Purificazione preparativa della P5C reduttasi e della P5C deidrogenasi di riso

In prospettiva, i risultati ottenuti dovrebbero permettere una adeguata caratterizzazione delle proprietà funzionali di tutte le proteine coinvolte nella sintesi di prolina dall'acido glutammico e nella sua riossidazione mitocondriale. Si tratta però di un obiettivo ambizioso, che va al di là degli scopi del presente lavoro. Si è comunque voluto procedere con la purificazione e la determinazione preliminare delle proprietà di almeno due delle proteine clonate, la P5C reduttasi e la P5C deidrogenasi. Tale scelta è stata motivata sia dalla disponibilità all'interno del laboratorio dei materiali e delle metodiche richieste (Forlani et al., 1997; Giberti et al., 2014), che dal fatto che l'analisi mediante SDS-PAGE aveva fornito la sicurezza che tali enzimi fossero prodotti nel sistema eterologo, ma anche in considerazione del fatto che i risultati ottenuti mediante PCR semi-quantitativa (Figura 80) avevano mostrato delle possibili variazioni dei livelli di trascrizione che mal si conciliano con un accumulo di prolina in condizioni di stress. Ciò potrebbe dunque indicare l'esistenza a carico di questi due

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enzimi di meccanismi di regolazione post-traduzionale attivati dallo stress salino. D'altra parte, invece, l'analisi della PRODH (anch'essa interessante da quest'ultimo punto di vista) è stata rimandata a una fase successiva della ricerca per la mancanza di uno specifico metodo di saggio in vitro.

1NI; 1I; 1NIsol; 1Isol;HM; 2NI; 2I; 2NIsol; 2Isol

P5CS1&2

NI I; NIsol; Isol; LM;

P5Cred

trNI; trI; trNIsol;trIsol HM; wNI; wI, wNIsol; wIsol

P5CDH

wNI; wI; HM; trNI; trI

PRODH

Figura 84. Analisi mediante SDS PAGE dell'espressione delle proteine di interesse nel sistema eterologo. I cDNA inseriti all’interno del ceppo BL21AI sono indicati al di sotto di ogni figura. Le

frecce evidenziano la banda del peso molecolare atteso corrispondente alla proteina di interesse. Abbreviazioni: NI = non indotto; NIsol = non indotto frazione solubile; I = indotto; Isol = indotto frazione solubile; HM = marcatori high range S8320; LM = marcatori low range M3913; tr = forma

troncata della proteina; w = forma intera della proteina).

Durante il processo di subclonaggio alcune variazioni erano state introdotte nella sequenza di questi due geni. Innanzitutto era stata ottenuta la fusione con un tratto del plasmide di espressione codificante per una successione di 6 residui di istidina, la cui presenza avrebbe dovuto facilitare la purificazione della proteina mediante cromatografia per

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affinità. Oltre a questa modifica ve ne erano altre (Figura 85), come la presenza di un sito di taglio specifico per la proteasi TEV, un codone di START della trascrizione, un epitopo V5 e cinque amminoacidi a monte dell’inizio della proteina di interesse introdotti per stabilizzarne la struttura. Relativamente alla conservazione della sequenza amminoacidica del gene di riso, le sequenze dedotte della P5C reduttasi e dalla P5CDH troncata sono identiche a quelle attese, mentre per la P5CDH intera è avvenuta una delezione nella porzione iniziale della proteina (evidenziata in rosso nella Figura 85). Questa parte della sequenza è molto ricca in “CG” e quindi teoricamente auto-complementare. Probabilmente durante la fase di amplifica- zione si sono formate delle anse di pDNA sullo stesso filamento, che non hanno permesso alla DNA polimerasi di riconoscere tutti i nucleotidi, bypassando quelli coinvolti nell’ansa. L’errore così avvenuto tuttavia non inficia l'utilizzo del costrutto per due motivi: i nucleotidi eliminati sono un multiplo di tre (n = 27), e corrispondono quindi a 9 amminoacidi, che non sono presenti nella sequenza amminoacidica finale (evidenziati in rosso in Figura 85), ma senza influire sulla correttezza del successivo open reading frame; inoltre tale porzione della proteina corrisponde a una parte del peptide di transito, fondamentale in planta per la corretta localizzazione funzionale, ma che è irrilevante ai fini dell’attività enzimatica, dal momento che il peptide viene idrolizzato una volta raggiunta la matrice mitocondriale.

