Il sistema plasminogeno-plasmina è coinvolto nei processi di proteolisi extracellulare presenti nei mammiferi. Svolge un ruolo fondamentale nella fibrinolisi, nella migrazione cellulare, nel rimodellamento dei tessuti e nei processi infiammatori (Marsh, 1981; Dano et al., 1985; Saksela e Rijken, 1988).
La proteina chiave di questo sistema è il plasminogeno (Plg), zimogeno della serin- proteasi plasmina. Il Plg è una glicoproteina a singola catena con una massa molecolare di circa 92 kDa; è presente nel plasma a concentrazioni di 180-200 μg/ml (circa 2 μM), ma si ritrova anche in diversi fluidi interstiziali (Myohanen e Vaheri, 2004). Questa proteina è sintetizzata soprattutto nel fegato, ma sono state identificate anche altre sorgenti tissutali, tra cui l’intestino (Zhang et al., 2002). Il Plg è sintetizzato come proteina di 810 aminoacidi (aa); il taglio del peptide segnale (19 aa) porta alla proteina matura (791 aa), che presenta un residuo di acido glutammico all’N terminale (Glu-Plg) (figura 20).
Fig 20. Struttura del plasminogeno umano. Il triangolo indica il sito di taglio degli attivatori del plasminogeno
(uPA e tPA) (Soff, 2000).
Il Glu-Plg contiene un sito di fosforilazione [Ser578 (Wang et al., 1997)] e due siti di glicosilazione [Thr346, Asn289 (Hayes e Castellino, 1979a, 1979b, 1979c)], ma si possono distinguere due glicoforme di Plg: il tipo 1, che ha entrambi i siti glicosilati, e il tipo 2, che
presenta solo l’ O-glicosilazione. Oltre al Glu-Plg, sono presenti altre forme di questa proteina, Lys-Plg [84 kDa, 713-714 aa (Mori et al., 1995)] e Val-Plg o mini-Plg [38 kDa, 344 aa (Folkman, 1995)], originate dall’idrolisi enzimatica di specifici legami peptidici. La formazione della plasmina a partire da queste forme troncate è più rapida rispetto al Glu-Plg.
La plasmina, ottenuta dal taglio proteolitico operato dagli attivatori del Plg a livello del legame peptidico Arg561-Val562, è una molecola costituita da una catena N terminale pesante e una catena C terminale leggera, unite da due legami disolfuro (Cys548-Cys666; Cys558-Cys566).
La catena pesante presenta il peptide di attivazione N terminale (residui 1-77, circa 8 kDa) seguito da 5 domini kringle (K1-K5) consecutivi; la catena leggera presenta invece il dominio serin-proteasico (25 kDa) contenente la triade catalitica His603-Asp646-Ser741 (Vassalli et al., 1991; Ponting et al., 1992).
I domini kringle sono strutture di circa 80 residui aminoacidici (65 kDa) organizzati in un triplo loop, stabilizzato da 3 ponti disolfuro (Sottrup-Jensen et al., 1978). Questi domini mediano interazioni di legame intermolecolari, regolando così l’attività delle proteine che li possiedono. Numerose molecole presentano al loro interno strutture omologhe ai kringle: oltre al Plg/plasmina, si hanno la protrombina, gli attivatori del plasminogeno tPA e uPA, l’angiostatina [(costituita dai primi quattro kringle del Plg (O’Reilly et al., 1994)], l’apolipoproteina A (che presenta più di 40 kringle), il fattore di crescita degli epatociti (HGF) e le proteine HGF-like, le defensine, il fattore di coagulazione XII (Ponting et al., 1992; Bork et al., 1996). Diversi studi hanno mostrato che i kringle interagiscono con i ligandi attraverso siti di legame per la lisina [LBS, Lysine- Binding Site (Ponting et al., 1992)]. Per quanto riguarda il Plg/plasmina, i kringle 1, 4 e 5 mostrano la maggiore affinità per ligandi contenenti lisina, mentre il kringle 2 risulta il meno affine (Marti et al., 1997).
