L’attività di questo lavoro di dottorato ha previsto tre diversi periodi di stage a Sassari, svolto presso il Dipartimento di Scienze del Farmaco sotto la supervisione della Prof.ssa Flavia Franconi ha riguardato lo studio dei possibili effetti in termini di attività autofagica di cellule trattate e non con estratto di olio purificato contenente i CMP dell’olio.
Viste le differenze di genere in attività biologica, precedentemente riportate in relazione alla produzione cellulare dei ROS a livello basale e volendo indagare l’attività autofagica in risposta alle variazioni dello stato redox, sono in corso test specifici sulla valutazione della attività autofagica e la relativa correlazione sia in funzione dell’ambiente redox che successivamente in funzione delle caratteristiche quali-quantitative di estratti da poter testare o di singole molecole da dover indagare come specifici antiossidanti.
I dettagli molecolari del processo autofagico sono stati ben caratterizzati nel lievito
Saccharomyces cerivisiae, in proteine codificate da un gruppo di geni che regolano l’autofagia,
e che l’evoluzione ha conservato negli eucarioti, fino all’uomo (Kihara et al., 2001).
Per essere meglio compreso, il processo autofagico è stato analizzato attraverso 5 stadi i quali, cronologicamente, sono caratterizzati da: regolazione dell’induzione, sequestro di membrana, enucleazione vescicolare, allungamento della vescicola, formazione dell’autofagolisosoma. Nel primo stadio, si assiste a una fine regolazione ad opera della
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proteina chinasi mTOR sulla fosforilazione della proteina autofagica Atg13. Un’inibizione di mTOR induce la defosforilazione di Atg13 e l’associazione di quest’ultima al complesso Atg1- Atg17. Da questa associazione Atg1 assume attività catalitica e induce l’autofagia.
Figura 2.10 Principali step del processo autofagico
Nel secondo e terzo stadio una PI3K, genera PI3-fosfato. L’attivazione di questa chinasi dipende dalla formazione di un complesso multiproteico, il quale vede la partecipazione della beclina, omologo umano di Atg6, una chinasi miristilata (la Vsp15) e il gene9 soppressore tumorale associato all’irradiazione da parte dei raggi ultravioletti (UVRAG). La beclina è stata originariamente identificata come partner molecolare coinvolto nell’interazione con Bcl-2, mediata dal dominio BH3 (Oberstein et al., 2007). Nel digiuno, viene indotta la dissociazione di Bcl-2 dalla beclina, quest’ultima si rende disponibile per la formazione del complesso multiproteico con Vsp15 e UVRAG, essenziale nelle prime fasi dell’autofagia. Questa quindi potrebbe essere una via tramite la quale il digiuno induce l’autofagia (Criollo et al., 2007). Nel quarto stadio avviene il processo di allungamento vescicolare, il quale prevede il coinvolgimento di due sistemi di coniugazione di tipo ubiquitino. Una via implica il legame covalente di Atg12 con Atg5, catalizzato dall’enzima Atg7 o dall’enzima Atg10. Un’altra via implica la coniugazione di un glicerofosfolipide presente nel plasmalemma, la fosfatidiletanolammina (PE), all’omologo umano di Atg8 di lievito, la proteina LC3, grazie all’attività sequenziale di Atg4, Atg3 e Atg7. La coniugazione lipidica ha lo scopo di convertire LC3I in LC3II, ovvero la forma solubile di LC3, a localizzazione citosolica, è convertita in una forma che si associa alla membrana della vescicola autofagica (Mizushima, 2007). Questo sistema è modulato dall’attività di diverse protein-chinasi, fra le quali AKT e mTOR. AKT è presente in tre diverse isoforme nei mammiferi (AKT1, AKT2, AKT3), note anche come
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proteine chinasi B (PKB), rispettivamente di tipo αβγ codificate da geni diversi (Akt1, Akt2, Akt3), i quali codificano per enzimi membri della famiglia delle proteine chinasi serina- treonina specifiche con diversi ruoli.
Sono stati presi in considerazione colture primarie di cellule endoteliali vascolari umane estratte dalla vena di cordoni ombelicali (HUVECs), appartenenti a neonati sia maschi che femmine, allo scopo di studiare, tenendo conto del sesso/genere. È stata valutata l’espressione attraverso tecniche di Western Blot di marker autofagici, quali beclina, mTor, LCI e II e AKT nelle colture cellulari sottoposte al trattamento con i CMP e colture cellulari di controllo. Sono state utilizzate cellule endoteliali umane estratte da vene di cordoni ombelicali (HUVEC) di neonati maschi e femmine. I funicoli, forniti dal Dipartimento di Farmacologia, Ginecologia e Ostetricia dell’Università di Sassari, sono stati selezionati tenendo in considerazioni diversi parametri elencati di seguito: il sesso del neonato, il tipo di parto e di gravidanza, la razza e l’età della partoriente, l’uso di tabacco prima e/o durante la gravidanza, il peso corporeo, eventuali malattie fra cui il diabete gestazionale e il trattamento farmacologico. I dati così ottenuti sono stati raccolti in una scheda riepilogativa, previa autorizzazione al trattamento dei dati personali delle puerpere. È stata scelta questa linea cellulare per la relativa facilità di isolamento, gli esperimenti sono stati condotti ai primi passaggi, questo perché la fisiologia delle HUVEC cambia in funzione del numero dei passaggi (Hastings et al., 2004).
