Sono state considerate molteplici applicazioni in campo alimentare, cosmetico e come basi per integratori alimentari, alcune delle quali saranno descritte nei paragrafi successivi. L’ utilizzazione e la progettazione di nuovi prodotti a base di ingredienti naturali studiati come antiossidanti o antimicrobici in ambito di processi produttivi alimentari ha preso in considerazione in particolare la frazione contenente idrossitirosolo o una frazione commerciale opportunamente studiata in modo da poter sfruttare sia le proprietà antiossidanti ed antiradicaliche dei composti sia quelle di natura antimicrobica già riportate in letteratura sull’oleuropeina e idrossitirosolo (Bisignano et al., 1999).
In particolare in campo alimentare sono state eseguite prove di sostituzione dell’antiossidante industriale con l’estratto PhenoleaTM Complex su carni suine e bovine
fresche e surgelate. I test sono stati realizzati in collaborazione con un Laboratorio di Controllo qualità certificato ISO 45000. Attraverso diverse prove condotte su preparati carnei prodotti da un’azienda leader del settore è stata analizzata l’attività dell’estratto sulla stabilità ossidativa dei grassi e la prevenzione dell’ossidazione del prodotto in confronto ad altri antiossidanti usati nell’industria alimentare. Tali studi sono stati improntati a mostrare l’attività dell’estratto sulla stabilità ossidativa dei grassi e la prevenzione dell’ossidazione del prodotto. Le prove sulle carni bovine macinate (hamburger) hanno dimostrato che l’estratto
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è un potente antiossidante, infatti dal test del numero di perossidi e saggio di Kreiss si rileva un fattore di protezione analogo a quello dell’acido ascorbico per dosaggi pari al 15-25% di quest’ultimo. Sono stato valutati positivi anche l’esame organolettico e visivo. Su campioni di carne suina macinata (salsicce) addizionate con PhenoleaTM Complex si riscontra una diminuzione, concentrazione dipendente, dell’ossidazione lipidica (TBARS test) rispetto al controllo. I dati dimostrano l’efficacia dell’estratto PhenoleaTM Complex nel contenimento del numero di perossidi e dei TBARS a differenza dell’ascorbato che agisce solo sui TBARS non influendo sul numero di perossidi.
Ulteriori studi sono in corso per l’ottimizzazione di ingredienti alimentari contenenti oltre ad estratti da foglia di olivo, estratti contenenti acidi idrossicinnammici e tannini idrolizzabili provenienti da altre specie vegetali. In particolare la collaborazione è stata organizzata con una ulteriore azienda di produzione di estratti naturali, la Biotech con la quale sono in corso prove di stabilizzazione di hamburger di suino, di bovino, salsicce e preparati a base di carne di pollo e tacchino, che sfruttano la sinergia di attività antiossidante ed antimicrobica specifica di particolari sottoclassi polifenoliche presenti.
È stato inoltre progettato l’utilizzo dell’estratto PhenoleaTM Active S ed F come antiossidante
da utilizzarsi in prodotti da forno. A tale scopo è sono stati forniti ad una azienda produttrice di fette biscottate gli estratti Phenolea Active F ed S da sostituirsi singolarmente in quantità analoghe all’antiossidante industriale utilizzato in fase di lavorazione. Le due partite di fette biscottate ottenute (insieme ad un campione ottenuto con il processo standard) sono state valutate dal punto di vista organolettico e sottoposte a test accelerati per valutare la shelf life del prodotto alimentare presso un laboratorio certificato. I risultati confermano l’ottenimento di un prodotto conforme dal punto di vista organolettico e di sicurezza alimentare. Si riportano a titolo d’esempio in tabella 2.15 i risultati analitici ottenuti su fette biscottate dopo 10 gg di incubazione a 50°C (corrispondente ad un mese di vita naturale) eseguiti dal Laboratorio di analisi chimiche e microbiologiche dott. Ricciarelli Sansepolcro (AR) con il quale siamo in collaborazione.
Parametri ricercati:
Unità di misura
Valore ottenuto Metodo
Analitico
1 2 3
Umidità a 105 °C % 2,42 2,87 3,09 Essiccazione
Acidità totale % 0,38 0,28 0,25 Titolazione
N° perossidi meq O2/Kg 1,00 0,95 1,00 Titolazione
Reazione di Kreiss Negativa negativa negativa Titolazione
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Tabella 2.15. Fette biscottate Grondona bianco; 2- Fette biscottate Grondona Phenolea F; 3- Fette biscottate Grondona Phenolea S.
L’utilizzo di questi estratti si pone quindi come reale alternativa naturale ed efficace rispetto ad altri antiossidanti naturali e sintetici, e consente ai produttori alimentari di agire sulla
shelf-life pur mantenendo un’etichetta naturale.
Ad oggi esistono in commercio biscotti farciti al cioccolato, alle mandorle e semplici stabilizzati con i precedenti estratti Phenofarm, oltre alla produzione di piadine e basi pizza. La criticità delle applicazioni di tali ingredienti è legata alla corretta armonizzazione dose/effetto indispensabile per efficacia ed efficienza, senza modificare le caratteristiche organolettiche del prodotto, garantendo alla azienda la possibilità di usare ingredienti naturali ad un prezzo competitivo con quello di ingredienti/additivi sintetici.