Il target principale dell’attività proteolitica della plasmina è la fibrina, proteina derivante dal fibrinogeno che costituisce la struttura del coagulo. Oltre a questa molecola, si conoscono molti altri substrati della plasmina, tra cui vitronectina, fibronectina e laminina, componenti principali della membrana basale e della matrice extracellulare (Plow et al., 1995). Inoltre, la plasmina può attivare altri enzimi proteolitici, come le metalloproteasi della matrice e le elastasi latenti dei macrofagi, responsabili della degradazione del collagene, dell’elastina e dei proteoglicani (Murphy et al., 1999).
A causa dell’abbondanza del plasminogeno che circola nell’organismo e dell’ampia varietà dei substrati della plasmina, questo sistema proteolitico deve essere strettamente regolato.
L’attivazione della plasmina è controllata da attivatori del plasminogeno (Plasminogen Activator, PA). I PA fisiologici dei mammiferi sono l’attivatore tissutale del plasminogeno (tissue-type PA, tPA) e l’urochinasi (urokinase-type PA, uPA) (Castellino e Powell, 1981); entrambi appartengono al gruppo delle serin-proteasi secrete attivate da taglio proteolitico. Il tPA, sintetizzato soprattutto dalle cellule dell’endotelio vascolare, presenta un dominio finger che lega la fibrina (omologo a quello presente nella fibronectina tipo- 1), un dominio Growth Factor-like (GFD), due domini kringle e il dominio catalitico; questo attivatore presenta un’alta affinità per il Plg solo in presenza di fibrina, permettendo così la produzione di plasmina soltanto a livello del coagulo. Per quanto riguarda l’uPA, la sua struttura è simile a quella del tPA: presenta un domino GFD, un kringle e il domino proteasico. L’urochinasi, però, agisce in situazioni e localizzazioni
cellulari differenti: lega infatti uno specifico recettore presente sulla membrana cellulare (uPA receptor, uPAR) e il legame permette l’incremento dell’attività dell’uPA, oltre a proteggerlo dagli inibitori dei PA e dalla plasmina. Grazie alle diverse proprietà di legame, questi due attivatori agiscono in processi diversi: l’uPA sembra essere l’attivatore del Plg più importante nei processi di migrazione delle cellule eucariotiche, mentre il tPA risulta fondamentale nella fibrinolisi (Lijnen e Collen, 1995; Plow et al., 1999).
A fianco degli attivatori esistono anche inibitori, appartenenti al gruppo delle serpine, che agiscono sull’attività catalitica delle serin-proteasi formando un complesso stabile a livello del sito attivo dell’enzima. L’inibitore principale della plasmina è la serpina α2- antiplasmina (α2-AP), che inibisce efficientemente la plasmina solubile legandosi ai kringle e bloccando il sito attivo. Un altro inibitore abbondante nel plasma è l’α2- macroglobulina (α2-M), che risulta però meno attiva rispetto all’α2-AP (Miyashita et al., 1988). Sono presenti poi gli inibitori dei PA (PAI1-3), che regolano negativamente la plasmina in modo indiretto.
Al sistema di regolazione appartengono anche recettori a bassa affinità presenti sulla superficie di molte cellule di mammiferi, che riconoscono i domini kringle del Plg (Hajjar, 1991; Miles et al., 1991; Redlitz e Plow, 1995); tra questi recettori si hanno proteine con lisine C terminali (α-enolasi) o ricche in lisine (anfoterina), ma anche recettori non proteici (gangliosidi e glicosaminoglicani) (Plow et al., 1995). Il legame del Plg al recettore altera la sua conformazione in modo da facilitarne l’attivazione da parte dei PA e proteggere la plasmina dall’inibitore α2-AP (Wiman et al., 1979; Mangel et al., 1990).