Ruolo funzionale dei motivi regolatori individuati nel promotore d

Il ruolo di alcuni degli elementi regolatori di tipo cis individuati nel promotore di TaPDIL1-1 nell’espressione endosperma specifica è stato dimostrato attraverso l’analisi funzionale, basata su esperimenti di perdita di funzione (loss of function) e di ripristino di funzione (gain of function). Inizialmente le analisi dei promotori di geni preferenzialmente

espressi nei semi e nell’endosperma di specie cerealicole sono state eseguite in sistemi eterologhi, usando piante dicotiledoni come il tabacco, più facili da trasformare e rigenerare. Va considerata, tuttavia, la possibilità che la regolazione spaziale e temporale dell’espressione genica possa non essere mantenuta in un background genetico eterologo (Hirano et al., 1995b; Grosset et al., 1997; Leisy et al., 1989). Bisogna considerare, infatti, che la regolazione dell’espressione genica dipende non solo da vari elementi “cis-acting” prossimali alla sequenza codificante, ma anche da elementi “trans-acting” localizzati in posizioni anche molto lontane dalla regione codificante e dalle sue sequenze regolatrici prossimali. È quindi più affidabile ed auspicabile l’uso di sistemi omologhi. La messa a punto di protocolli efficienti di trasformazione anche per alcune specie monocotiledoni ha permesso di eseguire l’analisi funzionale anche in queste piante. Il riso, in particolare, è diventato la specie modello per le monocotiledoni anche per questo tipo di studi (Digeon et al., 1999). Avendo a disposizione un protocollo di trasformazione efficiente per il frumento, è stato deciso di effettuare l’analisi funzionale del promotore della PDI classica di frumento nella stessa specie per ridurre al minimo la possibilità di ottenere profili di espressione aberranti e per verificare direttamente il funzionamento dei diversi frammenti regolatori, ottenuti per delezioni successive della regione distale, in frumento.

L’abbondanza di informazioni relative al funzionamento in piante transgeniche dei motivi regolatori individuati permette di fare alcune ipotesi sul possibile ruolo dei diversi frammenti di delezione della sequenza promotrice della TaPDIL1-1 nel regolare l’espressione del gene reporter UidA in frumento transgenico e, sulla base di queste, di impostare un adeguata strategia sperimentale. I diversi motivi regolatori sembrano contribuire in maniere diversa al profilo di espressione finale del promotore di cui fanno parte. GCN4 e prolamin box sono motivi conservati nei promotori di molti geni codificanti per proteine di riserva di diversi cereali, quali mais, riso, frumento, orzo, avena e sorgo (Müller e Knudsen, 1993). Nei promotori di molti geni codificanti per prolammine è presente un numero limitato di motivi conservati, tra i quali il più conservato è un elemento di 25 pb situato a circa 300 pb a monte del codone di inizio della traduzione (Kreis et al., 1985). Questo elemento conservato, definito “endosperm box”, consiste di un prolamin-box e di un motivo GCN4-like situati a pochi nucleotidi di distanza l’uno dall’altro. L’analisi funzionale dell’endosperm box di una γ-zeina ha dimostrato l’importanza di entrambi i motivi per la massima espressione endosperma specifica di questo gene in mais (Marzàbal et al., 1998). È interessante notare che nella regione prossimale del promotore della HMWG della subunità Dx5 (PrHMWG-Dx5) è presente un “endosperm box” atipico, in cui manca il motivo GCN4-like ed è invece presente

