-arrestine sostanzialmente regolano il signalling attraverso molte altre famiglie di chinasi; un’analisi proteomica delle β-arrestine ha permesso di individuare una vasta gamma di famiglie di chinasi che interagiscono o con β-arrestina 1 o con β- arrestina 2 [194]. Questi due esempi sono utili a sottolineare l’importanza del biased agonism e della possibilità di individuare GPCR signaling pathways β- arrestina dipendenti e proteina G indipendenti: questo è un presupposto sia per quanto riguarda la comprensione delle basi fisiopatologiche di alcune patologie, sia per quanto riguarda la possibilità di intraprendere strategie terapeutiche più mirate.