I recettori batterici del Plg (plasminogen receptor, PlgR) sono molecole di superficie sfruttate dai batteri per immobilizzare il Plg e favorire la sua conversione a plasmina da parte dei PA. Questo sistema permette ai batteri di acquisire un’attività proteolitica a livello della parete. Nei batteri Gram negativi, i principali PlgR sono costituiti da fimbrie e flagelli, appendici filamentose presenti sulla superficie di questi microrganismi. Sui batteri Gram positivi, invece, sono state identificate proteine di parete che legano il Plg. Molti patogeni presentano PlgR, la maggior parte dei quali possiede anche altre funzioni, come adesione, movimento, attività enzimatica, assunzione di nutrienti, interazione con il sistema immunitario. Una singola specie batterica può inoltre esprimere differenti tipi di PlgR (Lähteenmäki et al., 2001).
In Borrelia burgdorferi, l’agente eziologico della malattia di Lyme o borreliosi, sono state identificate due Plg binding protein: la proteina A di superficie esterna (outer surface protein A, OspA) e una proteina di superficie da 70 kDa che presenta omologia con le proteine del trasportatore periplasmico ABC di altri batteri patogeni (Fuchs et al., 1994; Hu et al., 1997).
Non sono presenti PA batterici, ma il Plg legato al batterio viene attivato a plasmina dall’uPA umano e promuove la degradazione dei componenti dell’ECM e la migrazione batterica attraverso i monostrati endoteliali (Coleman e Benach, 1999). È stato dimostrato che cellule di B. burgdorferi e OspA purificata stimolano la produzione di pro- uPA nei monociti umani, oltre ad aumentare l’espressione e il rilascio di uPAR dai monociti (Coleman et al., 2001; Coleman e Benach, 2003).
I GAS esprimono diverse Plg binding protein di superficie; una delle più affini è PAM (plasminogen-binding group A streptococcal M-protein), appartenente alla famiglia delle proteine M, molecole fibrillari antifagocitarie caratterizzate da numerose regioni ripetute (Berge e Sjobring, 1993). L’interazione con il Plg è mediata da due sequenze ripetute di 13 aa (a1 e a2) contenenti un residuo centrale di lisina, localizzate sulla superficie esposta all’N-terminale di PAM. La sostituzione nella sequenza a1 del residuo di lisina centrale con un residuo di alanina riduce dell’80% il legame al Plg (Ringdahl e Sjobring, 2000). In Streptococcus sono state identificate anche altre proteine di superficie che legano ad alta affinità il Plg: la proteina Prp (PAM-related protein), appartenente alla famiglia delle proteine M (Sanderson-Smith et al., 2007), e la proteina E legante colina (choline-binding protein E, CBPE), membro della famiglia di proteine leganti colina esposte sulla superficie (Attali et al., 2008).
Tra i PlgR batterici destano particolare interesse alcune proteine citoplasmatiche che, pur essendo prive di segnali di esportazione e di ancoraggio alla parete, sono esposte sulla superficie. Il meccanismo di secrezione o ancoraggio di queste “moonlighting protein” è ancora da chiarire. Spesso le “moonlighting protein” sono enzimi (come α- enolasi) o heat shock protein (Hsp) molto conservati che, quando si trovano sulla parete, acquisiscono una “moonlighting function” aggiuntiva, differente da quella svolta nel citoplasma (Jeffery, 1999; Schaumburg et al., 2004).
In vari microrganismi sono stati identificati diversi enzimi glicolitici che interagiscono in modo specifico con il Plg; tra questi, i più studiati sono gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) e α-enolasi.
GAPDH è stato il primo PlgR identificato sui GAS in grado di legare il Glu-Plg. Studi di mutagenesi sito-specifica hanno dimostrato l’importanza della lisina C-terminale nell’interazione di GAPDH con il Plg: la sostituzione di questo residuo con una leucina porta infatti ad una riduzione del legame. D’altra parte, cellule mutanti per questa proteina presentano un Plg binding paragonabile a quello dei non mutanti, il che indica l’esistenza di altri PlgR sulla superficie di questi microrganismi (Winram e Lottenberg, 1998). Anche in Listeria monocytogenes GAPDH è stato individuato nella frazione proteica della parete cellulare e potrebbe rappresentare un altro fattore di virulenza di questo patogeno (Schaumburg et al., 2004).
