Utilizzando la tecnica del primer walking, l’intero frammento del clone F è stato sequenziato e sono state individuate 5 complete e 2 incomplete ORF intorno al gene putativo per OXC (figura 17). A parte le ORF-2 e -4, tutte le altre ORF sono orientate nella stessa direzione di oxc. Attraverso un’analisi bioinformatica della sequenza di 1782 bp del gene oxc, codificante per una proteina di 593 aa (MW 36.71 kDa), è stato possibile riscontrare una totale omologia al gene oxc di B. lactis DSM 10140, dove è già stato dimostrato il suo impiego nel catabolismo di ossalato (Federici et al., 2004). Da un’analisi BlastX del gene oxc di B. lactis BI07, è stato possibile verificare l’alta similarità con l’oxalyl-CoA decarbossilasi putativa di B. gallicum, B. dentium e B. pseudocatenulatum 79%, 78% e 74% di similarità, rispettivamente) (acc. no.: ZP_04006707, YP_001271099, ZP_04012429), con E. coli (51%) (acc. no.: NP_416874) e O. formigenes (48%) (acc. no.: ZP_04579522). La proteina codificata da oxc ha un dominio conservato che è presente in enzimi che richiedono tiamina pirofosfato (TPP) [acetolactate synthase, pyruvate
dehydrogenase (cytochrome), glyoxylate carboligase, phosphonopyruvate
decarboxylase] (COG0028). Nel prodotto di oxc, la porzione N-terminale del dominio TPP-binding (pfam02776) inizia al residuo amminoacidico 23 e si estende per 165 aa, la porzione centrale (pfam00205) inizia al residuo 212 e si estende per 130 aa e la porzione C-terminale del dominio TPP-binding (pfam02775) inizia al residuo 418 e si estende per 135 aa.
ORF-1 inizia sullo stesso filamento, 104 nucleotidi a valle del gene oxc. La proteina dedotta dalla sequenza nucleotidica ha un peso molecolare di 39.25 kDa e un pI di 8.99. Efettuando una blast analisi dei 367 aa codificati dalla ORF-1 si evidenzia una similarità con diverse permeasi, avendo i domini COG0679 e pfam03547 conservati. Oltre alla permeasi di B. lactis DSM 10140, identica al 100%, le somiglianze più forti si riscontrano per i recettori putativi di B. dentium, B. pseudocatenulatum e B. gallicum (79-81% di identità e 88-9% di similarità) (acc. no.: ZP_02917881, ZP_03743614, ZP_05965189). Livelli di similarità superiori al 72% sono stati individuati per L. acidophilus, L. gasseri, L.
johnsonii e L. ultunensis (acc. no.: YP_193290, YP_814096, ZP_04006706, ZP_04012395),
mentre il 49% di identità è stato trovato per il trasportatore putativo YfdV di E. coli (acc. no.: NP_416873). L’analisi delle zone di idrofobicità della proteina ipotetica codificata per la ORF-1 ha rivelato la presenza di 10 segmenti transmenbrana, composti da diversi residui idrofobici. L’analisi topologica ha predetto che la porzione N-terminale può essere espressa nello spazio extracellulare.
ORF-2 è stata identificata 7 nucleotidi a valle di ORF-1 orientata in direzione opposta a
oxc. Il gene è stato previsto codificare per una proteina contenete 43 aa e con un peso
significativa solo con una non-pfam proteina ipotetica di B. lactis DSM 10140 (acc. no.: gblA CS48365).
ORF-3, localizzata 863 nucleotidi a valle di ORF-1 sullo stesso filamento, è di 1137 bp di lunghezza e codifica per una proteina di 378 aa con peso molecolare di 40.03 kDa. A livello proteico, il prodotto della ORF-3 ha mostrato un’alta omologia con la beta- mannosidasi secreta di B. lactis (100% di identità; acc. no.: YP_002970426),
Streptomyces coelicolor e Streptomyces lividans (50% di identità; acc. no.:
emblCAA20610, gblAAA26710). Nella porzione C-terminale della proteina è presente un dominio di legame per la cellulosa o per proteine (pfam02013).
