Western blotting e misurazione di pERK(1,2)/ERK(1,2) e pAKT/AKT

La tecnica del western blotting è metodo utile per la quantificazione della fosforilazione di ERK ed AKT in quanto permette la separazione delle proteine presenti nel campione in base alla carica ed al peso molecolare. Le cellule con confluenza di 70-80% sono state trattate con tripsina e centrifugate nel medium; la vitalità cellulare è stata controllata con Trypan Blue 0,4% e dopo la conta cellulare, le cellule sono state piastrate 100.000 per pozzetto in piastre da 12 pozzetti. Il giorno precedente all’esperimento è stata effettuata la starvation overnight, ovvero una deprivazione di siero per sostituzione di medium completo con medium privo di siero ed antibiotici, in maniera tale da ridurre la fosforilazione basale di ERK ed AKT. Sono stati utilizzati tempi di incubazione differenti per i diversi composti. Sono stati rispettati 10’ di incubazione per Clozapina, Olanzapina, Quetiapina, Risperidone, Aripiprazolo, Clorpromazina, Aloperidolo, Sulpiride e per gli attivatori di ERK1/2 ed AKT, PMA ed hEGF; 30’ di incubazione per i vari antagonisti tra cui Ketanserina, M100907, Scopolamina, ICI-118,551, WAY-100,135 e Marimastat (inibitore delle MMP); 1 ora di incubazione per l’inibitore selettivo dell’EGFR e tirfostina AG1478; 1 ora e 2 ore di incubazione rispettivamente per l’inibitore selettivo non competitivo di MEK PD184302 e l’inibitore altamente specifico e potente di PDK1 GSK2334470. Gli inibitori e gli antagonisti sono stati tutti pre-incubati per 30’ minuti prima del trattamento con clozapina, incubata per 10’. Per quanto riguarda il time-course di

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clozapina che induce fosforilazione di ERK1/2 alla concentrazione di 10 micromolare, è stato condotto a diversi intervalli di tempo (1’, 5’, 10’, 30’). Dopo l’incubazione a 37° C con CO2 a 5%, è stato aspirato il medium ed è stato aggiunto nei pozzetti 130 microlitri di Lisi buffer (tampone di Lisi), composto da una soluzione di RIPA buffer (Tris.HCl pH 8.0, NaCl, EDTA, Triton e SDS) a cui è stato aggiunto un cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi, per bloccare la fosforilazione di ERK. Quindi è stato fatto lo screpaggio e le cellule sono state raccolte in eppendorf. I campioni sono stati centrifugati a 13.000 rpm per 10’ a 4° C ed è stato prelevato il sovranatante. Il contenuto proteico del sovranatante in parte è stato utilizzato per effettuare il dosaggio con il Bradford protein assay, in parte è stato quantificato attraverso lo spettrofotometro. Per stimare la concentrazione proteica i campioni sono stati sottoposti ad una retta di taratura, utilizzando concentrazioni note e crescenti di siero di Albumina Bovina (BSA) sciolto in acqua distillata; quindi è stata misurata l’assorbanza (595 nm). Il metodo Bradford (Sigma-Aldirch, Italia) è basato sul legame tra le proteine ed il colorante Coomassie Brilliant Blue G250 che determina uno spostamento del picco di assorbimento del colorante da 465 nm (range del blu) a 595 nm (range del rosso) in soluzioni acide; il colorante lega alcuni residui aminoacidici presenti sulle proteine. Per ogni esperimento sono state utilizzati 25 microgrammi di proteine, per determinare ERK ed ERK-p. I campioni prima di essere caricati sul gel, vengono trattati con SDS (sodio dodecil-solfato), un detergente anionico che rompe le interazioni idrofobiche denaturando la proteina; inoltre la carica negativa di SDS maschera la carica proteica. Quindi vengono denaturati con tampone Laemmli, a temperatura 95-100° C per 5’ a completamento del processo di denaturazione. Il tampone conferisce al campione un elevato peso molecolare ed una colorazione blu intensa (bromofenolo), tale da agevolare le operazione di caricamento su gel elettroforetico. La corsa elettroforetica è stata realizzata su gel di poliacrilamide, caratterizzati dalla presenza di due parti; una regione superiore, detta gel di caricamento o stacking gel (Tris-HCl pH 6.8), contenente acrilamide al 10% in cui vengono costruiti i pozzetti per il caricamento del campione; una regione inferiore, detta gel di corsa o running gel (Tris-HCl pH 8.8), contenente acrilamide al 12% in cui avviene la separazione delle proteine. Il Gel di corsa è stato preparato con una soluzione composta da H2O distillata, Acrilamide 30% bis, Tris-HCl pH 8.8, SDS 10%, APS 10% (ammonio persolfato) e Temed. I vetrini contenenti il gel polimerizzato sono stati trasferiti nella

