Isolamento di sequenze cDNA “Full Length” mediante RACE

Per l’isolamento dei trascritti completi relativi alle diverse sequenze consenso parziali (tentative consensus sequences) ottenute dalla ricerca in banca dati “TIGR wheat gene index”, mediante RACE (Rapid Amplificacion of cDNA ends), è stato usato il GeneRacerTM Kit (Invitrogen). Il sistema permette di ottenere solamente trascritti “full length” mediante l’eliminazione selettiva di mRNA parziali dal processo di amplificazione. In una prima fase l’RNA è trattato con fosfatasi intestinale di vitello (CIP) per rimuovere il fosfato libero all’estremità 5’ degli mRNA parziali o di altri acidi nucleici, eliminando la possibilità di aggiungere, alle estremità di questi acidi nucleici, una breve sequenza di nucleotidi (GeneRacerTM Oligo), che serve da stampo per l’amplificazione dell’estremità 5’ della sequenza parziale cDNA. Naturalmente la reazione di defosforilazione effettuata mediante CIP non ha avuto alcun effetto su mRNA dotati del cap (7-metilguansina) all’estremità 5’. All’RNA defosforilato è stata aggiunta la pirofosfatasi acida di tabacco (TAP) per rimuovere dagli mRNA completi il cap all’estremità 5’, rendendo disponibile il gruppo fosfato legato al carbonio 5’ del ribosio, necessario per la reazione di ligasi con il GeneRacerTM Oligo. L’mRNA è stato quindi retrotrascritto utilizzando l’enzima SuperscriptTM II Reverse Transcriptase (RT) e il GeneRacerTM Oligo dT Primer, che contiene all’estremità 3’ una sequenza di 36 bp che serve da stampo per l’amplificazione dell’estremità 3’ non conosciuta della sequenza cDNA parziale. La reazione di trascrittasi inversa ha permesso di ottenere singoli filamenti di cDNA alle cui estremità 5’ e 3’ erano presenti siti di “annealing” conosciuti. Per ottenere l’estremità 5’ non conosciuta della sequenza cDNA, il primo filamento cDNA è stato amplificato mediante PCR utilizzando un primer specifico (Reverse GSP), disegnato sul filamento 3’-5’ della sequenza parziale, e il “GeneRacerTM 5’ Primer”

(omologo al GeneRacerTM RNA Oligo). In questo caso solo gli mRNA che avevano all’estremità 5’ la sequenza oligonucleotidica GeneRacerTM RNA Oligo e che erano stati completamente retrotrascritti sono stati amplificati mediante PCR. Analogamente, per ottenere l’estremità 3’sconosciuta della sequenza parziale cDNA, il primo filamento cDNA è stato amplificato utilizzando un primer specifico disegnato sul filamento 5’-3’ (Forward GSP) della sequenza parziale ed il primer omologo al “GeneRacerTM Oligo dT Primer” (GeneRacerTM 3’ Primer). Solo gli mRNA che possedevano una coda di poli (A) e che sono stati retrotrascritti venivano amplificati mediante PCR. Per aumentare la specificità e la sensibilità della RACE sono state condotte ulteriori amplificazioni utilizzando dei primer “nested” specifici sia per la sequenza cDNA parziale che per i siti di annealing alle estremità 5’ e 3’. L’autenticità dei prodotti RACE è stata successivamente verificata mediante analisi di sequenza ed i trascritti completi dei geni PDI-like sono stati successivamente ottenuti, mediante RT-PCR su mRNA estratto da cariossidi immature, utilizzando primer specifici disegnati basandosi sulle sequenze delle regioni non tradotte alle estremità 5’ e 3’. Nei prossimi paragrafi verranno descritte in maggior dettaglio le diverse fasi del sistema RACE utilizzato.

