In questo lavoro di tesi è stato preso in esame il prototipo del bioreattore 3D Gradient Maker che costituisce un dispositivo dotato di un sistema micro uidico in grado di generare all'interno del bioreattore stesso un gradiente di concentrazione tridimensionale; date le caratteristiche del dispositivo studiato è interessante individuare la posizione sul mercato che tali sistemi occupano. I bioreattori per la rigenerazione dei tessuti e, in generale, per qualsiasi processo di ingegneriz- zazione tissutale, devono possedere, come già ampiamente discusso, un sistema che guidi e forzi il mezzo di coltura attraverso lo scaold, favorendo il trasporto di massa, la semina cellulare e la loro proliferazione e che superi i limiti delle procedure manuali di semina, collegati al ricambio del mezzo di coltura, al rischio di contaminazione e al trasporto diusivo puramente passivo, tipici delle colture in piastra e in asca [25, 26, 27]. In particolare, l'impiego di bioreattori a perfusione è vantaggioso perché aumenta l'e cacia dei processi di semina e l'uniformità della distribuzione delle cellule all'interno di scaold porosi, consentendo l'ottenimento di costrutti ingegnerizzati più omogenei; aumenta l'e cienza del trasporto di ossigeno e metaboliti e della rimozione di cataboliti. Se associato all'uso di sensori di ossigeno e pH e all'implementazione di strategie di controllo in retroazione, consente di automatizzare e controllare le operazioni di ricambio del mezzo di coltura; permette inoltre la sollecitazione sica delle cellule seminate negli scaold porosi determinando condizioni di coltura che meglio rappresentano quelle cui i tessuti sono sottoposti nel naturale sviluppo in vivo. I bioreattori a perfusione inoltre, diminuendo il ri- corso alle operazioni manuali, favoriscono la traduzione delle procedure dell'ingegneria dei tessuti dalla ricerca all'applicazione clinica, aumentando la tracciabilità, la riproducibilità, l'e cienza e la sicurezza dei processi, tutti requisiti chiave a nché tali procedure possano competere con le alternative terapeutiche tradizionali, sia in termini di costo che in termini di rispetto delle regole di produzione [27].
I dispositivi dotati di sistemi a perfusione rappresentano, pertanto, e caci strumenti per migliorare le procedure dell'ingegneria dei tessuti biologici, sono ottimi sistemi-modello per lo studio dei meccanismi di sviluppo dei tessuti biologici in vitro e costituiscono una tappa impor- tante nel percorso che porterà sempre di più ad un'a dabile, sicura ed economicamente sostenibile applicazione clinica dell'ingegneria nella medicina rigenerativa [27].
5.6.1 Aspetti fondamentali nella progettazione di un bioreattore
Di seguito sono riportate e descritte le speci che generali di progettazione dei bioreattori per la medicina rigenerativa [27] ( gura 1.13).
Figura 5.10: Speci che generali di progettazione dei bioreattori per la medicina rigenerativa L'a dabilità del sistema risulta indispensabile considerando anche i lunghi periodi di coltura spesso previsti. Lo sviluppo di un progetto deve prevedere la possibilità di apportare modi - che successive al dispositivo e deve tener conto dei requisiti di modularità che ne sempli chino l'attuazione e l'utilizzo.
Non si dimentichi che i costi di realizzazione e di utilizzo dei dispositivi devono essere quanto più possibile contenuti. La compatibilità con le procedure di laboratorio prevede che il sistema per la coltura cellulare sia sterile; è consigliabile, di conseguenza, eettuare il minor numero di manovre manuali possibili.
La scelta del metodo di sterilizzazione dipende nello speci co dal materiale con cui è realizzato il bioreattore; in ogni caso, è necessaria la proprietà di sterilizzabilità dei componenti a contatto con il mezzo di coltura e con le cellule.
La camera di coltura, per quanto detto, deve essere sterile. Il bioreattore durante il periodo di funzionamento deve essere inserito in un incubatore che garantisca il costante controllo della qualità dell'aria, perciò deve avere ingombro ridotto. Questa speci ca potrà essere trascurata quando verranno realizzati bioreattori nella cui struttura è automaticamente compresa la funzione incubatrice. Oltre alla qualità dell'aria, un bioreattore deve regolare e monitorare gli speci ci parametri della coltura e dello stato funzionale del costrutto, così da rendere riproducibili le condizioni di coltura.
Poiché il sistema deve poter essere utilizzato dal più ampio numero di utenti, anche non professionisti del settore, i parametri di sollecitazione devono poter essere regolati con una certa facilità grazie a guide di utilizzo che permettano, anche a chi non conosce il programma, di impostare correttamente i parametri da regolare.
In ne, considerando il fatto che il ricambio del mezzo di coltura è necessario per mantenere in vita le cellule, esso deve poter essere eseguito con una certa facilità, possibilmente con l'aiuto di un sistema a sensori che lo controlla.
