5.8 Presentazione di alcuni dispositivi in commercio
5.8.4 Cellec: U-CUP perfusion bioreactor
Il sistema risulta essere e ciente ai ni della coltura cellulare con molti tipi di cellule e fonti ed inoltre è compatible con diverse tipologie di scaold 3D porosi; facile da assemblare, garantisce una semina cellulare uniforme, un' e ciente apporto di sostanze nutritive alle cellule e rimozione di metaboliti. Migliora i processi di riproducibilità minimizzando le operazioni manuali da parte degli utenti che lo utilizzano.
Figura 5.20: Bioreattore a perfusione U-CUP prodotto dalla Cellec Tra le possibili applicazione troviamo:
Digestione enzimatica cellulare (ad esempio RT-PCR, FACS)
Ingegnerizzazione di costrutti tissutali impiegati per analisi istologiche in vitro analisi e/o per usi pre-clinici, ad esempio impianti in vivo.
Il dispositivo della Cellec viene impiegato da più di dieci anni come bioreattore per colture cellulari tridimensionali in particolare relativamente ad applicazioni quali ingegnerizzazione del tessuto osseo [34], tessuto vascolare [35], tessuto cartilagineo [36].
L' U-CUP rientra nella categoria dei bioreattori a perfusione ma non rappresenta al momento un prodotto competitivo rispetto al dispositivo presentato in questo lavoro di tesi in quanto, non essendo dotato di una tecnologia micro uidica, rispetto al 3D Gradient Maker, non garantisce lo sviluppo all'interno del sistema stesso di un pro lo di concentrazione tridimensionale oltre che la coltura cellulare.
5.9 Conclusioni
Il Bioreattore 3D Gradient Maker costituisce un sistema in grado di sviluppare al suo interno un pro lo a gradiente tridimensionale rendendolo indispensabile per applicazioni quali l'ingegneria dei tessuti, all'interno della camera di coltura possono essere coltivate cellule su costrutti tridi- mensionali e indotte al processo di dierenziamento una volta sottoposte a determinati stimoli sico-chimici controllati nello spazio e nel tempo e processi di scoperta e sviluppo di nuovi far- maci, attraverso un dosaggio controllato è possibile andare ad analizzare la risposta cellulare. Il bioreattore a gradiente inoltre, date le sue caratteristiche, può essere impiegato per l'ottenimen- to, all'interno della camera di coltura, di matrice geliformi, idrogel, dotate di un gradiente di proprietà meccaniche che variano puntualmente nello spazio; questo tipo di prodotto si inserisce in studi di risposta cellulare a stimoli meccanici, essendo ormai ben noto che la proliferazione cellulare rappresenta un processo fortemente correlato alle proprietà meccaniche del substrato di coltura. La tecnologia micro uidica, dotata di un elevato livello di controllo e di automazione su scala microscopica, rappresenta un'importante strategia per controllare il usso necessario per la generazione di gradienti quanti cabili e riproducibili in grado di in uenzare il comportamento cellulare.
I dati raccolti dai vari report e mostrati in questo capitolo hanno come obiettivo quello di fornire una panoramica su vari settori di mercato tra cui quello dell'Ingegneria Tissutale, dei bioreattori e dei dispositivi micro uidici, per individuare in quale target può essere inserito il prodotto in questione e ridurre al minimo i rischi che si potrebbero avere commercializzandolo. L' analisi di mercato ore un quadro di riferimento della situazione in cui si intende operare, che fornisce una serie di dati statistici di mercato, sui possibili acquirenti dell'area esaminata e che propone una stima dei fatturati realizzabili.
Con i dati mostrati si è cercato di svolgere un'analisi attenta e dettagliata al ne di valutare le potenzialità e i limiti del mercato in cui ci si vuole inserire, quanti care e localizzare il target a cui è rivolto il prodotto che viene proposto e tener conto dei competitor e del loro modus operandi.
