Le proteine appartenenti alla famiglia PDI, comprendente la PDI classica e le PDI- like, rivestono un ruolo fondamentale nel metabolismo cellulare degli organismi animali e vegetali. Esse svolgono numerose funzioni, tra le quali è molto importante, tanto da conferire il nome all’intera famiglia genica, l’intervento nella formazione ed isomerizzazione dei legami disolfuro e nel folding delle proteine. Il recente completamento delle sequenze nucleotidiche dei genomi di Arabidopsis e di riso ha permesso di ottenere la prima descrizione completa della complessità e diversità di questa famiglia genica nelle piante, ma, nonostante questi studi approfonditi, poco o nulla si conosce sul ruolo fisiologico dei singoli membri ad essa appartenenti. Nelle piante la forma classica della PDI, sulla quale sono stati condotti studi di caratterizzazione molecolare, regolazione trascrizionale e localizzazione intracellulare, è la meglio caratterizzata. I risultati di alcuni di questi studi, condotti in mais e riso, suggeriscono che anche nelle piante, come nei vertebrati, la PDI classica possa giocare un ruolo importante nel folding delle proteine di secrezione ed in particolare nella formazione dei legami disolfuro e nell’assemblaggio delle proteine di riserva. Questo aspetto riveste un significato pratico di notevole importanza in frumento, se si considera che la qualità delle farine e delle semole dei frumenti coltivati dipende prevalentemente dalla composizione proteica del glutine e dalle interazioni chimiche che si instaurano tra le diverse componenti. La possibilità di formare legami disolfuro inter- ed intra-molecolari è considerato uno dei principali fattori responsabili delle peculiari caratteristiche fisico-chimiche e tecnologiche del glutine. Queste interazioni dipendono non solo dalla composizione aminoacidica delle proteine di riserva, ma anche da processi biochimici che avvengono nelle cellule dell’endosperma delle cariossidi durante la granigione. Una migliore comprensione dei meccanismi attraverso i quali si esplicano la sintesi, la maturazione e soprattutto l’assemblaggio di alcune proteine di riserva in grandi aggregati durante la granigione aprirebbe nuove prospettive di intervento per la manipolazione delle proprietà funzionali del glutine, mediante tecniche di ingegneria genetica. Lo studio della famiglia genica codificante per proteine PDI-like in frumento è motivato, quindi, non solo da un interesse teorico per i molteplici ruoli che le proteine PDI-like potrebbero svolgere nel metabolismo cellulare e per comprendere l’evoluzione molecolare di questa famiglia multigenica in un contesto poliploide, ma anche da un aspetto meramente applicativo, visto il loro potenziale coinvolgimento nella sintesi e deposizione delle proteine di riserva e quindi nella determinazione delle proprietà reologiche del glutine.
Il primo obiettivo del lavoro effettuato durante lo svolgimento della tesi di dottorato è stato lo studio della complessità e diversità della famiglia multigenica PDI, comprendente proteine PDI e PDI-like, in frumento tenero. L’iniziale ricerca effettuata nella banca dati “TIGR wheat gene index”, utilizzando 11 sequenze di riso, assegnate alle 8 classi filogenetiche della famiglia PDI nelle piante individuate da Houston e collaboratori (2005), ha permesso di individuare in frumento 10 distinte sequenze consenso (TC, Tentative Consensus) codificanti per altrettanti geni PDI-like. Questi risultati sono stati confermati anche dalla ricerca di sequenze EST omologhe a quelle relative agli 11 geni di riso in un ulteriore banca dati, “HarvEST Wheat”, che è in diretta connessione con la divisione EST delle banche dati di GeneBank, EMBL, DDBJ e NCBI, e dalla successiva analisi di 70 delle sequenze EST identificate, che sono state amplificate mediante RT-PCR e clonate. Una di queste dieci sequenze consenso, la TC250792, corrisponde alla sequenza codificante per la PDI classica, precedentemente clonata e caratterizzata (Ciaffi et al., 2006). Sono state quindi clonate le sequenze cDNA complete relative alle restanti 9 sequenze consenso relative a geni codificanti per proteine PDI-like. L’analisi filogenetica si è basata sul confronto delle sequenze aminoacidiche dedotte da 52 sequenze geniche della famiglia PDI, comprendenti quelle di alcune specie vegetali, le 9 sequenze PDI-like clonate durante questa ricerca e la sequenza codificante per la PDI classica di frumento (Ciaffi et al., 2006), appartenente al primo gruppo filogenetico. L’analisi ha permesso di assegnare le nove sequenze PDI-like clonate a sette delle otto classi filogenetiche della famiglia genica PDI identificate nelle piante. Grazie alla ricerca incrociata in diverse banche dati EST, è verosimile che la maggior parte dei membri della famiglia PDI di frumento siano stati identificati. È possibile che non siano state individuate le sequenze cDNA di altri geni paraloghi codificanti per proteine PDI- like in frumento, sono state clonate, tuttavia, sequenze relative ad almeno un membro per ciascuna delle otto classi filogenetiche individuate da Houston e collaboratori (2005) in base alle sequenze presenti in Arabidopsis, riso e mais. I risultati ottenuti in frumento avvalorano l’ipotesi che gli otto gruppi filogenetici abbiano avuto origine da altrettanti geni presenti nella specie ancestrale da cui si sono evolute le dicotiledoni e le monocotiledoni. L’analisi filogenetica ha inoltre evidenziato la presenza di geni paraloghi derivanti da duplicazioni geniche che hanno avuto luogo, in maniera indipendente, nelle singole specie analizzate, Arabidopsis, mais, riso e frumento. L’analisi filogenetica condotta in questa ricerca, a differenza del lavoro svolto da Houston e collaboratori (2005) in cui venivano considerati i singoli domini tioredossinici, si è basata sulle sequenze aminoacidiche dedotte relative alle intere sequenze codificanti. La principale conseguenza derivante da questa scelta è che