4.5.1. Defosforilazione

La reazione di defosforilazione è stata condotta in un volume di 10 µL contenente 200 ng di mRNA, 1 µL del tampone di reazione 10X (CIP Buffer), 40 unità di inibitore della RNasi (RNaseOutTM) e 10 unità dell’enzima CIP ed incubata a 50°C per 1 ora. Per la precipitazione dell’RNA defosforilato sono stati aggiunti 90 µL di acqua DEPC e 100 µL di fenolo-cloroformio, agitando il tutto vigorosamente per 30 secondi mediante vortex. Quindi è stato centrifugato alla massima velocità a temperatura ambiente per 5 minuti. Dopo aver trasferito la fase acquosa (circa 100 µL) in una nuova provetta, sono stati aggiunti 2 µL di “mussel glycogen” (glicogeno di militi) (10mg/mL), 10 µL di sodio acetato 3 M a pH 5,2 e 220 µL di etanolo al 95%, agitando il tutto velocemente mediante vortex. La provetta è stata quindi lasciata in ghiaccio secco per 10 minuti e successivamente centrifugata alla massima velocità per 20 minuti a 4 °C e, dopo aver eliminato il supernatante, sono stati aggiunti 500 µL di etanolo al 70%. Infine, dopo un’ultima centrifugazione di 2 minuti a 4°C, è stato rimosso l’etanolo ed il pellet è stato asciugato all’aria e quindi risospeso in 7 µL di acqua DEPC.

4.5.2. Rimozione del cap dall’estremità 5’ degli mRNA completi.

La rimozione del cap è stata effettuata mediante l’enzima pirofosfatasi acida di tabacco (TAP) in una reazione con volume finale di 10 µL. All’RNA defosforilato e risospeso in 7 µL di acqua DEPC sono stati aggiunti 1 µL del tampone di reazione 10x (TAP Buffer), 40 unità di inibitore della RNasi (RNaseOutTM) e 0,5 unità dell’enzima TAP. Il campione è stato incubato a 37°C per 1 ora e successivamente l’RNA è stato precipitato come descritto nel paragrafo precedente.

4.5.3. Reazione di ligasi del GeneRacerTM Oligo agli mRNA completi privati del cap all’estremità 5’

Alle provette contenenti l’oligo RNA GeneRacerTM, liofilizzato e prealiquotato (0,25 µg), sono stati aggiunti 7 µL di RNA defosforilato e trattato con l’enzima TAP per l’eliminazione del cap. Una volta risospeso l’oligo RNA, il tutto è stato incubato a 65°C per eliminare eventuali strutture secondarie dell’RNA. Dopo raffreddamento in ghiaccio per circa 2 minuti, per la reazione di ligasi, in un volume finale di 10 µL, sono stati aggiunti: il tampone di reazione 10X (Ligase Buffer), 10mM ATP, 40 unità di inibitore della RNasi (RNaseOutTM) e 5 unità dell’enzima T4 RNA ligasi. Dopo una breve centrifugazione, le provette sono state incubate a 37°C per 1 ora, quindi di nuovo brevemente centrifugate e poste in ghiaccio. L’RNA è stato precipitato come già descritto nel paragrafo 4.5.1.

4.5.4. Trascrittasi inversa

Per la reazione di trascrittasi inversa è stato utilizzato l’enzima SuperscriptTM II RT e come primer il “GeneRacerTM Oligo dT Primer”. Questo primer, lungo 54 bp, contiene una coda di poliT di 18 nucleotidi, che serve da innesco per la reazione di trascrittasi inversa, ed una sequenza all’estremità 5’ di 36 bp, che contiene i siti di legame per i primer GeneRacerTM 3’ e GeneRacerTM 3’ Nested, che vengono utilizzati in seguito per l’amplificazione PCR. La reazione di trascrittasi inversa è stata condotta in un volume di 20 µL contenente l’RNA ligato con l’oligo RNA GeneRacerTM, 1mM dATP, dTTP, dCTP e dGTP, 2,5 µM GeneRacerTM Oligo dT Primer, il tampone di reazione 5X (First Strand Buffer), 40 unità di inibitore della RNasi (RNaseOutTM) e 200 unità dell’enzima SuperscriptTM II RT. Dopo un pre-trattamento dell’RNA a 65°C per 5 minuti, le provette contenenti tutti i reagenti sono state incubate a

42°C per 50 minuti, prima di essere poste a 70°C per 15 minuti per inattivare l’enzima. Dopo raffreddamento in ghiaccio per 2 minuti ed una breve centrifugazione sono state aggiunte 2 unità di RNasi H e la miscela di reazione è stata incubata a 37°C per 20 minuti per la degradazione dell’mRNA. La miscela di reazione è stata usata immediatamente per l’amplificazione del primo filamento cDNA o conservata a -20°C.