Dai dati raccolti emerge che nell' ambito dell'innovazione tecnologica legata alla bio-ingegneria tissutale, quello dei dispositivi micro uidici rappresenta sicuramente uno dei settori più promet- tenti sia per gli aspetti scienti ci che per quelli commerciali. La tendenza al loro utilizzo permet- terà di ridurre costi di progettazione e sperimentazione, la facilità del loro impiego ne aiuterà la diusione; i risultati che è lecito attendersi sono senz'altro incoraggianti. Investire sul loro svilup- po, con opportuni fondi ed investimenti, può costituire, soprattutto per le aziende farmaceutiche, un valore aggiunto per la loro aermazione.
E' chiaro che questo lavoro di tesi ha permesso di mettere in risalto le potenzialità che il dispo- sitivo mostra ai ni di un processo di industrializzazione nei campi sopra citati ma al contempo si vuole sottolineare che questo studio rappresenta soltanto il primo step per la realizzazione di un progetto imprenditoriale; per fare questo occorre la sinergia di gure professionali appartenenti ad ambiti accademici diversi, che concorrano alla piani cazione, realizzazione e commercializ- zazione del bioreattore. Questo scenario vede come protagonisti l'ingegnere biomedico per gli aspetti scienti ci e progettuali e professionisti che studiano gli aspetti quantitativi e qualitativi del processo di produzione.
Un possibile scenario che si auspica è quello della realizzazione di un polo di riferimento nel territorio per la crescita di nuove imprese, emanazione di studi accademici di ingegneria biomedica e di economia aziendale; questa prospettiva trova riscontro dal fatto che tutti i report analizzati hanno a riferimento paesi stranieri.
Bibliogra a
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[34] Braccini et al., Stem Cells 2005; Scherberich et al., Stem Cells 2007 [35] Scherberich et al., Stem Cells 2007; Güven et al., Biomaterials 2011 [36] Wendt et al., Biorheology 2006; Santoro et al., Biomaterials 2010
Capitolo 6
Conclusioni
Partendo dallo studio del brevetto del bioreattore 3D Gradient Maker, sviluppato dal Professor Giovanni Vozzi insieme ai suoi collaboratori Gianni Orsi e Carmelo De Maria, questo lavoro di tesi ha avuto come obiettivo l'analisi dei punti di debolezza del prototipo, e la valutazione di modi che strutturali da applicare al bioreattore, al ne di andare a migliorare e/o risolvere completamente i punti critici mostrati dal sistema, in modo da validare il prototipo e tradurre questo studio accademico in un dispositivo commercializzabile impiegato per la sperimentazione dei farmaci e per la ricerca nei settori dei biomateriali e della medicina rigenerativa.
Il lavoro si è quindi focalizzato sulla riprogettazione del sistema di chiusura del dispositivo in quanto è risultato l'aspetto che ri ette i maggiori limiti del prototipo sviluppato precedentemente con conseguente revisione del metodo di realizzazione dello stampo del dispositivo; di quest'ultimo infatti è stata mantenuta l'idea di piani perpendicolari di mixing del sistema micro uidico per garantire la formazione del gradiente di concentrazione tridimensionale mentre, è stata totalmente rivoluzionata la struttura del bioreattore in modo da garantire una chiusura ermetica del sistema. Il lavoro di tesi si è quindi articolato nel seguente modo: progettazione di uno stampo per l'ottenimento di un sistema di chiusura completo in PDMS, a calzino, con cui andare a serrare i canali realizzati mediante laser su una lastra di plexiglass.
Sono state eettuate delle simulazioni tramite il software Comsol 4.3b® per l'analisi a ele- menti niti, modulo Structural Mechanics, per la simulazione del comportamento meccanico della struttura a calzino del PDMS; ciò che si cercava di veri care con tali simulazioni era di- mostrare che le pressioni che si sviluppano nella struttura fossero tali da bilanciare le pressioni sviluppate all'interno del sistema micro uidico al ne di garantire la tenuta della chiusura in PDMS sui canali in plexiglass.