L’α-enolasi è un enzima fondamentale della glicolisi: catalizza la conversione del 2- fosfo-Dglicerato (2-PGE) a fosfoenolpiruvato (PEP). Negli eucarioti l’enzima attivo forma un dimero, mentre nei batteri si trova come ottamero (Brown et al., 1998; Ehinger et al., 2004). La localizzazione dell’α-enolasi sulla superficie cellulare è comune a molti organismi procarioti ed eucarioti (Pancholi, 2001). Questo enzima è il principale PlgR presente sulla superficie di varie specie di Streptococcus. Due residui di lisina posizionati al C-terminale dell’α-enolasi di Streptococcus pneumoniae (sito BS1) sono importanti nell’interazione con il Plg/plasmina (Bergmann et al., 2001), ma la rimozione di questi due aminoacidi per trattamento con carbossipeptidasi B, o la loro sostituzione con residui di leucina, riduce solo in parte il legame al Plg. Un ulteriore sito di legame al Plg (sito BS2) è stato quindi identificato nell’α-enolasi di S. pneumoniae (sequenza aminoacidica: 248FYDKERKVY256) (Bergmann et al., 2003) e la risoluzione della struttura cristallografica di questa proteina ha mostrato la sua localizzazione su un loop esposto sulla superficie (Ehinger et al., 2004). L’esposizione di α-enolasi e la sua attività di Plg binding è stata dimostrata per numerosi organismi eucarioti e procarioti, sia commensali [Lactobacillus crispatus ST1 (Antikainen et al., 2007a; Hurmalainen et al., 2007)] che
patogeni [Bacillus anthracis Sterne 34F2 (Agarwal et al., 2008), Candida albicans (ceppi: ATCC 10261, SGY243, CAI4, CAF2, CHK21, CAJ4) (Jong et al., 2003), Fasciola epatica (Bernal et al., 2004), Leishmania mexicana AZV (Vanegas et al., 2007), Listeria
monocytogenes EGDe (Schaumburg et al., 2004), Mycobacterium fermentans PG-18
(Yavlovich et al., 2007), Neisseria meningitidis (ceppi: MC58, H44/76, Z2491, 2120, 171, 172, a14) (Knaust et al., 2007), Onchocerca volvulus (Jolodar et al., 2003), Pneumocystis
carinii (Fox e Smulian, 2001), Schistosoma bovis (Ramajo-Hernández et al., 2007), Staphylococcus aureus (Mölkänen et al., 2002), Streptococcus mutans (Ge et al., 2004;
Jones e Holt, 2007), Trichomonas vaginalis (Mundodi et al., 2008)]. Tra i procarioti, solo nei Gram positivi l’α-enolasi lega il Plg, mentre i Gram negativi, come Bacteroides fragilis, presentano sulla membrana esterna altre proteine in grado di interagire con il Plg, ad esempio Pbp (Plg binding protein) (Sijbrandi et al., 2005; Sijbrandi et al., 2008).
Il legame al Plg e l’adesione alle proteine della matrice extracellulare sono solitamente considerati fattori di virulenza, coinvolti nei processi di invasione e colonizzazione batterica.
Un recente studio di Antikainen et al. (2007b) ha però mostrato che le molecole di α- enolasi presenti sia sulla parete di diverse specie commensali di Lactobacillus (L.
crispatus ST1, L. johnsonii F133) sia sulla superficie dei patogeni Streptococcus pneumoniae TIGR4, Streptococcus pyogenes IH32030 e Staphylococcus aureus 8325-4
possiedono la stessa attività di legame al Plg e di adesione alle proteine dell’ECM.
Streptococcus e Staphylococcus esprimono però propri attivatori del Plg, mentre Lactobacillus non possiede PA: è dunque probabile che l’interazione con il sistema del Plg
sia una strategia ecologica comune a batteri presenti nello stesso ecosistema ma che occupano nicchie differenti, portando ad un diverso esito dell’interazione (commensalismo o patogenesi). Una importante “moonlighting protein” appartenente al gruppo delle Hsp è la chaperone molecolare DnaK, della famiglia delle Hsp70. Le chaperone molecolari costituiscono complessi proteici i cui componenti, altamente conservati e presenti sia in eucarioti che in procarioti, sono coinvolti in processi di folding proteico: ripiegamento e assemblaggio di proteine di nuova sintesi, refolding di proteine unfolded o aggregate, trasporto di proteine nella cellula. Sono stati identificati diversi complessi di chaperone molecolari; uno dei principali è il complesso Hsp70, omologo al complesso DnaK presente nei batteri. Questo sistema di chaperone permette il folding delle proteine attraverso cicli di legame e rilascio, dipendenti da ATP, di segmenti idrofobici di una catena polipeptidica unfolded. DnaK è uno dei componenti di questo complesso e presenta una struttura molto conservata, costituita da un dominio ATPasico all’N-terminale e da un dominio di legame al substrato al C-terminale (Hartl, 1996; Bukau e Horwich, 1998; Mayer e Bukau, 2005). DnaK è stata ritrovata sulla parete cellulare di tre specie patogene (Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis e Mycobacterium
tuberculosis) ed è stata dimostrata la sua interazione con il Plg/plasmina (Schaumburg et