3 RISULTATI E DISCUSSIONE
3.3 ATTIVAZIONE DI AKT NELLE CELLULE HeLa: CARATTERIZZAZIONE DELL’EFFETTO DI CLOZAPINA ED ALTRI APs
Dopo aver sperimentato l’efficacia dei vari farmaci antipsicotici nell’induzione della fosforilazione di ERK1/2, ci siamo chiesti se questi farmaci possono avere delle attività anche nei confronti di AKT, un’altra chinasi che svolge diversi ruoli in molti processi neuronali, come la sinaptogenesi e la neurogenesi. Dopo aver dimostrato la particolare sensibilità delle HeLa ai farmaci antipsicotici nei fenomeni di attivazione di ERK1/2, abbiamo deciso di utilizzare questa linea cellulare anche in questo esperimento. La fosforilazione di AKT viene indotta in maniera molto efficace anche in questo caso dai farmaci di seconda generazione; Clozapina, Quetiapina e Olanzapina sono attivi in un range microM basso. In particolare Clozapina e Quetiapina, si sono mostrati come i farmaci più efficaci, ma l’effetto massimale è stato piuttosto simile tra questi farmaci. Clozapina induce una fosforilazione di AKT 2,8 volte superiore rispetto all’attività basale, mentre hEGF, utilizzato come controllo positivo, induce una fosforilazione 5,5 volte superiore rispetto all’attività basale. Il rapporto pAKT/AKT per ogni trattamento è stato determinato rispetto al rapporto pAKT/AKT dell’attività basale.
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L’efficacia massima di 5-HT risulta molto simile rispetto a quella di Clozapina per quanto riguarda l’induzione della fosforilazione di AKT, diversamente da quanto dimostrato per l’attivazione di ERK1/2, in cui l’efficacia massima è ridotta ad 1/3 rispetto a quella di Clozapina. Risperidone ha aumentato la fosforilazione di AKT con una efficacia massima pari ad 1/2 di quella di Clozapina, tuttavia il valore di EC50 è di 5 microM, che si mostra troppo lontano dalla sua concentrazione plasmatica terapeutica. Aripiprazolo ha avuto un effetto limitato dell’attivazione di AKT ed esclusivamente per concentrazioni superiori a 10 μM. Clozapina e Quetiapina si sono mostrati più potenti di Olanzapina, con EC50 rispettivamente di 9, 11 e 27 μM. Gli antipsicotici di prima generazione, tra cui Sulpiride ed Aloperidolo, hanno mostrato un effetto limitato, non oltre il 20% rispetto a Clozapina, esclusivamente a concentrazioni superiori a 10 μM; complessivamente si sono dimostrati meno efficaci di quelli degli atipici. Tra i tipici, Clorpromazina si è comportata in maniera differente sia per quanto riguarda l’attivazione di AKT che quella di ERK1/2. Clorpromazina ha una efficacia massima pari a 2/3 rispetto a quella di Clozapina ed un EC50 di 0,8 μM. Tutti gli esperimenti al riguardo della fosforilazione di AKT sono stati svolti per un tempo di incubazione di 10’.
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Fig. 3.13 Attività fosforilativa di AKT in cellule HeLa indotta da Antipsicotici tipici ed atipici: curve
concentrazione-risposta [A]. Efficacia (Emax) di induzione della fosforilazione di AKT: confronto tra
tipici ed atipici (a rispetto al basale; b rispetto a clozapina. Valore t di student: p < 0,05; n = 3)
[B]. Potenza (E50) di induzione della fosforilazione di AKT: confronto tra tipici ed atipici (n = 3) [C].
EC 50 (μM) Emax Clozapina 9.05 ± 2.70 2.87 ± 0.23 Quetiapina 11.32 ± 3.41 2.95 ± 0.11 Olanzapina 27.62 ± 7.90 2.37 ± 0.32 Risperidone 4.43 ± 1.22 1.92 ± 0.17 Aripiprazolo - 1.43 ± 0.20 Clorpromazina 0.80 ± 0.20 2.31 ± 0.26 Aloperidolo - 1.32 ± 0.17 Sulpiride - 1.34 ± 0.23 5-HT 0.029 ± 0.008 3.10 ± 0.49
Tabella 3.2 Potenza ed efficacia dell’induzione della fosforilazione di AKT (valori espressi come media ± errore standard).