4.5.5. Amplificazione mediante PCR delle estremità 5’ e 3’ delle sequenze cDNA

Le estremità 5’ e 3’ delle sequenze cDNA parziali sono state ottenute amplificando il primo filamento di cDNA utilizzando due coppie di primer, ognuna costituita da una sequenza oligonucleotidica gene-specifica (Reverse o Forward GSP, rispettivamente per le estremità 5’ e 3’) e dal primer GeneRacerTM 5’o GeneRacerTM 3’, rispettivamente omologhi alle sequenze aggiunte alle estremità 5’ e 3’ dei trascritti completi GeneRacerTM RNA Oligo e GeneRacerTM Oligo dT.

Nel disegnare i primer gene-specifici sono state seguite le seguenti condizioni:

- il contenuto in GC doveva essere compreso tra 50-70% in modo da ottenere una elevata temperatura di annealing (>72°C);

- la lunghezza dei primer doveva essere compresa tra 23-28 nucleotidi per aumentare la specificità di legame e quindi della reazione;

- i primer dovevano comunque avere un basso contenuto in GC all’estremità 3’, per impedire che la DNA polimerasi iniziasse la sua attività partendo da siti non-specifici; - doveva essere evitata la presenza di sequenze complementari all’interno dei GSP o tra

questi e i primer dati in dotazione con siti di annealing alle estremità 5’ e 3’:

- i primer dovevano avere una temperatura di annealing maggiore di 72°C, per aumentare la specificità di legame, riducendo quindi eventuali amplificazioni non specifiche.

La reazione di amplificazione è stata condotta in un volume di 50 µL contenente 0,6 µM GeneRacerTM 5’ o 3’ Primer, 0,2 µM primer gene specifici (GSP Reverse o Forward), il tampone di reazione 10X (High Fidelity PCR Buffer; Invitrogen), una concentrazione pari a 300 µM di ciascun dNTP, 1 mM di MgSO4, 0,25 unità di enzima (Taq DNA polymerase High Fidelity, Invitrogen) ed 1 µL della reazione di trascrittasi inversa come templato. Per aumentare la specificità e l’efficienza delle reazioni PCR è stato utilizzato un sistema di amplificazione definito “Touchdown PCR”, che consiste nell’utilizzare, durante i primi cicli di amplificazione, temperature di annealing più elevate di quelle specifiche dei primer utilizzati e, nei cicli successivi, temperature di annealing leggermente più basse. Dopo una

iniziale denaturazione a 94°C per 2 minuti, sono seguiti una prima serie di 5 cicli di amplificazione così composti: 94°C per 30 secondi, 72°C per 2 minuto e 30 secondi; una seconda serie di altri 5 cicli così composti: 94°C per 30 secondi, 70°C per 2 minuti e 30 secondi; ed infine una terza serie di 25 cicli ciascuno cosi costituito: 94°C per 30 secondi, 65°C per 30 secondi e 68°C per 2 minuti, a cui seguiva un passaggio finale di estensione di 68°C per 10 minuti.

Successivamente sono state condotte ulteriori amplificazioni utilizzando come stampo 1 µL della prima reazione di amplificazione e dei primer “nested” specifici sia per la sequenza parziale cDNA che per i siti di annealing alle estremità 5’ e 3’, adottando le stesse condizioni descritte precedentemente.

Dopo separazione elettroforetica su gel di agarosio 1,5%, i diversi prodotti RACE sono stati purificati, clonati e sequenziati.