Dopo alcuni tentativi, per quanto riguarda la P5CDH si è scelto di utilizzare il ceppo di

E. coli BL21(DE3) pLysS invece del ceppo BL21 AI, poiché sembrava determinare un minore

sequestro della proteina eterologa nei corpi di inclusione. Ciò nonostante, l'analisi mediante SDS-PAGE di estratti da cellule indotte e non indotte ha mostrato in corrispondenza del peso molecolare atteso una banda di grandi dimensioni nella corsia corrispondente alle proteine totali, mentre nella stessa posizione della frazione di proteine solubili il segnale era comunque molto più flebile (Figura 86).

Questo comportamento può essere spiegato anche considerando la natura parzialmente idrofobica dell’enzima, che pur essendo localizzato nella matrice mitocondriale prende contatto funzionale con la membrana mitocondriale interna (Forlani et al., 1997). Nonostante le basse quantità presenti nella frazione solubile, la coda di istidina presente all’estremità N-terminale della proteina eterologa ha permesso la purificazione all'omogeneità elettroforetica di una consistente quantità di enzima mediante cromatografia di affinità su una colonna di Ni2+_{-sefarosio. La proteina di interesse è risultata eluire dalla colonna a}

concentrazioni di imidazolo comprese fra 50 e 100 mM (Figura 86). Si tratta di un risultato inatteso, dal momento che nella maggior parte dei casi l'interazione tra proteina e resina risulta molto più forte, e concentrazioni di imidazolo da 200 a 400 mM sono necessarie per il suo distacco. Il dato potrebbe forse dipendere da un folding che sottrae una parte delle istidine dal contatto con il mezzo esterno. L'analisi in SDS-PAGE non ha comunque evidenziato la presenza di significative contaminazioni da parte di proteine endogene di E.

coli che vengono comunque trattenute dalla resina e eluite a basse concentrazioni di ligando.

Le frazioni contenenti la proteina di interesse sono state unite fra loro in un unico preparato, che è stato sterilizzato per filtrazione e conservato in ghiaccio sino al successivo utilizzo. Il saggio di attività ha mostrato per una tipica preparazione una quantità di proteina pari a circa 1,3 - 1,5 μkat mL-1_{, a un’attività specifica di circa 4500 nkat (mg di proteine)}-1_.

Nelle condizioni impiegate, l'enzima ha mostrato una buona stabilità: dopo 1 mese di conservazione in ghiaccio l'attività residua è risultata pari a circa il 70% di quella iniziale.

Prove analoghe sono state effettuate anche con la forma intera della P5CDH. In tal caso, però, la proteina di riso è stata quasi completamente sequestrata nei corpi di inclusione, e anche dopo il passaggio per cromatografia per affinità la quantità di enzima presente nel preparato finale è risultata inferiore a un centesimo di quella ottenuta con la forma tronca. Il dato può essere facilmente spiegato considerando che la presenza del peptide di transito può aumentare in modo significativo l'idrofobicità della proteina, e consentire anche un suo legame con le membrane del batterio. Una valutazione approssimativa dell'attività nel preparato ottenuto ha mostrato una attività specifica pari a circa la metà di quella evidenziata sulla forma troncata (dati non mostrati), indicando comunque che la presenza del peptide di transito non blocca l'attività catalitica.