un motivo G-box like. In mais transgenico è stato dimostrato che un frammento di 89 pb, comprendente questo “endosperm box” atipico, è responsabile dell’espressione endosperma specifica (Norre et al., 2002). AACA è un terzo motivo coinvolto nell’espressione endosperma specifica e risulta conservato in tutti i promotori dei geni codificanti per le gluteline isolati fino ad ora in riso (Takaiwa et al., 1996; Washida et al., 1999). Anche questo motivo risulta strettamente associato al motivo GCN4-like. Questi due elementi insieme sono capaci di conferire un’espressione endosperma specifica al promotore 35S di CaMV troncato a -90 (Yoshihara et al., 1996). È importante sottolineare che questo frammento del promotore virale contiene, in aggiunta al TATA box, anche un elemento G-box like (as-1) (Washida et al., 1999). Il motivo ACGT presente nel promotore della PDI classica ha la sequenza consenso GTACGTG, identica a quella presente nel promotore del gene GluB-1 di riso (Washida et al., 1999). Da analisi funzionali di questo promotore è emerso che una regione promotrice minima di 197 pb a monte della sequenza trascritta e contenente 4 motivi regolatori (GCN4, AACA, ACGT e prolamin-box), è sufficiente a garantire un’espressione endosperma specifica in piante di riso transgeniche (Wu et al., 1998). I diversi elementi sembrano comunque contribuire in maniera diversa all’espressione endosperma specifica, il motivo GCN4, in particolare, risulta di centrale importanza. La mutazione di una base all’interno della sequenza consenso di questo motivo nella regione promotrice minima di 197 pb ha determinato una riduzione significativa dell’attività del promotore e l’alterazione del profilo di espressione nell’endosperma (Wu et al., 1998). È stato dimostrato, inoltre, che copie multiple ripetute a tandem di questo elemento hanno prodotto, in piante di riso transgenico, un profilo di espressione simile al promotore nativo (Wu et al., 1998). Anche i tre elementi restanti, AACA, prolamin-box e ACGT sono necessari a garantire la massima attività della regione del promotore di 197 pb, esercitando un effetto quantitativo sulla regolazione dell’espressione. Sostituzioni di basi in questi motivi hanno avuto come conseguenza una diminuzione o addirittura la perdita (AACA) dell’attività della regione promotrice di 197pb, evidenziando l’importanza di questi motivi per la sua massima attività (Wu et al., 2000). Nessuno di questi motivi, in forma multimerica ed associato al promotore -46 di CaMV 35 S, contenente il solo TATA box, è però in grado di conferire un’attività trascrizionale individuabile, verosimilmente perché essi hanno un effetto quantitativo sull’espressione nell’endosperma, ma non sono in grado di determinare da soli, a differenza del motivo GCN4, un’espressione endosperma specifica. GCN4 è l’unico motivo, quindi, necessario e sufficiente per determinare l’espressione endosperma specifica quando è presente in copie multiple. Anche la presenza di un motivo GCN4 associato ad AACA o ad un prolamin-box risulta

insufficiente per conferire livelli individuabili di espressione nell’endosperma, mentre una loro dimerizzazione, anche quando c’è l’inversione di una coppia, lo è. Visto che un dimero di GCN4 non è sufficiente a conferire un livello individuabile di espressione in riso transgenico, l’espressione dovuta alla presenza di una doppia coppia GCN4–AACA o GCN4-prolamin box è legata ad un effetto combinato tra i motivi. La combinazione AACA, ACGT e prolamin box, invece, è inattiva in riso transgenico (Wu et al., 1998). Dai risultati ottenuti con questi esperimenti in riso transgenico è quindi emerso che una combinazione lineare di almeno tre motivi, uno dei quali deve essere GCN4, è la condizione minima per ottenere un’espressione endosperma specifica (Wu et al., 2000). Ad esempio una combinazione di AACA, ACGT e GCN4 è risultata sufficiente a garantire un’espressione del gene GUS in riso transgenico, anche se il livello è risultato molto basso (Wu et al., 2000). Skn-1 è un ulteriore motivo regolatore identificato nel promotore di TaPDIL1-1. Questo motivo, che si trova sovrapposto ad uno degli elementi GCN4 nel promotore della TaPDIL1-1, è anche presente nel promotore del gene GluB-1 e, anche in questo caso, la sua posizione è risultata molto vicina al motivo GCN4. Analisi in tabacco transgenico hanno mostrato che una combinazione di GCN4, AACA e Skn-1 assieme al frammento del promotore 35 S contenete oltre al TATA box l’elemento as-1, è sufficiente a garantire un elevato livello di espressione nei semi in maturazione. Anche in orientamento inverso questa combinazione mantiene la sua funzionalità, nonostante l’attivazione dell’espressione seme specifica risulti ridotta del 60% (Washida et al., 1999). Skn-1 ha un effetto quantitativo sul livello di espressione, in quanto mutazioni introdotte nella sua sequenza provocano una diminuzione del livello di espressione sostanziale, come dimostrato in tabacco (Washida et al., 1999). Infine c’è un ultimo elemento, RY-element, la cui sequenza consenso è CATGCA(C/T) (Dickinson et al., 1988). Questi elementi sono frequenti in promotori seme-specifici di monocotiledoni e dicotiledoni e sono noti anche come “legumin box” (Gatehouse et al., 1986) o “Sph element” (Kao et al., 1996).