Il ruolo della PDI nelle piante

Nonostante le recenti analisi sulla complessità e diversità della famiglia genica delle PDI nelle piante ci sono ancora numerosi quesiti irrisolti riguardanti la localizzazione cellulare e la funzione fisiologica delle singole proteine. La maggior parte degli studi è stata rivolta alla caratterizzazione molecolare, all’analisi dell’espressione e alla localizzazione intracellulare della PDI classica di alcuni cereali (Chen e Hayes, 1994; Shimoni et al., 1995b; Li e Larkins, 1996). Da questi studi è emerso che la PDI probabilmente ha un ruolo importante nel folding delle proteine secretorie delle piante, in particolare nella formazione dei corpi proteici nell’endosperma.

L’analisi dell’espressione dei geni codificanti per alcune proteine appartenenti alla famiglia delle PDI nelle piante ha indicato che, sebbene i relativi trascritti siano presenti costitutivamente in tutti i tessuti ed organi analizzati, talvolta il loro livello di espressione può variare sensibilmente. Gli mRNA relativi alla PDI classica, isolati in mais, orzo, frumento e ricino, sono espressi preferenzialmente nei semi in formazione, rispetto agli altri tessuti analizzati (radici, foglie, cotiledoni, embrioni, semenzali, ecc.) (Li e Larkins, 1996; Chen e Hayes, 1994; Shimoni et al, 1995b, Ciaffi et al., 2001; Coughlan et al., 1996). In erba medica, il livello di trascritti della PDI classica (alfPDI-1) risulta nettamente più elevato nei fiori maturi che nelle foglie e nelle radici (Shorrosh e Dixon, 1991), mentre la quantità degli mRNA rilevati per la PDI appartenente alla gruppo delle PDI-D (alfPDI-2) era approssimativamente la stessa, indipendentemente dal tipo di tessuto e dallo stadio di sviluppo della pianta (Shorrosh e Dixon, 1992). Il livello di trascrizione del gene codificante per la PDIL1 isolato in carota risulta particolarmente elevato negli embrioni somatici, nei fiori immaturi e nelle foglie giovani, rispetto a radici e foglie di piante adulte (Xu et al., 2002). La PDIL1 di carota è caratterizzata dalla presenza, nella regione N-terminale, di un dominio di circa 70 aa che contiene più del 40% di residui acidi, oltre alla presenza dei due siti catalitici, di un potenziale segnale peptidico e del segnale KDEL, importante per la ritenzione nel RE.

La PDIL1 di carota ha un’organizzazione strutturale simile a quella della Rb60 e a quella codificata da due geni di A. thaliana (At5g60640 e At3g54960) appartenenti al gruppo filogenetico II e classe strutturale 1.

Studi condotti sull’espressione e localizzazione della PDI classica in mais (Li e Larkins, 1996) e soprattutto in frumento, come si vedrà in dettaglio nei paragrafi successivi, suggeriscono che, come nei vertebrati, questo enzima possa giocare un ruolo importante nel folding delle proteine di secrezione delle piante ed in particolare nella formazione dei corpi proteici nell’endosperma dei semi, intervenendo nella formazione dei legami disolfuro e nell’assemblaggio delle proteine di riserva.

Lo studio di alcuni mutanti di mais e riso, che producono semi i cui corpi proteici nell’endosperma risultano alterati, ha confermato il ruolo della PDI classica nella deposizione delle proteine di riserva nei cereali. È stato osservato, infatti, che nell’endosperma del mutante di mais floury-2, che esprime una α-zeina non correttamente processata, l’espressione della PDI aumenta in maniera significativa. Tale incremento di espressione della PDI a livello proteico e di mRNA è correlato positivamente con il dosaggio di alleli fl2. Oltre ad un aumento della PDI, che viene principalmente accumulata nelle cisterne del RE, c’è un incremento dei livelli di BiP. L’aumento della Bip avviene principalmente all’interno dei corpi proteici del RE (Li et Larkins; 1996). L’induzione della PDI nei mutanti fl2 potrebbe riflettere un suo ruolo come chaperone molecolare ed indicare che la PDI funzioni in concerto con la la BiP a differenti stadi del processing della zeina e nell’assemblaggio dei corpi proteici (Li et Larkins; 1996).

Due ulteriori mutanti di mais, mucronate (mc) e defective endosperm B30 (de*-B30), esibiscono un aumento endosperma specifico della PDI in seguito a cambiamenti strutturali nelle proteine di riserva (Wrobel, 1996; Kim et al., 2004).

Le principali proteine di riserva del riso sono le gluteline, proteine omologhe alla globulina 11S di soia e pisello, e le prolammine (Zhao et al., 1983; Takaiwa et al., 1987; Shotwell e Larkins, 1989). Nonostante entrambi i tipi di proteine di riserva vengano sintetizzati sulla membrana del RE e traslocati all’interno del lume del RE, una volta maturi vanno a formare corpi proteici (PB) distinti (Tanaka et al., 1980; Krishnan et al., 1986; Yamagata e Tanaka, 1986).

Le prolammine vengono assemblate all’interno del RE e accumulate in forma di granuli di inclusione intra-cisterne. I corpi proteici delle prolammine vengono chiamati PB-I e hanno forma sferica, con diametro di circa 1-2 µm. Le gluteline invece si accumulano sotto forma di cristalloidi nei corpi proteici di tipo II (PB-II) di origine vacuolare, la cui forma è

irregolare e il cui diametro è di circa 3-4 µm. Una proteina in particolare, la α-globulina, che è codificata da un solo gene (Shorrosh et al., 1992) e da sola costituisce fino al 12% di tutte le proteine del seme (Krishnan e White, 1995), risulta sequestrata nella matrice che circonda i cristalloidi nei corpi proteici di tipo II (Bechtel e Juliano, 1980; Krishnan et al., 1992). Il precursore delle gluteline di 57 kD viene sintetizzato sulla membrana del RE e quindi trasportato via Golgi al vacuolo di riserva, dove viene processato in subunità acide e basiche (Yamagata et al., 1982).

