Analisi funzionale dei frammenti di delezione del promotore di TaPDIL1-1

Sulla base della posizione dei diversi motivi individuati sono stati disegnati quattro diversi primer senso (AF4, AF5, AF6 e AF7) ed un unico primer antisenso (AR4), localizzato a 14 pb dall’ATG (Fig. 5.18). I 4 primer senso sono stati disegnati in modo da inserire, all’estremità 5’ della sequenza del promotore della TaPDIL1-1 a cui sono complementari, un sito di restrizione per PstI (CTGCA*G), mentre il primer antisenso è stato disegnato in modo da inserire un sito di restrizione per XbaI (T*CTAGA) all’estremità 3’ dei frammenti del

promotore (Fig. 5.18). L’aggiunta di questi due siti di restrizione era necessaria per le successive fasi di clonaggio perchè, nella sequenza del promotore non erano presenti siti di restrizione adatti. Le combinazioni di primer usate sono state: AF4-AR4 (1278 pb), AF5-AR4 (901 pb), AF6-AR4 (561 pb) e AF7-AR4 (430 pb); il numero tra parentesi si riferisce alla lunghezza in pb dei 4 differenti frammenti di delezione progressivi del promotore amplificati dalle relative coppie di primer (Fig. 5.18).

1 pUC8/GUS 4983bp UidA pUC8 NOS 3' HindIII (1) SphI (7) PstI (13) XbaI (25) EcoRI (2183)

Fig. 5.19 - Mappa del plasmide ricombinante pUC8/GUS ottenuto ligando il frammento contenente la sequenza del plasmide pUC8 e il frammento contenente la sequenza del gene UidA assieme a quella del terminatore NOS 3’. Sono stati riportati i siti di restrizione usati durante le fasi di subclonaggio e due ulteriori siti, HindIII (1) e SphI (7). Il sito PstI (13) e il sito EcoRI (2170) sono stati usati nella costruzione del plasmide pUC8/GUS. I siti di restrizione PstI (13)e XbaI (25) sono stati usati in seguito per subclonare i diversi frammenti di delezione del promotore e sono evidenziati, rispettivamente, in blu e rosso.

I 4 diversi frammenti di delezione del promotore, dopo essere stati amplificati con le quattro coppie di primer e tagliati con gli enzimi di restrizione PstI e XbaI, sono stati purificati da gel e inseriti uno per volta, tramite clonazione direzionale (5’ PstI-XbaI 3’), nel plasmide pUC8/GUS a monte del gene UidA (Fig. 5.19).

Il plasmide pUC8/GUS è stato ottenuto digerendo il plasmide pAHC25 (Christensen e Quail, 1996) con gli enzimi EcoRI e PstI e ligando due dei frammenti di restrizione ottenuti e purificati da gel, quello di circa 2800 pb, comprendente la sequenza del plasmide pUC8, e quello di circa 2200 pb, contenente la sequenza del gene UidA seguita dal terminatore NOS (Fig. 5.20).

1 pAHC25 9859bp NOS 3' Ubi-int UidA NOS 3' Ubi-int bar pUC8 HindIII (1) SphI (7) PstI (13) EcoRI (1404) PstI (1999) EcoRI (4169) XbaI (2005) PstI (4187) EcoRI (5578) PstI (6173) PstI (6776) EcoRI (7059)

Fig. 5.20 - Mappa del plasmide pAHC25 (Christensen e Quail, 1996). Sono riportati tutti i siti di restrizione EcoRI e PstI presenti nel plasmide oltre al sito XbaI (2005), che nel nuovo plasmide pUC8/GUS si trova 25 pb dopo il sito HindIII (1). I siti di restrizione PstI (13) e EcoRI (7059) delimitano il frammento di 2800 pb circa contenente la sequenza del plasmide pUC8, utilizzata come scheletro di base nel plasmide pUC8/GUS, mentre il sito PstI (1999) e il sito EcoRI (4169) delimitano il frammento di 2170 pb, contenente la sequenza del gene UidA e quella del terminatore NOS.

Sono stati così ottenuti i 4 plasmidi finali: pPDI1278-GUS (Fig. 5.21), pPDI901-GUS, pPDI561-GUS e pPDI430-GUS, la cui autenticità è stata confermata mediante analisi di sequenza. I numeri in grassetto si riferiscono alla lunghezza della sequenza regolatrice usata. Questi quattro plasmidi possiedono, quindi, tutti la medesima struttura di base, costituita dalla sequenza del plasmide pUC8, dalla sequenza codificante del gene UidA e da quella del terminatore NOS, mentre differiscono solo per la diversa lunghezza della sequenza regolatrice derivata dal promotore di TaPDIL1-1.