Successivamente è stata arontata la parte di progettazione, mediante Software CAD Auto- desk Inventor 2012® degli stampi, per l'ottenimento della chiusura in silicone, e realizzazione sica degli stampi, prima in PLA poi in ABS ed in ne in alluminio.
Il sistema è stato testato con prove di portata al ne di confermare i risultati forniti dalle simulazioni; l'obiettivo ssato è stato di ottenere una chiusura dei canali tali da garantire la completa tenuta del sistema micro uidico.
I risultati ottenuti dalla prova di portata purtroppo mostrano una non perfetta tenuta della chiusura sui canali; sono stati mandati in ingresso al sistema due uidi (acqua colorata di due colori dierenti) e ciò che è stato osservato è che avviene eettivamente il mescolamento delle due soluzioni attraverso il pattern micro uidico. I problemi che si sono riscontrati, relativi ad una non perfetta tenuta del sistema, sono attribuibili a due aspetti principali: il primo è che con il tipo di stampo realizzato per l'ottenimento della chiusura in silicone, ci sono delle di coltà nella fase di estrazione di questo dall'anima dello stampo; come mostrato dalle immagini infatti
non è stato possibile ottenere una chiusura che serrasse completamente il circuito micro uidico a causa di cricche che hanno portato alla rottura dello spessore di silicone. Un secondo aspetto può essere correlato al non perfetto stretching della chiusura sul plexiglass, come invece simulato durante gli studi analitici, che quindi si è tradotto con la presenza di aria tra chiusura e canali.
Per risolvere queste due problematiche c'è la possibilità di pensare un diverso stampo per l'ottenimento della chiusura in PDMS che non preveda l'estrazione del silicone dall'anima dello stampo mediante scivolamento, che si è dimostrato essere una tecnica di coltosa e problema- tica; è possibile pensare di realizzare due strati diversi di chiusura, preparati separatamente e successivamente serrati in modo da ottenere una chiusura completa.
Questo sistema di chiusura dei canali micro uidici, ricavati con tecnica laser su una lastra di Plexiglass risulta di cilmente applicabile alla geometria più complessa che caratterizza il 3D Gradient Maker per questo è stato indispensabile studiare un possibile modo per poter chiudere i canali del dispositivo in modo da garantire la tenuta del sistema, mantenendo invariate le caratteristiche principali del prototipo che sono tali da garantire, all'interno della camera di coltura, la formazione di un gradiente di concentrazione. Sono state fatte considerazioni sulla fattibilità del dispositivo in merito a costi e metodi di fabbricazione.
Nella successiva fase di ricerca e sviluppo di questo lavoro di tesi, è stato impostato uno studio sulla robustezza del gradiente di concentrazione chimica 3D in formazione nella camera di coltura del bioreattore 3D Gradient Maker.
L'obiettivo di questa analisi è stato quello di veri care se sbilanciamenti nella taratura delle due pompe peristaltiche, impiegate per alimentare il sistema micro uidico del nostro dispositivo, potessero in uenzare e/o alterare il gradiente chimico presente nel dispositivo stesso ed in caso aermativo capire di quale entità fossero tali variazioni.
E' stato quindi impostato uno studio uidodinamico del nostro sistema, mediante software Comsol Multiphysics®, attraverso il quale è stato possibile andare a ricavare i valori di concen- trazione che si instaurano all'interno della camera di coltura, impostando sia i valori di concen- trazione in ingresso al sistema che i valori di portata; è stato scelto ragionevolmente di impostare una variazione del 10%, positiva e negativa, rispetto al valore ottimale da noi scelto.
Successivamente sono state selezionate tre diverse slices, una per ciascun piano x-y-z, presenti nel dominio di interesse, da cui è stato possibile ricavare puntualmente i valori di concentrazione in funzione delle coordinate del piano; lo step successivo è stato calcolare le variazioni percentuali di tali concentrazioni, in funzione della variazione di portata, rispetto al caso ottimale (il parametro a de nito in fase di simulazione è ciò che determina la variazione di +/-10%).
