Ruolo della prolina nella risposta allo stress salino in riso

Visti i ruoli positivi esercitati dalla prolina, stupisce come in alcuni lavori eseguiti sul riso il suo accumulo sia più marcato nelle varietà sensibili allo stress salino piuttosto che in quelle tolleranti (Lutts et al., 1999; Vaidyanathan et al., 2003). Sono state proposte due spiegazioni: nella prima si suggerisce che le diverse varietà di riso siano in grado di accumulare quantità differenti di prolina in condizioni di stress salino indipendentemente dalla loro resistenza al sale, mentre nella seconda si avanza l’ipotesi che le basi metaboliche della resistenza alla salinità nella pianta possano cambiare in base allo stadio di sviluppo e con esse anche la capacità di accumulare la prolina. In genere l’aumento di prolina è interpretato come un regolatore positivo della tolleranza allo stress salino. Non è chiaro però se tale accumulo in riso avvenga inibendo il catabolismo dell’amino acido o stimolandone la biosintesi, oppure attraverso entrambi i meccanismi.

46

Lavori eseguiti su foglie di riso staccate e trattate con diversi sali di rame o con sodio cloruro hanno dimostrato un accumulo di prolina trattamento-dipendente già dopo 8 ore dall'imposizione dello stress. Tale accumulo è stato però associato all’aumento dell’attività della OAT, anche se non è stata verificata quella della P5CS (Chen et al., 2001; Lin et al., 2002). Come un possibile marcatore di tolleranza allo stress salino, oltre all’accumulo di prolina, è stato proposto anche l’aumento dell’attività della P5CR. In condizioni di stress salino è stato infatti osservato quasi un raddoppio della quantità di prolina dovuto a un abbassamento dell’attività della PRODH (in genotipi sia sensibili che tolleranti) e all’aumento dell’attività della P5CR. Nella varietà più resistente questo aumento era nell’ordine del 50% (Roy et al., 1992), ma senza che anche in questo caso venissero eseguite misure dell’attività della P5CS. Figura 32. Metabolismo della 2-acetil-1- pirrolina. A: meccanismo proposto per la produzione di 2- acetil-1-pirrolina. B: livelli endogeni di P5C in tre varietà di Tainung (67 =non aromatica; 71 e 72 =aromatiche). C: livelli di espressione dei geni del metabolismo della prolina in relazione al P5C prodotto. (Huang et al., 2008).

Come in Arabidopsis, anche in riso sono state identificate due isoforme della P5CS: OsP5CS1, con espressione ubiquitaria sia negli organi vegetativi che riproduttivi, e OsP5CS2, preferenzialmente espressa nelle piante mature, soprattutto negli stami (Figura 33).

I patterns di espressione indicano che la prima isoforma sintetizza prolina in maniera costitutiva, mentre OsP5CS2 è implicata nella risposta allo stress. Entrambi i geni sono indotti da sale, freddo e trattamento esogeno con ABA già a 48 ore dall’inizio del trattamento. Lo stress idrico causa un’induzione della OsP5CS1 a 12 ore, che poi ritorna ai livelli iniziali dopo 24 ore, mentre il trascritto della OsP5CS2 aumenta nelle 24 ore di trattamento. Analizzando mutanti knock-out per le due isoforme, si è visto che il genotipo Osp5cs1 è letale, mentre Osp5cs2 in condizioni normali cresce in maniera simile al wild-type, indicando chiaramente un ruolo di OsP5CS2 nella risposta allo stress e non nel metabolismo basale o costitutivo (Hur et al., 2004).

In tessuti indifferenziati, come calli ottenuti dai cotiledoni cresciuti sia su terreno solido che in liquido, il trattamento con 250 mM NaCl determina una forte induzione della P5CS2 e una meno marcata, ma pur sempre rilevante espressione di P5CS1 e P5CR, confermando quanto osservato da Hur e collaboratori (2004). Le stesse determinazioni su cellule in coltura non hanno evidenziato cambiamenti degni di nota nei livelli di espressione

a.

c. b.

47

di P5CS1 e P5CR, mentre una leggera induzione è visibile per la P5CS2 (ma meno della metà rispetto al sistema callo). I risultati evidenziano i rischi dell’utilizzo di sistemi semplificati come quello delle colture cellulari. Infatti le caratteristiche di resistenza osservate in piante vengono in genere mantenute nelle cellule indifferenziate sviluppate dalle medesime, ma con le dovute eccezioni (Somboonwatthanaku et al., 2010).

4°C

250mM NaCl 0.5
μM ABA Water stress

Figura 33. Espressione delle due forme di P5CS in riso. I livelli di messaggero sono stati

quantificati in diversi tessuti della pianta e in molteplici condizioni di stress (Hur et al., 2004).