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Abbiamo quindi deciso di indagare il meccanismo di attivazione di AKT indotta dagli antipsicotici, utilizzando come nel caso di ERK1/2, utilizzando Clozapina come prototipo. Abbiamo ricalcato i passi svolti per lo studio del meccanismo d’azione di ERK; inizialmente abbiamo utilizzato un inibitore a monte del pathway di AKT GSK2334470, che si è mostrato capace di bloccare l’effetto di Clozapina. Inoltre questo inibitore da solo è in grado di ridurre l’attività basale fosforilativa di AKT. Quindi abbiamo utilizzato antagonisti recettoriali, Scopolamina, ICI-118,551 e WAY-100,135, rispettivamente per i recettori muscarinici, β-adrenergici e serotoninerigici (5-HT1A) che non hanno avuto nessun effetto sulla fosforilazione di AKT indotta da Clozapina; abbiamo potuto confermare anche in questo caso che questi recettori non sono quindi implicati nel meccanismo d’azione di Clozapina.
Fig. 3.14 Attività fosforilativa di AKT indotta da clozapina: valutazione del ruolo dell’effetto
dell’inibitore PDK1[A] e del ruolo dei recettori muscarinici, adrenergici e 5-HT1A (a rispetto al
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4 CONCLUSIONI
Abbiamo affrontato il meccanismo d’azione dei farmaci antipsicotici ed in particolare ci siamo concentrati sugli atipici (AAPs), analizzando i principali sistemi neurotrasmettitoriali implicati. L’attività di questi farmaci va ben oltre l’antagonismo per i recettori D2 e 5-HT2A e la letteratura parla ampliamente dell’interessamento di altri recettori: serotoninergici (5-HT2C, 5-HT1A), muscarinici, adrenergici, glutammatergici ed istaminergici. Inoltre l’interazione con i GPCRs non sembra essere esclusiva, infatti sono stati studiati anche altri possibili target per descrivere le caratteristiche degli AAPs: canali ionici, trasportatori, enzimi, cinetiche di associazione e dissociazione recettoriale per il D2. Districandoci in questo labirinto recettoriale potrebbe essere interessante cercare di rappresentare l’atipia degli AAPs come uno spettro che rifletta il coinvolgimento recettoriale, edificandosi su 3 livelli a partire da risperidone per arrivare fino a clozapina.
Fig. 4.1 Rappresentazione grafica dell’atipia; un asse rappresenta l’andamento dell’atipia entro la
classe degli AAPs, l’altro asse rappresenta il corrispettivo interessamento recettoriale.
Al di là degli effetti a breve termine, gli effetti a lungo termine sembrano coinvolgere meccanismi cellulari più complessi come la funzionalità e plasticità neuronale. Partendo dal concetto che gli AAPs sono farmaci efficaci nel
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miglioramento dei sintomi negativi e del deterioramento cognitivo, l’intento di questo studio è stato quello di cercare di comprenderne il meccanismo. In particolare abbiamo studiato la capacità da parte degli APs di indurre attivazione di chinasi intracitoplasmatiche, come ERK1/2 ed AKT, che sembrano essere implicate nei suddetti fenomeni di sinaptogenesi e plasticità neuronale.
Il nostro studio ha mostrato una sostanziale differenza tra i TAPs e gli AAPs nel fenomeno di induzione della fosforilazione di ERK1/2 ed i nostri dati permettono di stratificare tre categorie nel contesto degli APs in relazione all’attivazione di ERK1/2 ed AKT:
1. Gli antipsicotici di prima generazione, tra cui Aloperidolo e Sulpiride, ed alcuni di seconda generazione, tra cui Aripiprazolo e Risperidone, attivano ERK1/2 ed AKT poco efficacemente, alle concentrazioni che potrebbero essere raggiunte a livello ematico in terapia con questi farmaci.
2. Gli antipsicotici di seconda generazione tra cui Quetiapina ed Olanzapina, oltre a Clorpromazina, un TAP, mostrano una buona attivazione delle chinasi suddette, in un range di concentrazione μM.
3. Clozapina invece si mostra superiore a tutti gli altri APs ed attiva ERK1/2 ed AKT anche a basse concentrazionii μM.
Ci siamo quindi chiesti quale sia il meccanismo d’azione con cui agisce Clozapina ed abbiamo compreso e dimostrato che l’effetto di questo farmaco è dovuto all’attivazione del recettore 5-HT2A. Clozapina è dunque in grado di comportarsi su questo recettore, come antagonista su determinate vie di trasduzione, ma anche come agonista su altre vie. Tale fenomeno viene definito “selettività funzionale” o “biased agonism”. Questo nuovo meccanismo farmacologico potrebbe applicarsi anche ad altre categorie di farmaci, e potrebbe portare alla scoperta di nuovi farmaci “super selettivi” su specifiche funzioni recettoriali.
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Fig. 4.2 Rappresentazione grafica del biased agonism; attivazione di pathways multipli, principali o
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