D Caratterizzazione del ruolo dei recettori serotoninergici: 5-HT 1A e 5-

HT2A

Clozapina si comporta come un agonista parziale nei confronti del sottotipo recettoriale 5-HT1A e come antagonista su i recettori della famiglia 5-HT2, in particolare 5-HT2A e 5-HT2C [9]. Il sistema serotoninergico svolge un ruolo nella modulazione del rilascio di dopamina a livello del tratto mesocorticale, nigrostriatale e mesolimbico. Infatti Clozapina ha un ruolo nel miglioramento della sintomatologia della schizofrenia dovuta all’aumento del rilascio di dopamina a livello corticale attraverso il sistema serotoninergico. Inoltre l’agonismo parziale sul recettore 5-HT1A è implicato nella fosforilazione di ERK1/2 a livello corticale,

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con incremento della sinaptogenesi neuronale, indotta da Clozapina [205]. Per valutare il ruolo dei recettori serotoninergici nel nostro studio abbiamo utilizzato un antagonista selettivo 5-HT1A (WAY-100,165) e due antagonisti 5-HT2A, Ketanserina e M100907, quest’ultimo ancora più selettivo. La fosforilazione di ERK1/2 è stata valutata in due linee cellulari, HeLa e C6, che esprimono entrambe 5-HT2A sulla membrana. Infine abbiamo valutato le differenze tra i parametri della potenza ed efficacia nell’attività fosforilativa di ERK1/2 da parte di Clozapina, paragonando linee cellulari HeLa non trasfettate e linee cellulari HeLa trasfettate con il plasmide recettoriale 5-HT2A.

 Recettore 5-HT1A

Abbiamo escluso il ruolo del recettore 5-HT1A utilizzando il farmaco antagonista WAY-100,165. La preincubazione delle cellule con WAY a concentrazione 10 μM riduce l’attività fosforilativa di Clozapina. In aggiunta, la sola somministrazione di WAY 10 μM riduce l’attività fosforilativa basale cellulare. La differenza nell’attività fosforilativa che si ottiene paragonando WAY + Clozapina rispetto a Clozapina da sola, è la stessa che si osserva paragonando WAY da solo, che riduce l’attività basale, rispetto a Clozapina. WAY si è dimostrato quindi non essere un buono strumento per lo studio dell’attività recettoriale 5-HT1A, in quanto riduce l’attività basale di fosforilazione di ERK1/2, probabilmente inibendo l’attività basale di più recettori endogeni presenti a livello delle cellule HeLa.

Fig. 3.8 Attività fosforilativa di ERK1/2 indotta da clozapina: valutazione del ruolo del recettore 5-

HT1A attraverso l’analisi dell’effetto di WAY -100,165 (a  rispetto al basale; valore t di student: p <

77  Recettore 5-HT2A

Abbiamo utilizzato due antagonisti, Ketanserina e M100907, per indagare il coinvolgimento del recettore serotoninergico 5-HT2A. Da questo esperimento abbiamo dimostrato che 10 μM di questi due antagonisti riducono parzialmente l’effetto di Clozapina, rispettivamente del 38% e 42%; questo primo approccio ha permesso di rilevare, almeno in parte, l’importanza di questo sottotipo recettoriale nell’attività biologica di Clozapina.

Fig. 3.9 Attività fosforilativa di ERK1/2 indotta da clozapina: valutazione del ruolo del recettore 5-

HT2A attraverso l’analisi dell’effetto di Ketanserina [A] e M100907 [B] (a  rispetto al basale; b 

rispetto a Clozapina; valore t di student: p < 0,05, n = 3).

Abbiamo quindi esteso la ricerca ad altre linee cellulari, misurando contemporaneamente la fosforilazione di ERK1/2 e l’espressione dell’mRNA del recettore 5-HT2A. Tramite l’utilizzo della real-time PCR abbiamo determinato la quantità dell’espressione a livello delle cellule HeLa; una bassa, ma rilevabile quantità di mRNA di 5-HT2A è presente nelle cellule HeLa e conferma la rilevanza del ruolo di questo recettore. Inoltre grazie alla tecnica real-time PCR, abbiamo

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potuto indagare anche altre linee cellulari; in particolare le cellule SH-SY5Y non esprimono l’mRNA del recettore 5-HT2A, mentre le cellule C6 presentano questo messaggero a livelli molto elevati. L’effetto di Clozapina sull’attivazione di ERK1/2 è assente nelle cellule SH-SY5Y fino a concentrazione 10 μM, mentre nelle cellule C6 avviene parzialmente, con una EC50 di 6 μM ed una efficacia massima ridotta del 25% rispetto alle cellule HeLa.