Le quattro sequenze regolatrici di diversa lunghezza, prodotte mediante delezione progressiva della sequenza del promotore all’estremità distale 5’, pur essendo caratterizzate dalla presenza di un numero variabile di elementi regolatori, comprendono tutte le medesime 430 pb dell’estremità prossimale 3’. In particolare la sequenza regolatrice di dimensioni minori, ottenuta dall’amplificazione del promotore con la coppia di primer AF7-AR4, è costituita solo da queste 430 pb prossimali. Questo permetterà di identificare la regione minima della sequenza regolatrice necessaria per l’espressione nelle cariossidi in via di sviluppo ed eventuali effetti additivi esplicati dagli elementi progressivamente eliminati.

1 pPDI1278-GUS 6251bp UidA pUC8 NOS 3' PDI-1278 HindIII (1) SphI (7) PstI (13) XbaI (1293) EcoRI (3451)

Fig. 5.21 - Mappa del più grande dei quattro plasmidi per lo studio del promotore, pPDI1278-GUS. In giallo è rappresentata la sequenza regolatrice di 1278 pb, contenente tutti gli elementi regolatori ad oggi identificati. I restanti tre plasmidi hanno una mappa di restrizione identica, eccetto per la lunghezza della sequenza regolatrice inserita tra i siti di restrizione PstI e XbaI.

Il primo frammento di delezione, amplificato con la prima coppia di primer (AF4- AR4) è quello di dimensioni maggiori (1278 pb) e contiene tutti gli elementi regolatori identificati nel promotore (4 elementi GCN4-like, Skn-1, ACGT, Ry-element, AACA e due prolamin box; Fig. 5.18). Al secondo frammento di delezione, amplificato con la coppia di primer AF5-AR4 e lungo 901 pb, manca, rispetto al primo, il prolamin box distale e il motivo AACA. Il terzo frammento di delezione è lungo 561 pb ed è stato amplificato con la coppia di primer AF6-AR4; oltre al prolamin box distale e al motivo AACA mancano il RY-element e il primo dei quattro motivi GCN4-like. Infine l’ultimo frammento, amplificato con la coppia di primer AF7-AR4, è lungo 430 pb e mancano il prolamin box distale, il motivo AACA, il RY-element, il motivo Skn-1 e tre motivi GCN4-like, mentre contiene i seguenti elementi regolatori: un elemento GCN4-like, un elemento ACGT ed il prolamin box prossimale.

È possibile ipotizzare che il frammento di 430 pb (AF7-AR4), con i suoi motivi (GCN4, prolamin box, ACGT), possa conferire una significativa espressione nell’endosperma. Ciò potrebbe anche non succedere se la mancanza del motivo AACA non fosse compensata dalla presenza, accanto al motivo GCN4, del prolamin box e del motivo ACGT. In questo caso, infatti, il minimo frammento funzionale potrebbe essere quello di 560 pb (AF6-AR4), in quanto contiene tre copie del motivo GCN4, ammesso, ovviamente, che tutti i tre motivi siano funzionali. Questo secondo frammento potrebbe anche avere una forza maggiore, rispetto a quello di 430 pb, per la presenza dell’elemento Skn-1. Un aumento di

forza del promotore potrebbe inoltre derivare dalla presenza, nei restanti due frammenti, di un ulteriore motivo GCN4-like e del prolamin box distale. È tuttavia possibile che solo il motivo di dimensioni maggiori (F4-R4) sia funzionale, in quanto questo contiene l’unico motivo AACA identificato mediante il programma PlantCARE. Questo motivo risulta più conservato nella sequenza regolatrice del gene della PDI localizzato sul cromosoma 4B, mentre nei cromosomi 4A e 4D presenta alcune sostituzioni di basi. Anche altri motivi presentano differenze nucleotidiche tra le regioni regolatrici dei tre geni omeologhi, alcuni sono invece perfettamente conservati. Considerando però che i tre promotori non differiscono significativamente nella regolazione della trascrizione a livello delle cariossidi in via di sviluppo, è possibile ipotizzare che le mutazioni del motivo AACA non ne riducano la funzionalità o che questo motivo non sia essenziale in questo promotore. Lo stesso vale per i motivi GCN4 ripetuti. Ad oggi queste sono solo congetture e, vista la complessità di un’analisi di questo genere, l’individuazione di una regione minima funzionalmente attiva per l’elevata espressione nelle cariossidi in via di sviluppo permetterà una prima valutazione delle ipotesi fatte. Successive analisi funzionali potranno essere effettuate sulla regione minima, provocando mutazioni di basi mirate a compromettere la funzionalità dei singoli motivi individuati. Sarà anche interessante, una volta identificati i motivi essenziali, verificare eventuali differenze presenti a livello di sequenza nucleotidica tra le tre sequenze regolatrici della PDI. Questo permetterebbe di individuare, infatti, eventuali variazioni dei motivi responsabili del diverso profilo di espressione della PDI in tessuti quali spighe, foglie e radici. In tutto questo è importante considerare la possibilità che ci siano ulteriori motivi regolatori, non ancora identificati, responsabili dell’espressione endosperma specifica.

5.10. Co-trasformazione della cultivar MPB-Bobwhite 26 per la sovra-espressione di