Dall'analisi dei dati e delle immagini ottenute in Matlab® è stato possibile aermare che variazione di +/-10% della portata rispetto al valore ottimale non producono cambiamenti si- gni cativi sul pro lo di concentrazione 3D che si viene a creare nel bioreattore per questo, è possibile dire che sono accettabili variazioni di portata dovuti a sbilanciamenti sulla taratura dei sistemi di alimentazione del circuito micro uidico in quanto è stato dimostrato che questi ultimi non alterano signi camente il pro lo di concentrazione che il dispositivo in questione è in grado di garantire all'interno della camera di coltura. Inoltre, come previsto e desiderato, il valore di concentrazione ricavato al centro di ciascuna delle slices selezionate nella camera di coltura, risulta eettivamente essere il valore medio tra i due valori di concentrazione imposti in ingresso al sistema micro uidico.
In ultimo, è stato condotto uno studio sull'analisi di mercato, realizzato con dati da vari report che hanno avuto come obiettivo quello di fornire una panoramica su vari settori di mercato tra cui quello dell'Ingegneria Tissutale, dei bioreattori e dei dispositivi micro uidici, per individuare in quale target può essere inserito il prodotto in questione e ridurre al minimo i rischi che si potrebbero avere commercializzandolo. L' analisi di mercato ore un quadro di riferimento della
situazione in cui si intende operare, che fornisce una serie di dati statistici di mercato, sui possibili acquirenti dell'area esaminata e che propone una stima dei fatturati realizzabili.
Con i dati mostrati si è cercato di svolgere un'analisi attenta e dettagliata al ne di valutare le potenzialità e i limiti del mercato in cui ci si vuole inserire, quanti care e localizzare il target a cui è rivolto il prodotto che viene proposto e tener conto dei competitor e del loro modus operandi.
Dai dati raccolti emerge che nell' ambito dell'innovazione tecnologica legata alla bio-ingegneria tissutale, quello dei dispositivi micro uidici rappresenta sicuramente uno dei settori più promet- tenti sia per gli aspetti scienti ci che per quelli commerciali. La tendenza al loro utilizzo permet- terà di ridurre costi di progettazione e sperimentazione, la facilità del loro impiego ne aiuterà la diusione; i risultati che è lecito attendersi sono senz'altro incoraggianti. Investire sul loro svilup- po, con opportuni fondi ed investimenti, può costituire, soprattutto per le aziende farmaceutiche, un valore aggiunto per la loro aermazione.
E' chiaro che questo lavoro di tesi ha permesso di mettere in risalto le potenzialità che il dispo- sitivo mostra ai ni di un processo di industrializzazione nei campi sopra citati ma al contempo si vuole sottolineare che questo studio rappresenta soltanto il primo step per la realizzazione di un progetto imprenditoriale; per fare questo occorre la sinergia di gure professionali appartenenti ad ambiti accademici diversi, che concorrano alla piani cazione, realizzazione e commercializ- zazione del bioreattore. Questo scenario vede come protagonisti l'ingegnere biomedico per gli aspetti scienti ci e progettuali e professionisti che studiano gli aspetti quantitativi e qualitativi del processo di produzione.
Un possibile scenario che si auspica è quello della realizzazione di un polo di riferimento nel territorio per la crescita di nuove imprese, emanazione di studi accademici di ingegneria biomedica e di economia aziendale; questa prospettiva trova riscontro dal fatto che tutti i report analizzati hanno a riferimento paesi stranieri.
Capitolo 7
Appendice
Figura 7.2: Tavola per stampo in ABS: chiusura frontale
Figura 7.4: Tavola per stampo in alluminio: chiusure laterali
Figura 7.6: Tavola per stampo in alluminio: chiusura posteriore
Figura 7.8: Tavola per anima stampo in alluminio
Figura 7.10: Tavola per nuova chiusura in plexiglass