Analisi Multiple

La valutazione non-distruttiva del contenuto in polifenoli dell’esocarpo di prugne a diversi stadi di maturazione è stata eseguita utilizzando il sensore a fluorescenza Multiplex 3 (Mx) (FORCE-A, Orsay, Francia).

Spettroscopia di fluorescenza:

La spettroscopia di fluorescenza si basa sulla proprietà delle molecole di emettere un fotone dopo l'assorbimento di un altro fotone a minore lunghezza d’onda. Infatti ogni molecola possiede una serie di stati propri e può passare dallo stato fondamentale a più bassa energia ad uno stato eccitato di energia più elevata in seguito all’assorbimento dell’energia di un fotone che interagisce con la molecola. Perché il processo di assorbimento accada è necessario che il fotone abbia un’ energia esattamente pari al salto energetico tra stato fondamentale ed uno stato eccitato (energia di transizione). La molecola nello stato eccitato ha una breve durata, tornando allo stato fondamentale, fenomeno del rilassamento, si può verificare l'emissione di fluorescenza o fosforescenza. La maggior parte delle molecole possiede un basso rendimento di fluorescenza perché la loro struttura è tale che il rilassamento non radiativo può verificarsi più efficientemente dell'emissione di fluorescenza. Alcune molecole avendo una struttura con molti legami coniugati possono essere fluorescenti. Le molecole con uno o più anelli aromatici sono spesso rese fluorescenti.

La fluorescenza della vegetazione

I tessuti vegetali posseggono varie molecole fluorescenti. Quando una foglia viene eccitata da radiazione UV, si possono rilevare due tipi di fluorescenza: fluorescenza blu-verde (BGF) da 400 a 600 nm emessa dagli strati più superficiali; e fluorescenza nel rosso e vicino infrarosso da 650 a 800 nm emessa dal mesofillo. La fluorescenza blu-verde è principalmente degli acidi idrossicinnamici presenti nelle pareti cellulari (Cerovic et al., 1999) ed eventualmente nel vacuolo delle cellule dell’epidermide e del primo palizzata. La fluorescenza nel rosso e vicino infrarosso proviene dalla clorofilla a ed è chiamata fluorescenza clorofilliana. La Clorofilla b come i carotenoidi in vivo trasferiscono tutta l'energia assorbita dalla luce alla clorofilla a. L’intensità di fluorescenza della clorofilla dipende dalla luce incidente che la raggiunge. Solo una parte della luce incidente raggiunge la clorofilla, perché ci sono molecole negli strati più superficiali che assorbono una maggiore o minore quantità di luce a seconda della loro concentrazione e delle loro proprietà spettrali di assorbimento: come nel caso dei flavonoli ed antocianosidi. Le proprietà spettrali dei flavonoli sono state a lungo studiate. I flavonoli presentano forme mesomere corrispondenti al trasferimento degli elettroni mobili. Queste

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forme assorbono in due regioni spettrali: 240-270 nm (UV-B) e 320-380 nm (UV-A). I flavonoli naturali sono molto poco fluorescenti sotto eccitazione UV. Allo stato glicosilato i flavonoli sono solubili e sono localizzati nei vacuoli delle cellule, principalmente nelle cellule dell'epidermide delle foglie (Kolb et al., 2001) e l'epidermide dell’ esocarpo appena sotto la cuticola degli acini d'uva. Essi sono quindi uno schermo che limita la trasmissione dei raggi UV-A verso la clorofilla e quindi provocano un’attenuazione della fluorescenza indotta da questa radiazione.

La fluorescenza della clorofilla eccitata nel blu-verde sarà invece influenzata dall'assorbimento degli antocianosidi (picco di assorbimento intorno a 520 nm), che quindi diminuirà al crescere della concentrazione degli antocianosidi nell’epidermide.

Con la scelta accurata delle lunghezze d'onda, si ottengono segnali di fluorescenza della clorofilla affetti o meno dall’assorbimento dei flavonoli e degli antocianosidi ed è quindi possibile creare indici che rappresentano il contenuto di ciascuna di queste famiglie sia per le foglie che per la frutta.