Alcune persone del settore prevedono che la biotecnologia a perfusione potrebbe rappresen- tare la prossima rivoluzione nel bioprocessing [28] dati gli aspetti vantaggiosi relativi a costi e prestazioni.
5.6.2 Dati di mercato
I dati del Report 2011 dell' 8th Annual Report and Survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production mostrano che le aziende del settore bio-farmaceutico hanno aumentato il loro budget in sostanzialmente tutti i settori del bioprocessing [28].
Progressi signi cativi di bioreattori su scala clinico-commerciale si sono veri cati negli ultimi anni, soprattutto per quanto riguarda sistemi basati su bioreattori monouso e/o usa e getta.
I dati annuali ricavati dal report del 2011 [29] indicano una spesa media da parte delle im- prese di 168 mila dollari/anno per l'acquisto di bioreattori monouso, 260.000 dollari/anno per contratti con CMO (Contract Manufacturing Organization è un'organizzazione che serve le indu- strie farmaceutiche fornendo ai clienti servizi completi per sviluppo e produzione farmacologica) e 147.000 dollari/anno per lo sviluppo di prodotti. L'interesse per le nuove biotecnologie varia da continente a continente, con il più alto interesse (32,2%) in Europa, rispetto a 26,9% per gli Stati Uniti e il 31% per la restante parte del mondo intervistata.
I pochi bioreattori a perfusione disponibili negli ultimi decenni sono stati utilizzati principal- mente per scopi speciali, come per la coltura di cellule staminali ma l' interesse per questi sistemi è in aumento, con un numero crescente di bioreattori a perfusione sul mercato, compresi quelli per la grande fabbricazione del prodotto commerciale.
Le ridotte dimensioni di questi sistemi rispetto ai precedenti bioreattori fed-batch li rende mag- giormente favoriti per applicazioni monouso; richiedono meno spazio per supportare attrezzature e utenze il che implica un notevole risparmio di costi.
5.6.3 Bioreattori a perfusione sul mercato
Nuovi bioreattori ed in generale biotecnologie a perfusione si stanno rapidamente facendo strada sul mercato industriale; tra i bioreattori a perfusione disponibili troviamo FiberCell, ZellWerk (Glen Mills negli Stati Uniti), Biovest, ATMI, PBS / Perfeziona, AmProtein, Xcellerex, Applikon, e Wave Biotech.
Alcuni sistemi prevedono la ltrazione per conservare le cellule sospese nel bioreattore, mentre altri sono più simili ai classici bioreattori a perfusione e coinvolgono cellule vincolate a bre capillari o membrane.
5.6.4 Prospettive del settore
Un'indagine condotta dalla BioPlan mostra che la percezione del settore e gli atteggiamenti verso sistemi a perfusione rimane radicata nel passato. Viene fornito un elenco di problematiche che interessano i bioreattori e nel caso speci co vengono analizzate queste criticità sia per sistemi a perfusione che per bioreattori fed-batch (la coltura in fed-batch consiste in un sistema semi-aperto, in quanto è aperto solo in entrata, ma non in uscita, perciò è anche detto a volume variabile; durante la coltura in fed-batch si ha una fase iniziale in batch, poi, una volta raggiunta adeguata biomassa, inizia il processo fed-batch. La biomassa aumenta in proporzione ai nutrienti forniti, no a che non sono altri fattori a causare un rallentamento della crescita, come ad esempio la scarsità di ossigeno.
bioreattori a perfusione bioreattori fed-batch
complessità dei processi alta ridotta
rischi di contaminazione alta ridotta
capacità di generare processi di scale-up alta ridotta necessità di un maggiore controllo sul processo alta ridotta problemi di densità cellulare elevati ridotti
accumulo di ri uti limitato elevato
qualità del prodotto alta ridotta
concentrazione del prodotto elevata ridotta Tabella 5.4: Problematiche che interessano i bioreattori
Tuttavia, i sistemi di perfusione attuali incorporano decenni di miglioramenti relativi a terreni di coltura, l'ingegneria genetica, membrane e ltri, metodi per ossigenazione, pompe, attrezzature monouso e monitoraggio dei processi; questi hanno risolto molti dei problemi mostrati dai primi sistemi a perfusione, compresi i tassi di fallimento elevati.
Alla ne, sistemi a perfusione più piccoli e meno costosi, che coinvolgono un minor numero di utenze e molto meno lavoro, possono sostituire grandi bioreattori fed-batch (sia ssa in acciaio inox e monouso) per la fabbricazione del prodotto commerciale. Nel contesto attuale, con le autorità di regolamentazione che richiedono una maggiore garanzia di sicurezza e società peren- nemente in cerca di risparmio di costi, la biotecnologia a perfusione può nalmente diventare la tecnologia preferita per la produzione di bio-farmaci ed innesti di ingegneria tissutale in quanto produttività, coerenza e costi sono tra le principali preoccupazioni.