confronto attività antiradicalica PHENOLEA

PHENOLEA ACTIVE S 1.19*10-2 _80,89 PHENOLEA ACTIVE OH-TYR 1.28*10-2 _50,12

Tabella 2.10. Confronto di attività antiradicalica % per estratti Phenofarm

Dalla valutazione delle AAR% si evidenzia che gli estratti fogliari costituiti essenzialmente da molecole di natura secoiridoidica mostrano effetto comparabile e superiore di circa il 25-30% rispetto alla frazione arricchita in idrossitirosolo e derivati.

Nella seguente figura sono mostrate le relative cinetiche di reazione delle suddette frazioni alle concentrazioni riportate in tabella 2.10.

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 10 20 30 ab s tempo [min]

confronto attività antiradicalica

Figura 2.7 Cinetica di reazione di estratti acquosi diluiti Phenolea /DPPH. Le misure riportate sono la media di tre determinazioni, CV% <3%.

Il test del DPPH permette la valutazione dell’efficienza dell’attività antiradicalica mediante l’elaborazione delle curve cinetiche di vari estratti e/o standards messi a confronto a concentrazione simile. Il tempo della cinetica valutata viene standardizzato a 20 minuti, tempo analogo a quello di valutazione delle AAR%. Come mostrato attraverso il valore di AAR%, anche l’efficienza della attività risulta essere migliore per gli estratti fogliari rispetto alle estratto da acque di diluizione di sanse da processo bifasico, nonostante sia stata messa a confronto una diluizione leggermente più concentrata.

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La frazione caratterizzata dalla presenza dell’idrossitirosolo mostra efficacia ed efficienza che risultano essere quindi inferiore rispetto a frazioni con elevata presenza di molecole secoiridoidiche.

Ulteriore parametro ottenibile mediante il suddetto test, raccordabile con parametri di efficacia di interesse biologico, è il valore di EC50. L’EC50 corrisponde alla concentrazione del

campione necessaria a causare la decolorazione del 50% della soluzione di DPPH• (EC50) che viene estrapolata dopo aver effettuato cinetica e valutazione della AAR% di campioni a differenti livelli di concentrazione.

In figura 2.8 si riporta un esempio del grafico ottenuto attraverso questa elaborazione relativo alla frazione Phenolea Active S. I valori ottenuti per gli estratti concentrati liquidi analizzati sono riportati in tabella 2.11.

Figura 2.8 Curva di tendenza calcolata per l’ottenimento del valore di EC50. DPPH a concentrazione 3.40 10-2mM,

R2 _{= 0.997.}

Tabella 2.11 I valori dell’ EC50 delle frazioni liquide Phenolea sopra riportati sono espressi in mM rispetto ad una soluzione di DPPH a concentrazione 3.40 10-2_mM. mM AAR% 0,0119 80,89 0,0024 18,95 0,0048 42,79 0,0060 54,09 Estratti liquidi EC50 mM Phenolea ACTIVE F 0.00676 Phenolea ACTIVE S 0.00544

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Il test del DPPH è stato scelto per valutare se differenti miscele di CMP potessero avere una diversa azione antiradicalica. Dalla tabella 2.12 si evince la forte attività degli estratti Phenolea. È evidente che tutti gli estratti risultano più efficaci di analoghi della vitamina E (Trolox è un derivato idrosolubile della vitamina E), della oleuropeina e del verbascoside. Hanno circa la stessa la attività di OH-Tyr. PHENOLEA ACTIVE S risulta leggermente più attivo (27%), mentre il PHENOLEA ACTIVE F risulta meno attivo di circa il 37%, infine PHENOLEA ACTIVE OH-Tyr ha la stessa efficacia di OH-Tirosolo standard. Tutti gli estratti ed i composti in studio risultano meno attivi dell’acido gallico. I suddetti estratti sono anche stati studiati in confronto con un estratto commerciale denominato PHENO OHTyr GENOSA. In questo confronto, l’estratto PHENOLEA ACTIVE OH-Tyr si è rilevato equipotente, mentre il PHENOLEA-ACTIVE S risulta più attivo ed il PHENOLEA-ACTIVE F meno attivo.