Ulteriore obiettivo del periodo di stage è stato quello di ottimizzare particolari disegni sperimentali applicabili a cellule endoteliali oltre che su estratti da olio di oliva ed olea anche su altre sottoclassi polifenoliche opportunamente caratterizzate e purificate. Per l’isolamento
delle cellule endoteliali si è proceduto incannulando la vena dei cordoni e lavando due volte
con PBS senza Ca2+/Mg2+ (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) per allontanare eventuali grumi di sangue che ostruiscono il lume. Il trattamento con collagenasi Type 1A (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) ad una concentrazione di 110U/ml, per 10 minuti a 37°C, in incubatore, permette il distacco delle cellule endoteliali. Il prodotto della digestione è stato recuperato e centrifugato per 10 min. Il pellet è risospeso e dopo conta cellulare le cellule vengono seminate ad una determinata densità in fiasche con coating di gelatina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA). Le cellule sono state coltivate in terreno di coltura M199 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) addizionato del 10% FBS (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA), 10% NBCS (Sigma- Aldrich, Saint Louis, USA), 2mM L-Glutammina e 1% di antibiotici/antimicotici (Sigma- Aldrich, Saint Louis, USA) e mantenute a 37°C in atmosfera umidificata al 5% di CO2 in incubatore.
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Figura 2.11 A sinistra, fase isolamento delle cellule da cordone, cellule HUVEC isolate a destra
Le cellule utilizzate per i trattamenti sono state portate tra p3 e p5; si è scelto di testare l’estratto di olio extravergine a tre concentrazioni differenti 5, 10 e 20 uM più un controllo per ogni cordone, in doppio. L’estratto utilizzato come trattamento è stato ottenuto da olio extravergine di oliva toscano estratto e purificato come descritto in Brunelleschi et al., 2007. L’estratto è stato analizzato in HPLC/DAD/MS, i risultati quali quantitativi sono riportati in tabella 2.18. EVOO extract mM OH-Tirosolo 0.95 Tirosolo 0.56 AE der. 1.11 Ac. Elenolico 2.48 DACOLAG 8.01 Oleocantale 5.06
Somm. Secoir. der. 8.71 acetossipinoresinolo 2.28 Oleuropeina aglic. 3.86 der ac. p-coumarico 0.01
Luteolina 0.12
somma CMP 33.14
Tabella 2.18 Analisi qualiquantitativa dei CMP di un estratto purificato di olio toscano (Az. Manni) I valori sono la media di tre determinazioni, CV%<3%.
Sono stati selezionati, in funzione delle disponibilità, 4 cordoni di maschi e 4 di femmine. Una volta ottenute le cellule al passaggio adeguato, queste vengono tripsinate, contate e seminate ad una densità di 20000 per cm2 con terreno in cui è stato addizionato l’estratto di olio diluito nel terreno stesso dopo filtrazione sterile. Il protocollo stabilito prevede 24 h di trattamento,
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le cellule vengono tripsinizzate e lisate secondo procedura. Il lisato cosi ottenuto è stato sottoposto a determinazione proteica con il Bradford Reagent (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) utilizzando il Micro 2 ml Bradford Assay Protocol. Dopo aver determinato la concentrazione proteica dei campioni, una uguale quantità di proteine è stata separata attraverso il 12% SDS-PAGE e trasferite su membrana di PVDF. Le membrane sono state poi bloccate con Tris buffered saline-Tween 20 (TBST) contenente 5% di latte e incubate con l’anticorpo primario overnight a 4°C. Dopo lavaggi con TBST le membrane sono state incubate con anticorpo secondario coniugato con HRP per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo un secondo round di lavaggi con TBST, le membrane sono state sviluppate con il sistema ECL. Gli anticorpi primari utilizzati sono i seguenti: AKT, Beclin-1, mTOR, polyclonal anti-LC3 (MBL, International Corporation, Woburn, USA), anti-Actin (20-33) IgG fraction of antiserum (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA). Sulle lastre fotografiche ottenute è stata eseguita l’analisi densitometrica mediante il software LabWorks; le misure densitometriche delle varie proteine sono state normalizzate sulle bande dell’actina.
Attualmente è in corso l’analisi statistica con il software SigmaStat, dalle valutazioni preliminari non risultano però particolari evidenze, ciò potrebbe dipendere anche dal numero ristretto di campioni finora sottoposti all’esperimento, in aggiunta è doveroso sottolineare che il protocollo è di nuova applicazione.