Preparazione degli acidi nucleici

4.2.1. Estrazione di DNA nucleare

Il DNA è stato estratto da giovani foglie della cultivar Chinese Spring e delle sue linee aneuploidi nulli-tetrasomiche e ditelosomiche con il metodo descritto da Dvorak et al. (1988), adottando alcune modificazioni. Qui di seguito sono riportate le varie fasi previste nel protocollo di estrazione utilizzato.

- Da 3 a 5 g di materiale vegetale sono stati omogeneizzati in Waring Blender insieme a 45 mL di tampone di estrazione antiossidante (H1) pH 9,5 (Saccarosio 0,5 M; Spermidina 1 mM; Spermina 4 mM; EDTA 10 mM; KCl 80 mM; Tris 10 mM; PMSF (fenil metil sulfonil fluoruro) 1 mM; 0,1% DTT).

- L'omogenato è stato filtrato mediante garza e filtro Miracloth e l'estratto successivamente centrifugato a 3000 rpm per 20 minuti a 4°C per precipitare le cellule.

- Dopo la centrifugazione il supernatante è stato eliminato ed il pellet è stato risospeso in 30 mL del tampone H1, contenente 0,5% di Triton X-100, un detergente che lisa le membrane dei cloroplasti e mitocondri, lasciando intatte quelle dei nuclei.

- Dopo un'ulteriore centrifugazione a 3000 rpm per 20 minuti a 4°C il pellet è stato risospeso in 20 mL del tampone precedente.

- Dopo avere ricentrifugato a 2800 rpm, il pellet è stato risospeso in 1 mL di tampone PDB (NaCl 0,1 M; EDTA 0,1 M; Tris 0,05 M pH8), quindi sono stati aggiunti 300 µL dello stesso tampone contenente lo 0,2% di Proteinasi K ed il campione è stato incubato a 60°C per 30 minuti. In questa fase il detergente (SDS) ha determinato la lisi della membrana nucleare e la Proteinasi K ha degradato le proteine.

- Dopo aver lasciato raffreddare le provette a temperatura ambiente, è stato aggiunto 1/2 volume di fenolo (2,5 mL) per estrarre la frazione proteica. Dopo aver agitato delicatamente, l'emulsione è stata lasciata per tutta la notte a 4°C.

- Il giorno successivo sono stati aggiunti 2 mL di tampone TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) e 2,5 mL di cloroformio; dopo agitazione delicata per evitare la rottura delle molecole di DNA, il campione è stato centrifugato a 5000 rpm per 15 minuti.

- Mediante pipette Pasteur (tagliate in punta in modo da evitare rotture meccaniche del DNA) è stata asportata dal tubo da centrifuga la fase superiore, facendo attenzione a non asportare la fase inferiore (fenolo/cloroformio) e le proteine degradate presenti nell' interfaccia tra le due fasi.

- Il DNA è stato quindi precipitato, aggiungendo alla fase acquosa acetato di sodio 2 M pH 5,5 (1/10 del volume) ed un volume doppio di etanolo assoluto (100%).

- Mediante pipetta Pasteur con punta uncinata è stato prelevato il DNA precipitato ed è stato immerso 4-5 volte in etanolo al 70% per eliminare l'eccesso di sali.

- Il DNA recuperato è stato lasciato asciugare all'aria e quindi risospeso in tampone TE sterile (0,5-1 mL) e conservato a 4°C.

4.2.2. Estrazione di DNA con CTAB

Il materiale vegetale conservato a -80°C è stato liofilizzato e macinato finemente per l’estrazione del DNA. Qui di seguito sono riportate le varie fasi del protocollo di estrazione utilizzato.

- Il tampone di estrazione, composto da 100 mM di Tris a pH 7,5, 700 mM di NaCl, 50 mM di EDTA a pH 8,0, 1% CTAB (Mixed alkyltrimethyl-ammonium bromide; SIGMA M- 7635) e 140 mM di 14 M BME (β-mercaptoethanol), è stato preparato fresco ed è stato riscaldato a 60-65°C poco prima di ogni estrazione.