Nei mutanti naturali di riso esp2 (endosperm storage protein2), in cui è stata verificata la mancanza di espressione della PDI, sia a livello mRNA che di proteina, sono presenti e risultano normali i corpi proteici di tipo II, ma mancano quelli di tipo I (Takemoto et al., 2002). Questi mutanti sono invece dotati di numerosi corpi proteici più piccoli (0,5 µm), che hanno origine dal RE (Takemoto et al., 2002) e al cui interno si accumulano sia le prolammine ricche in Cys che il propeptide di 57 kD delle gluteline, probabilmente legati da ponti disolfuro intermolecolari, interazione che impedisce al propeptide di raggiungere il complesso del Golgi e quindi il vacuolo. La PDI risulta quindi essenziale per la normale segregazione delle prolammine e del propeptide delle gluteline nel RE (Takemoto et al., 2002), probabilmente assistendo la formazione dei ponti disolfuro intramolecolari ed intermolecolari di queste proteine.

Molte proteine di riserva, tra cui alcune prolammine, le 2S albumine e la α-globulina, contengono sequenze conservate in tre distinte regioni chiamate A, B e C, i cui motivi consenso sono, rispettivamente, LxxC, CCxQL e PxxC. La struttura tridimensionale delle 2S albumine in girasole (Pandya et al., 2000; Pantoja-Uceda et al., 2004) ed in ricino (Pantoja- Uceda et al., 2003) consiste in 4 eliche, H1, H2, H3 e H4, è stabilizzata da legami disolfuro intramolecolari ed è conservata anche nella α-globulina. Nella α-globulina monomerica i quattro residui cisteinici formano ponti disolfuro intramolecolari, in particolare la cisteina del motivo A (C48) si lega con la prima cisteina del motivo B (C78), mentre la seconda cisteina del motivo B (C79) si lega con la cisteina del motivo C (C171). Recentemente Kawagoe et al. (2005) hanno dimostrato, usando la proteina GFP (green fluorescent protein) fusa a differenti segmenti della α-globulina monomerica, che proprio i ponti disolfuro intramolecolari sono necessari per il suo trasporto nella matrice dei PB-II. La proteina di fusione GFP-ABC viene normalmente accumulata nei PB-II, ma una mutazione della C79 del motivo conservato B determina l’accumulo nei PB-I di questa stessa proteina di fusione GFP-ABC(C79F). Inoltre la proteina di fusione GFP-AB viene accumulata nei corpi PB-I, mentre la GFP-AB(C79S) risulta accumularsi nei corpi proteici PB-II. Apparentemente la presenza di residui cisteinici

disponibili, la C79 nel motivo conservato CCxxQL nella proteina di fusione GFP-AB e la C171 nel motivo conservato PxxC nella proteina di fusione GFP-ABC(C79F), è responsabile dell’accumulo della proteina corrispondente nei corpi proteici di tipo I. Nella proteina di fusione GFP-ABC sia il legame tra la C43 e la C78 che quello tra C79 e C171 sono intramolecolari, mentre si è ipotizzato che nella proteina di fusione GFP-AB la C79 formi un legame intermolecolare con la Cys del motivo conservato PxxC delle prolammine. È stato dimostrato che questo residuo cisteinico (PxxC) nelle prolammine partecipa alla polimerizzazione (Kawagoe et al., 2005). Il fatto che la cisteina C79, in mancanza della C171 del motivo C nella proteina GFP-AB, formi un legame disolfuro intermolecolare con il motivo conservato C delle prolammine spiegherebbe perché la proteina rimanga bloccata nel RE, invece di essere trasportata attraverso il Golgi nel vacuolo di riserva. Probabilmente anche la C171 può interagire con il motivo CCxxQL delle prolammine. Comunque l’intera regione conservata CCxxQL è necessaria per l’efficiente accumulo nei corpi PB-I della proteina di fusione GFP-AB. Mutando infatti la Leu-82, GFP-AB(L82F) si riduce l’accumulo della proteina di fusione nei PB-I e la mutazione della Cys-78, GFP-AB(C78S), porta al suo accumulo nel lume del RE.

Questi tre motivi conservati sono presenti non solo nelle proteine monomeriche 2S albumine e α-globuline, ma anche nelle prolammine polimeriche. Kreis et al. (1985) hanno discusso l’evoluzione delle prolammine polimeriche e delle albumine monomeriche 2S da un gene ancestrale comune. Si ipotizza che i legami disolfuro intermolecolari delle prolammine si siano evoluti dai legami intramolecolari indispensabili nelle albumine monomeriche 2S. Una mutazione ipotetica nell’“hypervariable loop”, tra le regioni B e C delle 2S albumine (Pantoja-Uceda et al., 2004), sarebbe responsabile dell’alterata struttura del loop che ha dato origine ad una proteina polimerica da cui si sarebbero evolute le prolammine.

Nella regione A della α-globulina è inoltre presente un segnale VTS (Vacuolar Targeting Signal) responsabile della localizzazione nel vacuolo di riserva della α-globulina correttamente ripiegata, ma non sufficientemente forte da indirizzare l’accumulo di proteine covalentemente legate a prolammine.