Questa tecnica è stata recentemente applicata per la determinazione non-invasiva degli antocianosidi delle olive (Agati et al, 2005) e dell’uva (Agati et al, 2007). Inoltre, è stata sfruttata nello sviluppo di sensori a fluorescenza portatili (Multiplex, Force-A, Orsay, Francia) per la sua applicazione direttamente in campo (Tuccio et al, 2011).

Il Multiplex 3 (Mx) è un sensore ottico portatile, alimentato a batterie e comprende 4 sorgenti di eccitazione a LED con bande di emissione nell’UV-A (375 nm), blu (470 nm), verde (515 nm) e rosso (635 nm) e 3 canali di rivelazione a fotodiodi nelle regioni spettrali giallo, rosso e vicino infrarosso. Le ultime due bande spettrali a 680-690 nm e 730-780 nm, corrispondono ai due picchi di emissione della clorofilla. Poiché le sorgenti di eccitazione a LED sono impulsate e sincronizzate con la rilevazione, il sensore è insensibile alla luce ambiente e quindi può essere utilizzato direttamente in campo.

Il tempo di acquisizione è di circa 1 secondo, per sequenze di acquisizione standard con le 4 bande di eccitazione e mediando 500 flash per misura.

I dati acquisiti sono riportati in tempo reale su un display e registrati su una SD (Secure Digital) card per ulteriori analisi. La combinazione dei differenti segnali di fluorescenza nel rosso (FR) e nel vicino infrarosso (FIR) alle varie bande di eccitazione può essere usata per ricavare indici di composti come flavonoidi, antociani e clorofilla.

114 Nel presente lavoro abbiamo utilizzato gli indici: ANTH_R = log(1/ FIR_R)

ANTH_RG = log(FIR_R /FIR_G) per gli antociani, e

SFR_R =FIR_R /FR_R

per la clorofilla, dove FIR_R e FIR_G sono i segnali di fluorescenza della clorofilla nel vicino infrarosso eccitati rispettivamente con luce rossa (R) e verde (G) e FR_R è il segnale di fluorescenza rossa eccitato con luce rossa.

ANTH_R è direttamente correlato al contenuto di antocianosidi, aumentando esponenzialmente nel tempo a partire dall’invaiatura fino alla vendemmia. ANTH_R, invece, inizialmente aumenta con il contenuto di antocianosidi, dopo aver raggiunto un massimo diminuisce con il contenuto di Ant. Questo andamento è dovuto al fatto che per la sua definizione ANTH_RG è la differenza tra due andamenti esponenziali, uno per eccitazione con luce rossa ed uno per eccitazione con luce verde, che hanno diversa costante di salita. Essendo ANTH_R basato su un singolo segnale di fluorescenza, i suoi valori sono molto dipendenti dalle dimensione dell’area di campione misurata e dalla distanza di misura. Questo indice, quindi, può presentare una più alta variabilità rispetto a ANTH_RG che, invece, è basato su un rapporto di due segnali.

Prima di effettuare il calcolo dei vari indici, i segnali di fluorescenza sono stati normalizzati ai relativi valori di uno standard di fluorescenza, in modo da eliminare eventuali variazioni nell’intensità di emissione dei LED all’interno della stessa sessione di misure e tra misure dei vari giorni di rilevamento.

Le acquisizioni attraverso lo strumento Mx sono state eseguite su prugne intere, selezionate in diversi gruppi per punto di colore. Il campione è posto su di una superficie nera non fluorescente. L’analisi è stata eseguita sul frutto singolo e sul gruppo di colore.

Il frutto fresco è stato fornito dall’azienda Castello Banfi. Le prugne sono state differenziate per varietà, sono state prese in esame sia la Ente 303 (E303) che la Ente 707 (E707). Per ciascun clone sono stati selezionati gruppi di prugne in due/tre stadi di maturazione, misurati con il sensore Multiplex. e poi estratti ed analizzati secondo le procedure indicate in materiali e metodi per l’epicarpo.

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