Il ruolo del calcio: sensing e signalling

Il calcio è uno dei più diffusi secondi messaggeri, il suo accumulo intracellulare avviene in seguito al sensing di diversi stress abiotici e a seconda dei casi tale incremento può avere durata, localizzazione sub-cellulare, ampiezza e frequenza diverse. Un’ulteriore specificità è data dalle proteine che possono transcodificare tale messaggio. Le piante posseggono tre maggiori famiglie di sensori per il calcio: le calmoduline (CaM), le proteine calcineurin b-like (CBL) e le calmodulin-like domain protein kinases (CDPKs). Le prime due tipologie non hanno una vera e propria attività enzimatica, ma sono in grado di legare il calcio inducendo cambiamenti conformazionali in proteine bersaglio. Le CDPKs hanno attività chinasica e spesso ad esse vengono associate le protein chinasi calcio- e calmodulina-dipendenti (CCaMKs). Tutte le tre categorie hanno un dominio molto conservato che interagisce con il calcio, chiamato EF-hand e costituito da una caratteristica struttura secondaria a elica-giro- elica (Figura 17).

Figura 17. Struttura delle proteine che interagiscono con il Ca2+_{. (a) Proteine senza}

attività enzimatica e proteine partner con dominio chinasico.

CaM e CBL legano il Ca2+mediante la EF-hand. CaM regola in seguito proteine

come le protein chinasi (CRKs), mentre le CBL attivano CIPKs in cui vi è uno

specifico sito di binding. (b) Sensori per il calcio con

attività chinasica: entrambi hanno domini EF-hand, ma solo le CDPKs funzionano in maniera indipendente, mentre

l’attività delle CCaMK può essere regolata dalle CaM (Boudsocq et al., 2010).

1.3.6.1. Le Calmodulin-like Domain Protein Kinases (CDPKs)

In soia si è osservato che GmCDPKa e GmCDPKg fosforilano in vitro un enzima coinvolto nella sintesi di cisteina (serina acetiltranferasi). Tale reazione rilascia cisteina che può essere utilizzata per produrre glutatione. In questo modo sembra che le CDPKs possano partecipare attivamente nella risposta antiossidante. Si pensa che queste proteine siano inattive in condizioni normali, grazie all’interazione del sito attivo con una porzione regolatrice della proteina stessa; in presenza di calcio l’enzima subisce dei cambiamenti conformazio- nali che ristabiliscono l’attività catalitica. In riso e in Arabidopsis le CDPKs costituiscono una famiglia multigenica che conta rispettivamente 29 e 34 membri. Un così vasto numero di proteine può implicare diversa localizzazione intracellulare, diversità di substrato e differenze nella concentrazione-soglia del Ca2+ _{capace di attivarle.}

In riso OsCPK12 regola l’omeostasi dei ROS inducendo l’espressione dei geni per l’ascorbato perossidasi (OsAPX2/ OsAPX8) e reprimendo il gene per la NADPH ossidasi, accrescendo in tal modo la tolleranza allo stress salino (Figura 18). La sovraespressione di AtCPK6 è associata a tolleranza alla siccità determinata dall’accumulo di prolina e a ridotta perossidazione lipidica, probabilmente per l’abbassamento del tasso di produzione dei ROS. Stranamente il mutante AtCPK6- _{non presenta fenotipi associabili allo stress, forse per un}

meccanismo di ridondanza fra le varie AtCPK6 di Arabidopsis (Boudsocq et al., 2010). In contrasto, AtCPK21 è negativamente collegato allo stress osmotico, e inibisce la sintesi di prolina (Franz et al., 2011).

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Durante lo stress osmotico è vitale per la pianta limitare al minimo le perdite di acqua mediante la regolazione negativa delle acquaporine. In spinacio (Spinacea oleracea) l’acqua- porina PM28A viene regolata per fosforilazione a opera di una CDPK (Johansson et al., 1998). La regolazione mediata dal Ca2+ _{è alla base del riconoscimento dello specifico tipo di}

stress: la Ca2+_{-ATPasi autoinibente ACA2 di Arabidopsis gioca un ruolo cruciale in lievito}

sottoposto a stress salino nel generare un giusto segnale di rilascio di Ca2+_{. La forma attiva}

di AtCPK1 inibisce in lievito l’attività basale di ACA2 e blocca la stimolazione CaM- dipendente. ACA2 e AtCPK1 non sono localizzati nello stesso compartimento cellulare: ACA2 è infatti collocato nel reticolo endoplasmatico, e questo suggerisce che AtCPK2, l’omologo di AtCPK1 presente nel reticolo, possa regolare ACA2.

Figura 18. Rappresentazione del

network delle CDPKs nella

risposta allo stress osmo- salino. Lo stress salino viene

percepito mediante la tossicità dello ione sodio, mentre quello osmotico è

capace di attivare direttamente specifiche CDPK che hanno come effetto un aumento della concentrazione di prolina e del trasporto d’acqua. Molto spesso queste due azioni si

susseguono l'una dopo l'altra, poiché lo stress osmotico in genere precede

quello ionico (Boudsocq et al., 2013).

