2. MATERIALI E METOD
2.5. Analisi mediante Western blot dei livelli di alcuni enzimi antiossidant
Per verificare l'eventuale incremento dei livelli di espressione di alcuni enzimi antiossidanti in risposta allo stress salino, i corrispondenti livelli di proteina sono stati determinati mediante immunoanalisi. Ciò è stato reso possibile dalla disponibilità di anticorpi policlonali commerciali (Tabella 13) indotti contro proteine di vegetali superiori o di alghe unicellulari, che secondo le informazioni fornite dalla casa produttrice (Agrisera, Vännas, Sweden) avrebbero dovuto cross-reagire anche con gli enzimi di riso.
2.5.1. Estrazione dei tessuti vegetali e preparazione dei campioni per l'elettroforesi
Plantule cresciute in capsule Magenta e sottoposte o meno a stress osmo-salino sono state raccolte e si è diviso l'apparato radicale dalla parte aerea. Dopo aver pesato il materiale, questo è stato omogenato per 2 min in un mortaio di porcellana precedentemente equilibrato in ghiaccio insieme a 2 g g-1 di sabbia di quarzo e 6 mL g-1 di tampone Tris HCl
50 mM, pH 7,8 (tampone di estrazione). Dopo aver aggiunto altri 6 volumi di tampone di estrazione, i campioni sono stati trasferiti in provette tipo Eppendorf da 1,5 mL e centrifugati a 16000 g per 3 min con una centrifuga da banco a temperatura ambiente. Il supernatante è stato raccolto, misurato, trasferito in altre provette e equilibrato in ghiaccio. Le proteine in esso contenute sono state precipitate per mezzo della tecnica del salting out con ammonio solfato. A questo fine agli estratti è stata aggiunta una quantità di sale (436 mg mL-1) pari al
70% della soluzione satura. Il materiale uscito di soluzione è stato sedimentato per centrifu- gazione con le stesse modalità descritte in precedenza. Il supernatante è stato accurata- mente eliminato, e il sedimento è stato risospeso in un piccolo volume (da metà a un decimo di quello originale) di tampone di estrazione.
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Parametri
Strumento: ICP-QMS instrument Varian 820-MS Analisi Quantitativa: Punti per picco 1
Repliche 10 Campioni 5
Plasma: Flusso del plasma 18 L min-1
Flusso ausiliario 1,8 L min-1
Flusso nebulizzatore 0,9 L min-1
Flusso nella guaina 0,25 L min-1
Potenza 1,4 kW Profondità campionamento: 7 mm
CRI*: Gas collisionale (He) 25 mL min-1
Gas reattivo (H2) 60 mL min-1
Prelievo : Generazione aereosol Nebulizzatore Fonte Autocampionatore Spray chamber (T°) 3°C
Periodo prelievo 45 secondi Tempo di scansione 1043 ms Ripetizione 11 secondi Isotopi monitorati: 23Na, 24Mg, 39K
Tabella 12. Condizioni operative della ICP-MS. Per l’analisi quantitativa del contenuto
cationico nelle radici e nella parte aerea delle plantule di riso cresciute in presenza di concentrazioni saline crescenti sono state impiegate le condizioni indicate. CRI* viene definito come interfaccia di reazione collisionale ed è un approccio utilizzato in spettrometria di massa per abbassare le interferenze degli ioni poliatomici.
Una volta determinato il contenuto proteico dei campioni in tal modo ottenuti, essi sono stati diluiti con altro tampone in modo da normalizzare la concentrazione di proteine a 20 mg mL-1 per gli estratti da foglia e a 10 mg mL-1 per quelli da radice. Questi preparati sono stati
uniti a un uguale volume di SDS-loading buffer (125 mM Tris-HCl pH 6,8 contenente 4% SDS, 20% glicerolo, 10% β-mercaptoetanolo e 2 mg mL-1 blu di bromofenolo) e trattati a
95°C per 5 min. In questo modo le proteine sono denaturate termicamente e ricoperte in modo uniforme dal detergente, che conferisce loro una carica negativa proporzionale alla loro massa; l'inclusione dell'agente riducente consente poi la riduzione di eventuali ponti disolfuro intra o intermolecolari, disaggregando le proteine oligomeriche e impedendo che rimangano parziali strutture terziarie. Una volta riportati a temperatura ambiente, i preparati sono stabili e possono essere conservati senza particolari accorgimenti fino all'analisi.