- Ad ogni provetta contenente il materiale vegetale in polvere sono stati aggiunti 400 µL del tampone di estrazione.

- I campioni sono stati agitati quindi per 90 minuti a 60-65°C in un termostato.

- Dopo 10 minuti di raffreddamento, lasciando i campioni a temperatura ambiente, sono stati aggiunti 400 µL di cloroformio-ottanolo (24:1) e il tutto è stato agitato per inversione per circa 10 minuti.

- I campioni sono stati quindi centrifugati per 10 minuti a 3500 rpm e 300 µL di supernatante sono stati trasferiti in nuovi tubi.

- Ai campioni sono stati quindi aggiunti 15 µL di RNasi A (10 mg/mL) lasciando il tutto a 37°C per 30 minuti.

- Ad ogni tubo sono stati aggiunti 35 µL di acetato di sodio 2,5 M e 600 µL di alcol etilico assoluto per precipitare il DNA. Dopo alcune inversioni i campioni sono stati posti a -80°C per 30 minuti.

- I campioni sono stati quindi centrifugati per 30 minuti a 3500 rpm dopo di che il supernatante è stato buttato.

- Il pellet è stato lavato con etanolo al 70% per 5 minuti. L’etanolo è stato quindi eliminato invertendo i tubi su carta assorbente, avendo cura di non disturbare il pellet.

- I campioni sono stati fatti asciugare sotto cappa chimica ed il DNA è stato infine risospeso in 100 µL di acqua sterile (Sigma).

4.2.3. Estrazione di RNA totale

L’RNA totale è stato estratto da radici, piantine, foglie a bandiera, spighe e cariossidi a diversi stadi di sviluppo, seguendo il metodo descritto da Colot et al. (1989). Qui di seguito sono riportate le fasi previste dal protocollo utilizzato.

- Il materiale vegetale (0,5-1 g), dopo l’aggiunta di azoto liquido, è stato polverizzato finemente con pestello e mortaio.

- Il tessuto polverizzato è stato trasferito in un tubo da centrifuga e, dopo completa evaporazione dell’azoto, risospeso nel tampone di estrazione (150 mM di LiCl; 50 mM di Tris-HCl pH 9,0; 5 mM di EDTA; 5% di SDS), nel rapporto 5 mL/g di campione.

- Alla sospensione è stato aggiunto un uguale volume di fenolo-cloroformio pH 8,0 emulsionando il tutto mediante agitazione.

- Il materiale così preparato è stato mantenuto in ghiaccio per 5 minuti e successivamente centrifugato a 4000 rpm per 10 minuti alla temperatura di 4°C.

- Al supernatante, trasferito in un nuovo tubo da centrifuga, veniva quindi aggiunto un uguale volume della miscela fenolo-cloroformio. Dopo averlo agitato, il campione è stato centrifugato a 4000 rpm per 10 minuti alla temperatura di 4°C. Questo passaggio viene ripetuto tre volte, usando, l’ultima volta, cloroformio al posto della miscela fenolo- cloroformio.

- Alla fase acquosa, nuovamente trasferita in un tubo da centrifuga, veniva aggiunta una quantità di LiCl 8M, in modo da ottenere una concentrazione finale 2M (333 µL/mL). - Il campione veniva quindi lasciato a –20°C per almeno due ore.

- Dopo scongelamento, il campione è stato centrifugato a 10.000 rpm per 30 minuti alla temperatura di 4°C.

- Il pellet veniva quindi risospeso in 1 mL di acqua, alla quale era stato aggiunto precedentemente DEPC (dietil pirocarbonato 1 mL/L di acqua) e, successivamente, veniva aggiunto LiCl 8M, in modo da avere una soluzione ad una concentrazione 2M (333 µL/mL).

- Il campione veniva quindi lasciato in ghiaccio per due ore.

- Dopo centrifugazione a 15.000 rpm per 30 minuti a 4°C, il pellet veniva risospeso in 400 µL di acqua DEPC ed utilizzato per la purificazione di RNA messaggero (mRNA), o conservato a –20°C dopo l’aggiunta di 2,5 volumi di etanolo assoluto e acetato di sodio (NaAc) a pH 5,2.