nell’albero filogenetico i membri dell’ottavo gruppo sono risultati nettamente diversificati da quelli delle altre sottofamiglie di proteine PDI-like, perciò le sequenze di questo gruppo sono state inserite come outgroup. Escludendo l’ottava classe filogenetica, che diverge nettamente dalle altre, è possibile dividere la famiglia delle PDI in due cladi principali. La prima e più ampia di esse comprende tutte le proteine appartenenti alla prima classe strutturale (due domini tioredossinici attivi situati uno nella regione N-terminale e l’altro in quella C- terminale) individuate nelle piante (gruppi filogenetici I, II e III) e alcune proteine della quinta classe strutturale (gruppo filogenetico VII), contenenti un solo dominio attivo. Per i gruppi filogenetici I, II e III è possibile ipotizzare una loro origine da eventi di duplicazione genica, che abbiano interessato un gene ancestrale codificante per una proteina di classe strutturale 1, avvenuti nella specie progenitrice delle monocotiledoni e delle dicotiledoni. Il gruppo filogenetico VII potrebbe essersi originato, invece, da un analogo evento di duplicazione, seguito dalla perdita di uno dei due domini tioredossinici attivi. I risultati relativi alla prima clade sono in accordo con quelli ottenuti da Houston e collaboratori (2005). L’albero filogenetico ottenuto non permette, tuttavia, di trarre conclusioni altrettanto lineari sull’origine e sull’evoluzione dei membri della seconda clade principale, le cui sequenze risultano molto più eterogenee.
Le sequenze aminoacidiche dedotte di geni appartenenti alla stessa sottofamiglia presentano un elevato livello di conservazione, le sequenze di frumento e di riso, in particolare, hanno un’identità compresa tra 69,3% a 91,9%. L’analisi della struttura esoni/introni, effettuata per le sequenze genomiche di tre geni PDI-like di frumento (TaPDIL2-1, TaPDIL4-1 e TaPDIL5-1) e per i loro ortologhi di riso e Arabidopsis, hanno dimostrato che anche l’organizzazione genomica, a livello di giunzioni esone/introne, lunghezza degli esoni e posizione dei siti attivi, risulta altamente conservata fra i membri di una stessa sottofamiglia. L’elevata conservazione dell’organizzazione genomica riflette, verosimilmente, l’importanza funzionale dei prodotti proteici codificati. L’analisi Southern di CS e delle sue linee aneuploidi utilizzando come sonde sequenze specifiche per i cloni TaPDIL4-1, appartenente al IV gruppo filogenetico, e TaPDIL5-1, del V gruppo, ha permesso di effettuare la localizzazione cromosomica delle sequenze genomiche corrispondenti. Il clone TaPDIL4-1 ha rilevato la presenza di tre geni omeologhi localizzati sul braccio corto dei tre cromosomi del gruppo 1; i tre geni omeologhi individuati dal clone TaPDIL5-1 sono localizzati, invece, sul braccio lungo dei tre cromosomi del gruppo 5. Questi risultati sono coerenti con la natura alloesaploide del frumento tenero ed è presumibile che anche per ciascuno degli altri cloni PDI-like ottenuti siano presenti tre copie di geni omeologhi, conferiti
dalle specie donatrici dei tre genomi. L’analisi di espressione genica effettuata per TaPDIL2- 1, TaPDIL4-1 e TaPDIL5-1 ed il confronto con quella relativa alla PDI classica ha permesso di verificare le differenze nei livelli di trascrizione dei singoli geni nei diversi tessuti analizzati. Questi dati non permettono di desumere le funzioni svolte dai relativi prodotti genici. I profili di espressione suggeriscono che tra i geni analizzati potrebbe essere presente una certa ridondanza funzionale, associata, tuttavia, ad una diversificazione nei livelli e nei tempi di espressione.
Un primo passo verso la caratterizzazione funzionale dei membri di questa grande famiglia genica ha riguardato la produzione di linee transgeniche di frumento nelle quali la PDI classica viene sovra-espressa sotto il controllo di un forte promotore endosperma specifico. Durante lo svolgimento della tesi di dottorato sono state ottenute numerose piante potenzialmente transgeniche, in alcune delle quali la presenza del transgene è stata confermata tramite analisi PCR. E’ stato intrapreso, inoltre, lo studio funzionale del promotore di uno dei tre geni omeologhi della PDI classica. Per caratterizzare meglio il ruolo funzionale dei motivi regolatori presenti in questo promotore, il gene reporter UidA (GUS) è stato posto sotto il controllo di 4 frammenti di delezione progressivi in 5’. I quattro costrutti così ottenuti sono stati introdotti in altrettante linee di frumento. Dai diversi esperimenti di trasformazione biolistica sono state prodotte numerose piante di frumento potenzialmente transgeniche, che dovranno essere analizzate per rilevare l’espressione del gene UidA. L’analisi funzionale del promotore potrebbe essere interessante per un’analisi approfondita del profilo di espressione spaziale (tessuto specifica) e temporale di uno dei geni omeologhi codificanti per la PDI classica. L’interesse di questa ricerca deriva anche dalla possibilità di disporre di una sequenza regolatrice, caratterizzata funzionalmente, che potrebbe essere utilizzata per l’espressione tessuto specifica di altri geni di interesse, arricchendo la disponibilità di promotori di questo tipo, attualmente piuttosto limitata.