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2.5.2. Elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti (SDS-PAGE)
Prima dell'immunostaining le proteine sono state frazionate mediante elettroforesi in condizioni denaturanti, utilizzando un sistema discontinuo in un apparato per gel 20 x 20 cm, usando spaziatori da 1 mm. In base alla massa della proteina da quantificare, è stato allestito un separating gel al 12% (se < 50 kDa) o al 10% (se > 50 kDa, come per GR e CAT) di poliacrilammide, con le modalità indicate nella Tabella 14. Dopo aver fatto polimerizzare sopra questo uno strato di stacking gel idoneo alla formazione di pozzetti da 50 μL e aver completato il montaggio dell'apparato grazie all’aggiunta di 100 mL nel comparto superiore e 150 mL in quello inferiore di SDS tank buffer (25 mM Tris-192 mM glicina, pH 8,3 contenente lo 0,1% SDS), 40 μL dei diversi campioni sono stati caricati nei pozzetti per mezzo di una siringa Hamilton. La corsa elettroforetica è stata fatta avvenire a temperatura ambiente a 8 mA costanti fino a quando il tracking dye non segnala l'ingresso dei campioni nel separating
gel, momento in cui l’amperaggio è stato aumentato a 12 mA. La corsa è stata considerata
finita quando il fronte del colorante era a 1 cm dalla base del gel. Durante la corsa elettrofo- retica il voltaggio aumentava progressivamente fino a raggiungere circa 160 V.
Per aver un confronto il più attendibile possibile tra i diversi trattamenti, i campioni da paragonare sono stati sempre analizzati in un’unica corsa elettroforetica.
2.5.3. Western blotting
Circa 20 min prima del termine della corsa si pone con pinze e guanti un foglietto di nitrocellulosa in tampone di trasferimento (25 mM Tris-192 mM glicina, pH 8,3, contenente metanolo 10%) lasciando in agitazione per 15 minuti e quindi sotto vuoto per 5 minuti. Anche il gel, una volta tolto dall'apparato, è riequilibrato per 5 min nello stesso tampone allo scopo di lavare via l’SDS. Quindi viene allestito il “sandwich” sovrapponendo nell'ordine: una spugnetta imbibita di tampone di trasferimento, un foglio di carta 3MM, il gel, la nitrocellu- losa, un secondo foglio di carta 3MM e la seconda spugna. All’aggiunta di ogni elemento viene fatta scorrere su di esso una bacchetta di vetro, eliminando così le bolle di aria che si potrebber essere formate e che interferirebbero con il trasferimento delle proteine. Quindi il sandwich viene inserito nell'apposito apparato e l'elettrotrasferimento è lasciato procedere a temperature ambiente overnight a 10 mV costanti.
2.5.4. Immunostaining con fosfatasi alcalina
Il giorno seguente si smonta il sandwich dall'apparato; il foglietto di nitrocellulosa viene trasferito in un contenitore delle stesse dimensioni e saturato per 60 min in 10 mL di TBS (Tris Buffered Saline, 10 mM Tris-HCl pH 7,5 contenente 150 mM NaCl) a cui è stato aggiunto il 3% (p/v) di albumina di siero bovina (BSA). Al resto del TBS viene nel frattempo aggiunto lo 0,2% di Tween 20, e si preparano due aliquote da 9 mL del tampone ottenuto contenenti lo 0,5% di BSA. Al termine della saturazione la nitrocellulosa viene sciacquata velocemente tre volte con TBS, e incubata per 120 min nei primi 9 mL di TBS-0,5% BSA con 4 µl di anticorpo primario. Si effettuano quindi tre lavaggi da 10 minuti in 20 mL di TBS, e si incuba altri 120 min con gli altri 9 mL di TBS-0,5% BSA a cui sono stati aggiunti 2 µl di anticorpo secondario (rabbit anti-mouse IgG coniugato con fosfatasi alcalina, Sigma A4312). Si effettuano infine 3 lavaggi da 10 min in TBS.
Durante l'ultimo lavaggio si prepara la soluzione di sviluppo: a 19 mL di tampone per fosfatasi alcalina (0,1 M Tris-HCl, pH 9,5, contenente 0,1 M NaCl e 5 mM MgCl2) si uniscono
600 µl di una soluzione 33 mg mL-1 di nitroblu di tetrazolio (NBT) in 50% dimetilformammide
e 400 µl di una soluzione 41 mg mL-1 di bromo-cloro-indol fosfato (BCIP) in dimetil-
formammide, equilibrando a 37°C. Il foglietto di nitrocellulosa viene quindi posto per 5 min in 20 mL di tampone per fosfatasi alcalina. La soluzione di sviluppo viene versata nella vaschetta, agitando fino alla comparsa delle bande.