2.3.2.3 Attività biologica di interesse biomedico
In seguito a tutta una esperienza effettuata su estratti da olio, rivolta come precedentemente e in seguito descritta, sulle proprietà antiossidanti, di prevenzione su patologie neoplastiche (Salvini et al., 2006; Pampaloni et al., 2012), antiaggreganti ed antinfiammatorie, la nostra attenzione si è rivolta maggiormente allo studio dell’attività biologica in ambito biomedico anche per l’utilizzo genere specifico nella prevenzione delle patologie invecchiamento correlate (Brevetto italiano, MI2011A001042), con particolare riferimento alle frazioni Phenofarm, precedentemente descritte, messe a confronto con una frazione di CMP purificati provenienti da olio extravergine toscano (Phenolea Oil CMP). I CMP, metaboliti secondari delle piante (Duthie et al., 2003),presenti in oli extravergine di oliva, come accennato in precedenza, hanno proprietà antiossidanti (Fito et al., 2000; Massaro et al., 2002; Carluccio et
al., 2003; Masella et al., 2004; Covas et al., 2006; Franconi et al., 2006) ed è noto che le specie
reattive dell’ossigeno siano implicate in numerosi eventi patologici come le malattie cardiovascolari come ipertensione, aterosclerosi, insufficienza e scompenso cardiaco, nell’ischemia-riperfusione, in malattie dismetaboliche come il diabete, il cancro, e le malattie infiammatorie (Dantas et al., 2004, Lawless et al., 2010, Gonzalez et al., 2010).
Precedenti attività di ricerca, riportate in riviste internazionali di settore, sia dal nostro gruppo di ricerca che da ricercatori di altri Atenei, hanno dimostrato che il radicale stabile commerciale DPPH agisce in modo analogo o correlabile rispetto a radicali di interesse biologico quali superossido e radicale idrossile (Baratto et al., 2003) ed acqua ossigenata.
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L’analogia di comportamento è dimostrata anche per l’effetto dose/dipendente antiossidante ed antiradicalico sino a definire i limiti di potenziale attività proossidante. A tal proposito, considerando in particolare polifenoli standard galloilati, flavonoidi, secoiridoidi quali l’oleuropeina ed estratti polifenolici standardizzati provenienti da olio, acque reflue di frantoio e tessuti di specie Cynara, la correlazione e l’analogia di comportamento è stata dimostrata anche tra DPPH ed ossidazione delle LDL umane (Baratto et al., 2003; Coinu et al., 2006; Romani et al., 2007). Quanto sopra permette di poter utilizzare questo test in vitro ed i relativi risultati come significativi dal punto di vista biologico e biomedico.
I processi di invecchiamento sono caratterizzati da stress ossidativo (Harman et al., 2003) e da processi infiammatori (Bandeen Roche et al., 2009), pertanto i CMP dell’olio extravergine che esercitano un elevato potere anti-ossidante, potrebbero trovare un impiego per rallentare l’invecchiamento e le malattie invecchiamento correlate.
Riassumendo, attraverso le attività di ricerca scientifica finora condotte dal gruppo di ricerca, ottenute grazie alle numerose collaborazioni, è stato evidenziato che gli estratti purificati di olio extravergine di oliva, inibendo la perossidazione delle LDL umane indotta dal solfato di rame, hanno una forte attività antiossidante che dipende dal tipo di componenti polari minori (CMP) presenti negli estratti (Franconi et al., 2006). L’estratto a maggiore attività antiossidante poi inibisce, nei macrofagi umani, in maniera dose dipendente l’attivazione di NF-κB (Brunelleschi et al., 2007) e la liberazione di citochine dalle stesse cellule (Brunelleschi
et al., 2010). Visto il ruolo di NF-κB e dei macrofagi nella reazione infiammatoria e nella
aterosclerosi, i precedenti risultati indicano che i composti minori polari presenti in tale estratto possono essere utilizzati nella prevenzione di malattie infiammatorie e cardiovascolari. Quest’ultimo suggerimento trova riscontro anche nell’azione antiaggregante vista nel ratto, usando come agente aggregante l’ADP, dopo somministrazione orale di olio extravergine di oliva arricchito in CMP (Priora et al., 2008).
Allo scopo di verificare, in modo innovativo se le frazioni oggetto di studio potevano essere applicate in ambito della prevenzione delle malattie cardiovascolari ed invecchiamento correlate sono stati eseguiti esperimenti su VSMC isolate dall’aorta di ratto e su cellule isolate da sangue umano quali, monociti e macrofagi derivati da monociti perché queste cellule come illustrato hanno importanti ruoli nella reazione infiammatoria e nell‘aterosclerosi. I risultati di tali ricerche sono stati ampiamente descritti nel documento di registrazione del brevetto sopra citato e hanno riguardato la valutazione dell’attività antinfiammatoria, dello stato redox cellulare, del destino cellulare valutate per le frazioni Phenofarm e messe a confronto con un estratto purificato di olio extravergine toscano (Phenolea Oil CMP). Gli esperimenti
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sono stati fatti differenziando cellule che derivano da femmine e da maschi in modo da valutare anche la risposta in funzione del genere. Recenti sono gli studi che iniziano a correlare le diverse attività genere dipendenti di varie sottoclassi e composti puri di natura polifenolica (Campesi et al., 2013).
Si riportano di seguito le principali osservazioni ottenute dai vari test cellulari applicati ed elaborati in collaborazione sia con il Dipartimento di Scienze del Farmaco di Sassari, Prof. Flavia Franconi sia il Dipartimento di Scienze Mediche dell’Università del Piemonte Orientale, Prof. S. Brunelleschi. Ulteriore collaborazione e di valutazione di attività biologica, è stata condotta con la collaborazione del Prof. W. Malorni e Dott. E. Straface afferenti rispettivamente all’Istituto San Raffaele (L’Aquila) all’Istituto Superiore d Sanità di Roma.