Fig. 3.10 Espressione del recettore 5-HT2A nelle linee cellulari SH-SY5Y, HeLa e C6:

quantificazione mediante RT-PCR (valore t di student: p < 0,01; n = 3).

Abbiamo utilizzato un ulteriore approccio per indagare il ruolo del recettore 5- HT2A nel meccanismo d’azione di Clozapina; le cellule HeLa sono state trasfettate con il recettore ricombinante 5-HT2A, in modo tale da aumentarne l’espressione. Naturalmente questa strategia di sovraespressione non permette di dimostrare il ruolo dei recettori endogeni nell’attivazione di ERK1/2 e potrebbe portare al reclutamento di pathways che non sono rilevanti in vivo dal punto di vista biologico. Nelle cellule HeLa trasfettate, che quindi esprimono una quantità aumentata di 5-HT2AR a livello di membrana, si evidenzia un aumento dell’induzione della fosforilazione di ERK1/2 da parte di Clozapina. La potenza di Clozapina è quintuplicata rispetto ai valori di EC50 (5 μM) delle cellule non trasfettate. Tutti i risultati sembrano avvalorare l’ipotesi che la fosforilazione di ERK1/2 indotta da Clozapina ed in misura minore da altri antipsicotici, è mediata almeno in parte dal recettore serotoninergico 5-HT2A. Quanto suddetto è coerente con i dati presenti in letteratura, riguardo all’attività di fosforilazione di ERK1/2, da parte degli AAPs, in particolare Clozapina, mediante il 5-HT2AR [206]. In particolare Clozapina, che abbiamo preso come prototipo del nostro modello

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sperimentale, agisce su questo specifico pathway comportandosi come un agonista, attraverso il legame con il recettore 5-HT2A. Questo aspetto ci interessa in maniera particolare in quanto rappresenta una forma di selettività funzionale, soprattutto se lo osserviamo in relazione al fatto che gli antipsicotici atipici, per definizione sono classicamente antagonisti del 5-HT2AR. Tuttavia Clozapina può comportarsi come un ligando biased, con sfaccettature di agonismo ed antagonismo, proiettandosi su pathways cellulari differenti.

Fig. 3.11 Attività fosforilativa di ERK1/2 indotta da clozapina: curve concentrazione risposta in linee

cellulari C6 [A], HeLa[B], HeLa+ 5-HT2A[C], SH-SY5Y[D] e confronto della potenza [E].

Come ultima parte di analisi dell’atteggiamento di Clozapina nei confronti del 5- HT2A, abbiamo studiato i meccanismi di internalizzazione recettoriale, a conferma del ruolo di agonista da parte di questo AAPs. Utilizzando la microscopia a fluorescenza in presenza del farmaco, abbiamo messo in evidenza il recettore etichettato con un epitopo HA grazie all’utilizzo di anticorpi primari e secondari [198]. Sono state confrontate immagini in cui si vede molto bene come il recettore 5-HT2A in condizioni basali, è poco localizzato a livello delle strutture interne, mentre dopo incubazione per 30’ con Clozapina a concentrazione di 10 μM, i recettori sono chiaramente internalizzati e localizzati nei compartimenti endosomiali. Lo stesso fenomeno accade in presenza del neuromodulatore endogeno 5-HT, che induce endocitosi del 5-HT2A. Il recettore D2 è stato

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utilizzato come controllo negativo, la cui localizzazione sulla membrana è stata influenzata da Clozapina (dato non mostrato).

Fig. 3.12 Internalizzazione del recettore ricombinante 3HA-5-HT2A indotta da clozapina e dalla

serotonina in cellule HeLa.

3.3 ATTIVAZIONE DI AKT NELLE CELLULE HeLa: CARATTERIZZAZIONE