83 Enzima Abbr. (kDa) Codice Reattività confermata Reattività prevista L-ascorbato perossidasi APX (25 kDa) AS08 368 A. thaliana, N. tabacum, S. vulgaris O. sativa, S. lycopersicum Da 5 a 20 μg di proteine totali da estratto foliare di A. thaliana
Mn superossido dismutasi MnSOD (25 kDa) AS09 524 A. thaliana , A. maritima, P. sativum H. vulgare, O. sativa, T. aestivum, Z. mays, P. sitchensis, P.
balsamifera 5 μg (1,2), 10 μg (3, 4) of total protein from Pisum sativum Cu/Zn superossido dismutasi cloroplastica CSD2 (20 kDa) AS06 170 A. thaliana, O. sativa, Populus sp. Z. mays, P.
pinaster Non Disponibile
Glutatione reduttasi
GR (54 kDa)
AS06 181 N. tabacum, S. vulgaris, S. tuberosum, Z. mays H. vulgare, O. sativa, P. balsamifera 10 μg di proteine totali da (1) A.
thaliana; (2) N. tabaccum; (3) Z. mays;
(4) H. vulgare; (5) P. patens; (6) C. reinhardtii; (7) S. elongatus Catalasi CAT (57 kDa) AS09 501 A. thaliana, B. oleracea, H. vulgare, N. bentamina, O. sativa, S. lycopersicum, S. oleracea, Z. mays G. mexicanum, V. vinifera
10 μg di proteine totali da A. thaliana Col0 (1), Cat2-(Col0) (2), Ler0 (3), Cat2- (Ler0) (4), Z. mays (5), O. sativa (6), B.
oleracea (7), N. bentamina (8) Fe superossido dismutasi cloroplastica FeSOD (23 kDa)
AS06 125 A. maritima, A. thaliana, C. reinhardtii, Z. mays
G. max, S. lycopersicum
5 μg di proteine stromali da C. reinhardtii (sinistra) e A.thaliana
Tabella 13. Anticorpi utilizzati per la determinazione dei livelli degli enzimi antiossidanti potenzialmente coinvolti nella risposta allo stress salino in riso. Sono
specificate la massa molecolare relativa degli enzimi il cui riconoscimento è atteso in Arabidopsis, e le reattività confermate o attese nei confronti di quelli di altre specie vegetali. Dove disponibili, vengono riportate le immagini dei Western Blots fornite dalla ditta che li commercializza (Agrisera, Vännas, Sweden).
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Separating gel Stacking gel
Composto Gel 10% Acril-Bis Gel 12% Acril-Bis Gel 5% Acril-Bis
Acqua distillata 15,6 mL 14 mL 3,66 mL
Separating gel buffer 4x (1,5 M
Tris-HCl pH 8,8) 8 mL 8 mL 1,5 mL*
SDS 10% 320 μL 320 μL 60 μL
Acrilamide-bis Sigma al 40% 8 mL 9,6 mL 750 μL
Degasare per 5 minuti
Ammonio persolfato 10% 250 μL 250 μL 60 μL
TEMED 36 μL 36 μL 15 μL
Tabella 14. Composizione di separating e stacking gel. Sono riportati, nell'ordine di
aggiunta, le varie soluzioni usate per preparare il separating e lo stacking gel alle concentrazioni indicate di acrilammide. La soluzione di ammonio persolfato deve essere preparata fresca ogni volta. Il volume finale del gel era di circa 34 mL (30 mL di separating + 4 mL di stacking). *Il tampone per lo stacking gel (0,5 M Tris-HCl pH 6,8) è diverso da quello utilizzato per il separating gel.
Al termine, si elimina la mix e la reazione viene bloccata con 20 mL di soluzione bloccante (20 mL di TBS contenente 20 mM EDTA) per almeno 1 min. Dopo 3-4 lavaggi in acqua distillata il blot viene infine fatto asciugare su carta da filtro, e conservato a temperatura ambiente al buio.
Sui blots così ottenuti è stata condotta un’analisi densitometrica utilizzando il software
imageJ (National Institutes of Health), che fornisce i valori di intensità per ogni banda
analizzata e quindi una stima semi-quantitativa della proteina presente nell’estratto.