È stata riportata una correlazione fra l’infiammazione e le malattie cardiovascolari, dove i monociti/macrofagi e il fattore di trascrizione NF-κB hanno un ruolo importante. I macrofagi ed i monociti sono cellule che giocano un ruolo fondamentale nei processi aterosclerotici partecipando alla formazione delle foam cells (Nicolaou et al., 2010).
L'NF-κB (nuclear factor-kappa B) è una proteina complessa che si può trovare in tutti i tipi di cellule ed è interessata in tutte le reazioni delle cellule agli stimoli, quali stress, citochine, radicali liberi, irradiazione con ultravioletti e attacco proveniente dagli antigeni dei batteri o virus (Gilmore, 1999; Lawrence et al., 2009).
L' NF-κB gioca un ruolo chiave nella regolazione della risposta immunitaria alle infezioni, conseguentemente, una non corretta regolazione dell'NF-κB è stata collegata al ai processi infiammatori ed aterosclerotici (Cao et al., 2006; Harari et al., 2010) essendo un controllore dell’immunità innata ed acquisita (Li & Verma, 2002). L’attivazione di NF-κB è necessaria per l’induzione di geni della risposta immune, che includono geni codificanti per citochine e per molecole di adesione.
NF-kB è normalmente poco attivato in monociti e MDM ed è presente come p50/p65 eterodimero o p50/p50 omodimero.
La famiglia NF-κB è costituita da diversi membri, sequestrati nel citoplasma in forma inattiva mediante interazione con un inibitore, appartenente alla famiglia di proteine IkB. In risposta ad un gran numero di stimoli, IkB viene fosforilato e successivamente degradato attraverso la via proteasomale. Questo evento determina la liberazione di dimeri NF-κB (p50 e p65) che, traslocando nel nucleo, promuovono la trascrizione dei geni bersaglio (fig. 2.9)
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Figura 2.9 Descrizione schematica della traslocazione di NF-κB
Le strategie per il trattamento dell’infiammazione cronica si basano sulla capacità di inibire la produzione di mediatori pro-infiammatori e i meccanismi responsabili della loro induzione. In questo contesto, è evidente che inibire NF-κB, che svolge un ruolo centrale nell’induzione dell’espressione di geni pro-infiammatori, significa esercitare un azione antinfiammatoria.
Ulteriore obiettivo di questo Dottorato è stato quello di studiare l’effetto delle frazioni Phenofarm derivate dalle foglie in confronto ad un estratto ottenuto da un olio extravergine d’oliva, particolarmente ricco in CMP e opportunamente purificato dalla frazione lipidica (Phenolea Oil CMP), sulla traslocazione del fattore NF-κB nei monociti e nei macrofagi derivati da monociti (MDM) isolati da volontari sani come descritto in Brunelleschi, 2007. I risultati ottenuti dal trattamento con CMP e flavonoidi ottenuti da foglie di olivo sono stati confrontati con quelli ottenuti con estratto di olio di oliva extravergine utilizzato e riportato in Brunelleschi et al, 2007, opportunamente analizzato per la valutazione della stabilità dell’estratto
stesso. Tale estratto (Phenolea Oil CMP) ha una concentrazione di 40.09 mM è costituito da
idrossitirosolo e tirosolo 10.44 mM, Acido elenolico e derivati 7.56 mM, secoiridoidi e derivati 19.41mM e infine lignani 2.65 mM. L’estratto purificato Phenolea Oil CMP utilizzato ha mostrato ripetizione stessa composizione e stabilità di estratto. Come per l’estratto da olio è stata costruita una curva dose effetto tra 10-9 e 10-5M (calcolata sui CMP totali) e misurata l’attivazione del fattore di trascrizione NF-κB su cellule isolate di volontari sani non fumatori. In questo contesto, gli estratti di foglie saggiati tra 10-9 e 10-5M non inibiscono NF-κB in nessuna della concentrazioni indagate a differenza di quanto avviene con gli estratti dell’olio extravergine toscano che riescono ad inibire (alla concentrazione 10-5 M) tale fattore di
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trascrizione in entrambi tipi cellulari (monociti e macrofagi) in condizioni basali e dopo stimolazione.
Tutti gli esperimenti effettuati sia PHENOLEA ACTIVE F che su PHENOLEA ACTIVE S hanno mostrato analogo comportamento di inefficienza o non significatività di risultato.
L’estratto di olio inibisce in modo concentrazione-dipendente (10-9 - 10-5M) la traslocazione nucleare della subunità p50: alla concentrazione più alta 10-5M la traslocazione della p50 indotta da PMA è inibita del 70% circa sia nei monociti (p<0.001) che nei MDM (p<0.01). L’estratto è attivo come il PPAR-γ agonista ciglitazone, un noto inibitore dell’attivazione di NF-kB, che è stato usato come controllo positivo.