Recentemente è stato dimostrato che in due varietà di riso di tipo indica (molto simili geneticamente, ma una resistente, LPT123-TC171 e l’altra suscettibile allo stress salino, LPT123) l’accumulo di prolina in condizioni di alta salinità è da attribuirsi, almeno in parte, all’attivazione ABA-dipendente della P5CS1, anche se non è stata determinata quella della P5CS2. L’entità di tale accumulo e la velocità con cui esso si manifesta sono moto più elevati nel genotipo resistente che in quello suscettibile. La somministrazione esogena di ABA è in grado di conferire tolleranza allo stress salino in entrambe le cultivar, aumentandone il tasso di sopravvivenza del 20% mediante un’induzione dell’accumulo di prolina (da poco meno di 2 mg g-1 _{di peso secco a quasi 10 mg g}-1 _{dopo 9 giorni di trattamento). In condizioni di}

controllo, invece, l’ABA induce la trascrizione della P5CS1 solo nei genotipi tolleranti. Studi eseguiti sulla sequenza promotrice della P5CS1 del genotipo resistente hanno evidenziato in effetti la presenza di elementi ABRE (abscisic acid responsive elements). Inoltre l’ABA è capace di regolare in maniera positiva un gene responsabile della sintesi di calmodulina (OsCam1-1), il quale ricopre un ruolo attivo nella cascata di trasduzione del segnale in risposta alo stress salino, attivando la sintesi di prolina. Infatti l’espressione della P5CR è indotta in entrambi i genotipi a opera del segnale calmodulina-dipendente, mentre la trascrizione della P5CS1 è attivata solo nel genotipo tollerante (Sripinyowanich et al., 2013).

Come dimostrato in Arabidopsis, la somministrazione esogena di prolina ha un effetto negativo sulla crescita vegetale (Deuschle et al., 2004). Questo sembra provocato da un aumento del catabolismo della prolina che, a sua volta, provoca un accumulo di P5C, tossico per la cellula, e una iperproduzione di ROS derivante dall’attivazione del ciclo prolina/P5C. Tale effetto di inibizione della crescita però non si verifica trattando piante di riso con la sola prolina, mentre risulta evidente quando l’amino acido e lo stress salino sono compresenti, provocando una senescenza precoce dei tessuti. In effetti la quantità di prolina libera aumenta nelle piante trattate col sale rispetto al controllo, ma un aumento maggiore viene osservato nel trattamento con prolina esogena senza e con il sale. Quantificando il perossido

48

di idrogeno, si osserva un innalzamento del suo contenuto paragonabile nei trattamenti con prolina o con il solo sale, statisticamente significativo rispetto al controllo. In piante trattate con entrambi, l’aumento di H2O2 è molto più marcato, come se vi fosse un effetto cumulativo

del sale e della prolina sulla produzione di ROS (Figura 34). Il livello di trascrizione dei geni responsabili della sintesi di prolina (P5CS e P5CR) viene fortemente indotto dallo stress salino. Anche la P5CR, che non rappresenta un passaggio limitante nella sintesi dell’osmolita, viene indotta come in Arabidopsis (Verbruggen et al., 1993). La somministra- zione esogena della sola prolina ha un effetto negativo sull’espressione dei due enzimi, ma nel trattamento con entrambi viene osservata una induzione, confermando un ruolo primario ricoperto dalla prolina nello stress salino non solo come osmolita compatibile, ma anche nell’accumulo di ROS derivante dall’eccessivo catabolismo dell’iminoacido, testimoniato dagli alti livelli di perossido di idrogeno. Una volta riportate le piante in condizioni normo-osmotiche (fase di recupero), si è verificato come atteso un marcato abbassamento nei livelli di prolina. All’origine di tale diminuzione vi è una soppressione della trascrizione della P5CS, mentre in quasi tutti i trattamenti non viene inibita l'espressione della P5CR, i cui livelli di mRNA non sembrano correlati all’accumulo di prolina (Figura 34; Nounjan et al., 2012).

Figura 34. Effetto di diversi trattamenti sul contenuto di prolina e di perossido di idrogeno in plantule di riso. I

trattamenti, durati 6 giorni [NaCl 100 mM (s), prolina 10

mM (p), trealosio 10 mM (t), NaCl e prolina (ps) e NaCl e

trealosio (ts)], sono rappresentati da barre scure, mentre quelle chiare indicano i

valori dopo 5 giorni di recovery. In basso è visualizzato l’effetto di questi

trattamenti sull’espressione degli enzimi biosintetici della prolina (P5CS e P5CR) nelle

foglie di riso, ottenuta mediante sqRT-PCR. Gli

istogrammi riportano la quantità relativa di cDNA rispetto al controllo, dopo normalizzazione con il segnale ottenuto dall’actina (Nounjan et

al., 2012).

Altri lavori hanno sostenuto che il calo nella concentrazione dell’osmolita compatibile sia da attribuire a un’induzione della PRODH piuttosto che a una diminuzione dell’attività della P5CR, anche perché nella fase di recupero la pianta ha un bisogno impellente di energia, visto che durante lo stress il tasso fotosintetico viene ridotto, ed è stato calcolato che l’ossidazione di una molecola di prolina possa fornire 30 equivalenti di ATP (Trovato et

al., 2008). Una conferma in questa direzione è data dall’alta concentrazione di H2O2 che

viene osservata durante la fase di recupero nei trattamenti con sale e prolina+sale (Nounjan

et al., 2012). Una diminuzione dell'attività della P5CR potrebbe comunque non richiedere

49

infatti che la sua attività è stimolata direttamente dal sale, e inibita dal NADP+ _{(Giberti et al.,}

2014), abbondanti nel citosol proprio durante lo stress e durante il successivo recovery.