Prodotto/std EC50 mg/L Trolox (Hoffman-LaRoche) std 7.2 Verbascoside std 3.2 Acido gallico std 1.0 Oleuropeina std 11.4 OH-Tyr std 1.9 PHENOLEA ACTIVE S 1.4 PHENOLEA ACTIVE F 2.6

PHENOLEA ACTIVE OH-Tyr 1.9

PHENO OHTyr GENOSA commerciale 1.8

Tabella 2.12 Valutazione della attività antiossidante, test del DPPH. I valori sono ottenuti dalla media di tre determinazioni. CV%< 3%

In particolare, PHENOLEA ACTIVE S, costituita da fenoli, secoiridoidi, idrossicinnamici e flavonoidi, dimostra una attività doppia rispetto al Phenolea ACTIVE OH-Tyr, costituito invece oltre il 90% da idrossitirosolo. La varietà della composizione dell’estratto da foglie secche, come anche nelle foglie fresche, comporta evidentemente un contributo forte, si può ipotizzare un effetto di sinergia tra le classi molecolari nell’attività antiradicalica che si esprime contro il radicale DPPH.

I risultati relativi alle paste concentrate ottenute mediante evaporatore industriale a pompa di calore sono mostrati di seguito:

60 Prodotti in pasta EC50 mg/mg DPPH Phenolea ACTIVE F 0.46 Phenolea ACTIVE S 1.46

Phenolea ACTIVE OH-TYR 2.23

Tab. 2.13 I valori dell’ EC50 di paste concentrate Phenolea, sopra riportati sono espressi in mg pasta/mg di DPPH.

Nella valutazione dell’EC50 elaborato secondo il peso di pasta necessario per abbattere 1 mg di DPPH (tab. 2.13) si osserva che il prodotto più attivo è il Phenolea Active F. Questa informazione può essere utile a livello commerciale per paragonare i quantitativi necessari dei diversi estratti per l’ottenimento di una certa attività antiradicalica, parametro necessario sia per l’utilizzo di tali frazioni come additivi antiossidanti ed antiradicalici, sia per la corretta progettazione e realizzazione di integratori, aspetto descritto nei prossimi paragrafi.

Inoltre, il contenuto totale di polifenoli dei vari estratti PhenoleaTM_{, è stato determinato} usando il metodo Folin-Ciocalteau (FC) di Singleton et al. (1999). Questo test permette di ottenere per via spettrofotometrica, un risultato quantitativo correlabile anche con la capacità antiossidante totale dell’estratto analizzato. L’obiettivo primario dell’applicazione di tale metodo, ottimizzato come analisi dei polifenoli totali nel settore enologico, è stato quello di applicare un test che possa permettere l’ottenimento di una duplice informazione, sia come valutazione del contenuto in principi attivi totali ortodifenolici dell’estratto, sia come informazione delle proprietà antiossidanti totali, utili come parametro in applicazioni sia erboristiche che fitoterapiche.

Nelle tabelle successive si riportano i risultati ottenuti con questo metodo, espressi in mg di polifenoli/g di estratto.

Prodotti in pasta POL TOT mg/g GAE mg/g

Phenolea ACTIVE OH-TYR 333,29 264,80

Phenolea ACTIVE F 243,60 108,82

Phenolea ACTIVE S 67,03 91,46

61

STD GAE mg/g

OLEUROPEINA 388,22

OH-TIROSOLO 1293,86

ACIDO ROSMARINICO 1088

Tabella 2.14 Valori in acido gallico equivalenti per prodotti Phenolea e (sotto) degli standard a confronto. Il metodo Folin-Ciocalteau (FC) si basa su un meccanismo ossidoriduttivo mediante il quale il reattivo interagisce con sintoni molecolari sensibili, nel caso dei polifenoli essenzialmente con i gruppi orto-difenolici, presenti nella molecola. Questo aspetto evidenzia quindi tutte le criticità di interpretazione dei risultati ottenuti con tale metodo, non correlabili con il peso molecolare o con il contenuto quantitativo delle diverse molecole presenti, ma con il loro reale potenziale di ossido-riduzione, relativo sia al numero di siti attivi di scambio con il reattivo, sia con la capacità di aggregare con interazioni intra e intermolecolari che possono far variare la stechiometria della reazione redox.