1.3.6.2. Le calmoduline (CaM)

Le calmoduline presentano quale unico dominio funzionale l’EF-hand e sono localiz- zate nell’apoplasto, nel citosol, nel nucleo e nel reticolo endoplasmico. È stata identificata una vasta famiglia di CaM e simil-CaM (CML) sia in Arabidopsis che in riso, ma per molte di esse i meccanismi molecolari e il ruolo fisiologico rimangono oscuri. Nel genoma di riso vi sono 5 geni per le CaM e 32 per CML, suddivise in altri sei sottogruppi; le CaM sono espresse ad alti livelli in tutta la pianta, mentre le CML mostrano un pattern tessuto-specifico. In condizioni di stress osmotico o osmo-salino viene indotta l’espressione delle OsCam1-1, OsCML4, 5, 8, e 11, con cinetiche e valori assoluti diversi (Figura 19). Tale espressione è proporzionale all’entità dello stress applicato e avviene grazie a elementi posti in cis come i “Drought Responsive Elements” (DRE), mentre sembra che gli ABA-Responsive Elements (ABRE) e i Low Temperature Responsive Elements inducano altri geni per CaM e CML (Chinpongpanich et al., 2012).

Studi sulle calmoduline di Arabidopsis mostrano una stimolazione diretta dell’attività dell’enzima NAD chinasi (AtCaM2). L’analisi aminoacidica evidenzia una forte somiglianza fra AtCaM2 e OsCam1, e sembra che la sintesi di tali proteine sia regolata dalla presenza intracellulare di calcio: bloccando i canali del calcio con un inibitore specifico non viene infatti indotta la sintesi di OsCam1 in condizioni di stress salino e osmotico (Phean-o-Pas et al., 2005). Questa prova fornisce sufficienti elementi per affermare l’importanza sia del calcio come secondo messaggero, che delle calmoduline come trasduttori dello stress osmo-salino.

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Le CaM e CML interagiscono con le proteine bersaglio, chiamate genericamente CAMBP: in Arabidopsis un'analisi computazionale ne ha identificate più di 100. Le CAMBP vengono suddivise in due gruppi: il primo è costituito da proteine capaci di trasdurre il segnale (protein chinasi o fattori di trascrizione), l’altro da proteine con il ruolo attivo di effettori, come enzimi o trasportatori. La complessità di tale quadro è riportata in Figura 20, ma molti dettagli della catena di trasduzione del segnale mediata dalle calmoduline sono ancora da chiarire.

Figura 19. Misura dell’espressione dei trascritti di OsCam e OsCML in risposta allo stress. A

sinistra sono riportati i dati di microarray ottenuti a 7 giorni dalla germinazioni in condizioni di stress salino o osmotico. Al centro e a destra sono riportati i livelli di espressione dei geni più indotti. Lettere

minuscole differenti indicano medie significativamente diverse (Chinpongpanich et al., 2012).

1.3.6.3. Le proteine Calcineurin B-like (CBL)

Le CBL sono piccole proteine contenenti due domini globulari fra loro collegati. Ogni dominio contiene 2 EF-hand capaci di legare il Ca2+_{. Per alcune di esse è stata risolta la}

struttura cristallografica grazie alla quale si è potuto notare che CBL2 lega due ioni Ca2+_,

mentre CBL4/SOS3 (salt-overly sensitive 3) ne lega quattro (Nagae et al., 2003; Sanchez- Barrena et al., 2005). Alcune di esse hanno un sito di miristilazione che ne facilita l’associazione con le membrane. Sia in riso che in Arabidopsis sono presenti dieci CBL (Kolukisaoglu et al., 2004) che ricoprono il ruolo di sensori del Ca2+ _{e trasducono il segnale}

mediante l’interazione con altre proteine, regolando la localizzazione cellulare dei loro bersagli. L’espressione dei geni che codificano per tali proteine viene modulata in maniera differenziale da vari stimoli come freddo, ABA, salinità e siccità, suggerendo un ruolo attivo delle CBL nella risposta a condizioni di stress abiotico. Studi compiuti su Arabidopsis alterando l’espressione genica di CBL1, silenziandolo o sovraesprimendolo, hanno dimostrato il suo ruolo attivo in risposta allo stress osmo-salino, mentre quello da freddo era negativamente correlato (Cheong et al., 2003).

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Figura 20. Ruoli di CaM e CML in risposta a condizioni di stress abiotico. Fra parentesi sono

riportati gli stimoli ambientali che attivano la specifica risposta (Boudsocq et al., 2010).

Le CBL svolgono solo metà del ruolo di trasduzione del segnale; la parte restante può essere svolta da altre proteine con attività chinasica che hanno la capacità di interagire con le CBL, le CBL-interacting protein kinases (CIPK). In riso e Arabidopsis ad oggi sono state scoperte rispettivamente 30 e 25 CIPK. L’interazione fra CBL-CIPK stimola l’attività chinasica e dirige il complesso nella membrana citoplasmatica, dove le CIPK possono fosforilare specifici substrati. La proteina CIPK più studiata è senza dubbio SOS2/CIPK24 che, insieme all’antiporto Na+_/H+ _{SOS1 e a SOS3/CBL4 è coinvolta nella via metabolica definita SOS (salt}

overlay sensitive). L’aumento del livello di calcio intracellulare viene percepito da

SOS3/CBL4 che in seguito al legame con lo ione subisce modifiche conformazionali e interagisce con una serina/treonina protein chinasi, SOS2. In Arabidopsis esistono proteine SOS3-like/CBL, capaci di regolare l’attività di SOS2; la loro espressione è tessuto specifica e interessa la parte aerea della pianta, mentre nelle radici viene espressa preferenzialmente SOS3. Una volta formato e attivato, il complesso SOS3–SOS2 porta all’attivazione dell’antiporto SOS1, con la conseguente estrusione dello ione Na+ _{in eccesso (Figura 21) (Ji}

et al., 2013).