135 P5CDH cDNA di riso: MetSLILSRRRLAAAVRRSGPAALASRWMetHTPPFATVSPQEISGSSPAEVQNFVQGSWTTSGNWNWLVDPLNGEK FIKVAEVQEAEIKPFVESLSNCPKHGLHNPLKAPERYLMetYGDISAKAANMetLGQPVVSDFFAKLIQRVSPKSYQQALAEV QVSQKFLENFCGDQVRFLARSFAVPGNHLGQSSNGYRWPYGPVAIITPFNFPLEIPLLQLMetGALYMetGNKPVLKVDSKVS IVMetDQMetLRLLHACGMetPAEDVDFINSDGITMetNKLLLEANPKMetTLFTGSSRIAEKLAADLKGKIKLEDAGFDWKI LGPDVQEVDYIAWVCDQDAYACSGQKCSAQSILFMetHKNWSSSGLLDKMetKSLSERRKLEDLTIGPVLTVTTSSMetIEHM etKNLLKIPGSKVLFGGEPLENHSIPEIYGAFKPTAVFVPLSEILKSGNFELVTREIFGPFQVVTEYSDDELELVLEACERMe tNAHLTAAVVSNDPLFLQEVLGRSVNGTTYAGIRARTTGAPQNHWFGPAGDPRGAGIGTPEAIKLVWSCHREIIYDIGPLPKN RALPSATStop P5CDH troncata (pET151): MetHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENLYFQGIDPFTSGPAALASRWMetHTPPFATVSPQEISGSSPAEVQNFVQGSW TTSGNWNWLVDPLNGEKFIKVAEVQEAEIKPFVESLSNCPKHGLHNPLKAPERYLMetYGDISAKAANMetLGQPVVSDFFAK LIQRVSPKSYQQALAEVQVSQKFLENFCGDQVRFLARSFAVPGNHLGQSSNGYRWPYGPVAIITPFNFPLEIPLLQLMetGAL YMetGNKPVLKVDSKVSIVMetDQMetLRLLHACGMetPAEDVDFINSDGITMetNKLLLEANPKMetTLFTGSSRIAEKLAA DLKGKIKLEDAGFDWKILGPDVQEVDYIAWVCDQDAYACSGQKCSAQSILFMetHKNWSSSGLLDKMetKSLSERRKLEDLTI GPVLTVTTSSMetIEHMetKNLLKIPGSKVLFGGEPLENHSIPEIYGAFKPTAVFVPLSEILKSGNFELVTREIFGPFQVVTE YSDDELELVLEACERMetNAHLTAAVVSNDPLFLQEVLGRSVNGTTYAGIRARTTGAPQNHWFGPAGDPRGAGIGTPEAIKLV WSCHREIIYDIGPLPKNRALPSATStop

Amminoacidi della sequenza di transito mitocondriale: MetSLILSRRRLAAAVRR

P5CDH intera(pET151): MetHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENLYFQGIDPFTMetSLILSRRRLAALASRWMetHTPPFATVSPQEISGSSPAE VQNFVQGSWTTSGNWNWLVDPLNGEKFIKVAEVQEAEIKPFVESLSNCPKHGLHNPLKAPERYLMetYGDISAKAANMetLGQ PVVSDFFAKLIQRVSPKSYQQALAEVQVSQKFLENFCGDQVRFLARSFAVPGNHLGQSSNGYRWPYGPVAIITPFNFPLEIPL LQLMetGALYMetGNKPVLKVDSKVSIVMetDQMetLRLLHACGMetPAEDVDFINSDGITMetNKLLLEANPKMetTLFTGS SRIAEKLAADLKGKIKLEDAGFDWKILGPDVQEVDYIAWVCDQDAYACSGQKCSAQSILFMetHKNWSSSGLLDKMetKSLSE RRKLEDLTIGPVLTVTTSSMetIEHMetKNLLKIPGSKVLFGGEPLENHSIPEIYGAFKPTAVFVPLSEILKSGNFELVTREI FGPFQVVTEYSDDELELVLEACERMetNAHLTAAVVSNDPLFLQEVLGRSVNGTTYAGIRARTTGAPQNHWFGPAGDPRGAGI GTPEAIKLVWSCHREIIYDIGPLPKNRALPSATStop

Amminoacidi deleti dal cDNA di riferimento: AVRRSGPAAL

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