Alla concentrazione più alta, l’estratto fenolico riduce significativamente anche la traslocazione della subunità p50 nei monociti non stimolati (p<0.05).
La traslocazione di p65 nelle cellule non stimolate non è inibita dai CMP dell’estratto di olio d’oliva extravergine, mentre inibiscono in maniera dose dipendente la traslocazione dopo stimolazione.
In tabella 2.16 si riportano risultati di alcuni dei casi valutati, in particolare la tabella si riferisce agli effetti dopo trattamento con PMA (10-6 M per 1h) della frazione da foglie fresche Phenolea Active F a confronto dell’estratto da olio (Phenolea Oil CMP) per la concentrazione 10-5M.
Monociti Stimolate con PMA
Controllo p50 p65
Estratto [10-5M]
Phenolea Oil CMP 100 36.3±3.9*** 46.3±3.9** Phenolea Active F 100 97.1±4.4 98.6±6.6
Macrofagi Derivati dai Monociti Stimolate con PMA
Controllo p50 p65
Estratto [10-5M]
Phenolea Oil CMP 100 24.3±4.9** 25.3±3.1*** Phenolea Active F 100 97.1±4.3 98.6±3.4
Tabella 2.16: I valori sono espressi come N/C (quantità nucleare/citoplasmatica) e rappresentano la media ±SEM di cinque esperimenti indipendenti e prendendo come 100 il valore di controllo. **P<0.01;***P<0.001
La subunità p50 sembra svolgere un ruolo importante nell’aterosclerosi. L’over espressione della proteina p50 induce la trascrizione di uno dei maggiori marker dell’infiammazione
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cardiovascolare. La capacità quindi dell’estratto di olio di inibire in modo dose-dipendente la traslocazione della proteina p50 può avere un ruolo terapeutico importante anti- aterosclerotico e quindi contribuire fortemente all’attività cardio protettiva dell’olio extravergine d’oliva.
L’effetto su NF-κB si accompagna all’inibizione della liberazione di citochine. Paradossalmente l’estratto di foglie, che non inibisce NF-κB , aumenta la liberazione delle citochine; nel loro insieme questi ultimi dati evidenziano che l’estratto da foglie al contrario degli estratti di olio extravergine, non ha azione antinfiammatoria. I risultati ottenuti mostrano attività in frazioni estratte da oli dove il contenuto in oleocantale e altri secoiridoidi risulta in concentrazioni dell’ordine della mM. In definitiva, suggerendo che l’azione antiradicalica, evidenziata con il test del DPPH correlato all’effetto antiossidante sulle LDL umane e l’attività antiossidante, non correlano con l’attività antinfiammatoria negli estratti fogliari da Olea.
Considerando però che durante la risposta infiammatoria viene prodotta una notevole quantità di ROS è possibile che le molecole con attività antiradicalica ed antiossidante possono esercitare anche una azione antinfiammatoria o coadiuvarne l’effetto in associazione molecolare o sinergia.
Ulteriore aspetto da considerare è la presenza nell’estratto da olio dell’oleocantale, molecola naturale con proprietà antinfiammatorie simili a quelle dell’antinfiammatorio non steroideo Ibuprofen, in grado di inibire le ciclo-ossigenasi COX-1 e COX-2 nella sintesi delle prostaglandine (Beauchamp et al., 2005).
Come precedentemente riportato, la dieta mediterranea fornisce 10-20 mg di fenoli al giorno, con livelli plasmatici di CMP dell’ordine di 0,6 μM (Visioli et al., 2000), che è un valore largamente conforme alle concentrazioni utilizzate in vitro. Il potenziale antinfiammatorio dell’estratto fenolico di olio extravergine d’oliva è evidenziato dalla capacità di inibire, a concentrazioni possibili con la dieta, l’attivazione del fattore NF-κB in monociti e MDM stimolati. Questo risultato rafforza l’idea dell’effetto cardio-protettivo di diete ricche in olio extravergine d’oliva.
Parallelamente, analoghi studi su oli di altre composizioni sono attualmente in valutazione, i risultati derivanti da frazioni di CMP da olio diversamente costituiti, potrebbero essere sfruttabili per poter progettare e realizzare un estratto commerciale utilizzabile in integratori o fitoterapici a specifica azione antiinfiammatoria, provenienti dalla matrice Olea.
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E’ stata anche misurata la liberazione di tumor necrosis factor alfa (TNF alfa), una importante citochina pro-infiammatoria, da parte dei monociti stimolati con PMA 10-6 M. L’estratto di olio extravergine toscano alle stesse concentrazione in cui inibisce la traslocazione di NF-κB è in grado di inibire in maniera dose dipendente la liberazione di tale citochina. Mentre l’estratto di foglie, che non inibisce NF-κB , aumenta la liberazione di TNF alfa anche a 10-8 M.