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vaschetta per l’elettroforesi contenente un tampone di corsa elettroforetica, il running buffer, composto da Tris-base, Glicina, SDS 1% ed H2O distillata. E’ stata fatta passare una corrente a 200V per un’ora, a temperatura ambiente; il fronte ha raggiunto il fondo del gel e si è completata la corsa elettroforetica. In ogni pozzetto sono stati caricati 25 microgrammi di proteine di ciascun campione, tranne nel primo dove è stato caricato il marker avente peso molecolare noto. Il processo di elettroforesi prevede che le proteine denaturate e cariche negativamente migrino verso il polo positivo separandosi in base al rispettivo peso molecolare, quando vengono sottoposte ad un campo elettrico. Una volta terminata la corsa le proteine sono trasferite dal gel ad una membrana di PVDF (polivinildenfluoruro) a 4° C per 1 ora a 100V. Il sandwich viene inserito in una vaschetta per elettroforesi contenente transfer buffer (Tris-base, Glicina ed H2O distillata). La membrana viene trattata preventivamente per evitare il legame dell’anticorpo primario; viene messa in una soluzione di bloccaggio composta da latte magro in polvere 5% diluito in TBS-Tween per 1 ora in agitatore a temperatura ambiente. Quindi la membrana subisce tre lavaggi da 10’ circa con TBS-Tween in agitazione. A questo punto si può procedere con l’incubazione overnight a 4° C in agitazione della membrana con gli anticorpi primari AbI mouse anti-ERK-p M9692 (diluizione di 1:2000 in TBS-Tween con BSA 5%) ed AbI rabbit anti-AKT-p P3862 (diluizione 1:1000 in TBS-Tween con BSA 5%); questo è il primo passaggio per la determinazione dell’attività di fosforilazione di ERK1/2 ed AKT. L’anticorpo primario può quindi riconoscere la proteina di interesse e non lega le altre proteine immobilizzate in membrana. Il giorno seguente si procede quindi con tre lavaggi con TBS-Tween da circa 10’ in agitazione e si procede ad incubare per 1 ora a temperatura ambiente in agitazione, la membrana con i rispettivi anticorpi secondari; AbII anti-mouse HRP coniugato A4416 (diluizione di 1:2000 in TBS-Tween con BSA 5%)per l’anticorpo primario associato ad ERK-p; AbII anti-rabbit HRP coniugato con SAB3700852 (diluizione 1:2000 in TBS-Tween con BSA 5%) per l’anticorpo primario associato ad AKT-p. Anche in questo caso il legame dell’anticorpo secondario è specifico per l’anticorpo primario ed è coniugato ad una perossidasi che sarà utile alla reazione di chemoluminescenza, per la produzione di luminolo. A questo punto la membrana è stata lavata tre volte per 10’ circa con TBS-Tween in agitazione per rimuovere l’anticorpo non legato. Quindi la membrana viene incubata con la soluzione Luminata Forte Western HRP Substrate (millipore, Italia) all’interno di

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un vano oscuro per 3’ in agitazione a temperatura ambiente, prima di procedere allo sviluppo su Kodak Image Station 440 CF. Per quanto riguarda la determinazione della proteina ERK-totale ed AKT-totale, la membrana è stata immersa in metanolo per 5’ e poi nella soluzione stripping, costituita da glicina, H2O, Tween, HCl a pH 2. Quindi la membrana è stata sottoposta a lavaggi con TBS-Tween ed è stata immersa nella soluzione di bloccaggio composta da latte magro in polvere 5% diluito in TBS-Tween per 1 h in agitatore a temperatura ambiente. Quindi le membrane sono state incubate overnight, in agitazione a 4° C, con l’anticorpo primario; AbI rabbit anti-ERK totale M5670 (diluizione 1:40000 in TBS-Tween con BSA 5%) e d AbI mouse anti-AKT totale WH0000207M3 (diluizione 1:800 in TBS-Tween con BSA 5%). Il giorno successivo la membrana è stata esposta, per 1 h in agitazione a temperatura ambiente, all’anticorpo secondario; AbII anti-rabbit HRP coniugato SAB3700852 (diluizione 1:2000 in TBS-Tween con BSA 5%) ed AbII anti-mouse HRP coniugato A4416 (diluizione 1.20000 in TBS-Tween con BSA 5%). La membrana è stata quindi immersa in una soluzione di sviluppo per 3’ e successivamente sviluppa su Kodak Image Station 440 FC. E’ stato utile comparare le ERK totali con le ERK fosforilate ottenute dallo sviluppo precedente; in particolare la determinazione della fosforilazione di ERK è stata ottenuta dividendo l’intensità della banda di ERK-p sulla banda di ERK-totale. Questo rapporto permette una normalizzazione che consente di eliminare gli artefatti conseguenti ad un differente caricamento di proteina per esperimento. La quantificazione delle proteine ERK1/2 ed AKT è stata effettuata utilizzando il software di analisi di immagini Kodak 1D.