ORF-4, orientata in direzione opposta del gene oxc, è composta da 1332 bp codificando per una proteina di 443 aa, con un peso molecolare previsto di 48.90 kDa e un pI di 5.03. Comparando la sequenza amminoacidica all’interno del database, è stato possibile mostrare un’alta similarità con la formyl-CoA transferasi putativa di B. lactis (100% di omologia; acc. no.: YP_002970425), B. dentium, B. gallicum e B.
pseudocatenulatum (82-87% di omologia, 92-95% di similarità) (acc. no.: ZP_02917882,
ZP_05965202, ZP_03743615). Livelli di omologia maggiori di 63% sono stati osservati con l’enzima Frc di diversi lattobacilli (L. johnsonii, L. reuteri, L. gasseri, L. acidophilus, L.
ultunensis, L. crispatus) (acc. no.: ZP_04006708, YP_001271100, YP_814094, YP_193317,
ZP_04012428, ZP_03995674). Inoltre, il prodotto della ORF-4 presenta il 44 e 49% di omologia (62 e 67% di similarità) con le proteine codificate dai geni frc di O. formigenes (acc. no.: ZP_04579035) e yfdW di E. coli (acc. no.: NP_416875). L’analisi della sequenza proteica con pfam marche, ha rivelato la presenza di un dominio conservato pfam02515, appartenente alla terza famiglia delle CoA- transferasi, che parte dal residuo 74 e si estende per 207 aa. Come per Oxc, non sono state riscontrate porzioni proteiche transmembranali o di ancoraggio alla parete, suggerendo che questa proteina sia di tipo citoplasmatico.
L’ultima ORF completa, localizzata a monte di oxc e denominata ORF-7, contiene 552 codoni. La sequenza amminoacidica conferisce un peso molecolare di 60.26 kDa ed un pI di 8.98, dimostrando il 100% di omologia con la famiglia di proteine del canale del cloro voltaggio dipendente di B. lactis DSM 10140 (ac. no.: YP_002970430), e una significativa similarità con le proteine del cloro putative EriC di B. gallicum (49% omologia; acc. no.: ZP_05965186) e Eggerthella lenta (44% omologia; acc. no.: ZP_03895186). Nella sequenza proteica proposta è presente un dominio conservato di EriC, coinvolto nel trasporto e nel metabolismo di ioni inorganici (COG0038). Il profilo idrofobico del prodotto di ORF-7 rivela la presenza di 11 regioni trans membrana con orientamento interno ed esterno.
Sono state identificate due ORF incomplete, entrambe sullo stesso filamento di oxc. La prima, ORF-5, contiene 8 codoni per la regione N-terminale della proteina, che mostra un’alta similarità con la proteina integrasi putativa di B. lactis DSM (83% di omologia; acc. no.: YP_002970424). La seconda, ORF-6, localizzata a monte di ORF-7, contiene 345 aa, che hanno un’omologia al 100% con una proteine della membrana esterna di B. lactis DSM 10140, coinvolta nel processo si adesione al collagene (acc. no.: YP_002970431).
Comparando l’organizzazione genica intorno a oxc con quella degli altri bifidobatteri risulta essere simile (fig 17). Sicuramente, oxc, ORF-1 e ORF-4 sono presenti nello stesso ordine in B. gallicum, B. dentium e B. pseudocatenutatum. È molto interessante notare come nel genoma di B. gallicum, il gene codificante per la proteina Frc putativa, è localizzata 14 ORF a valle del gene oxc sullo stesso filamento. Il repertorio genico
presente nei livelli tassonomici indipendenti (per esempio Lactobacillus, Escherichia e
Oxalobacter) è risultato molto differente in termini di disposizione e orientamento
trascrizionale, che risulta essere in accordo con la loro distanza filogenetica. L’unica eccezione è rappresentata da O. formigenes, dove sono inserite oltre 500 kbp tra oxc e ORF-4 (fig 17).
Fig 17. Organizzazione genica intorno al gene oxc in B. lactis BI07 (A) e comparazione con i geni corrispondenti in bifidobatteri, lattobacilli, E. coli and O. formigenes (B). Ogni freccia indica le ORF, e la lunghezza è proporzionale alla lunghezza della ORF predetta. Sulle frecce sono indicati i livelli di omologia amminoacidica espressi in percentuale.