etidio
Le analisi di spettroscopia di fluorescenza condotte sulle soluzioni acquose contenenti PEGMA77-co-AF23 e il bromuro di etidio hanno evidenziato che, in determinate condizioni, il colorante rimane inglobato nelle strutture auto-assemblate formate dal copolimero anfifilico. Per studiare in maggiore dettaglio le interazioni molecolari in soluzione, sono state preparate alcune soluzioni acquose di PEGMA74-co-AF25-co- JCBF1 con lo stesso colorante EtBr. Infatti, nel caso in cui la distanza tra JCBF e EtBr sia inferiore a ≈ 10 Å si potrebbe osservare, mediante analisi di spettroscopia di fluorescenza, il fenomeno di trasferimento di energia per risonanza (Fluorescence
Resonance Energy Transfer, FRET).
Il processo FRET consiste essenzialmente nell'effetto combinato di due molecole in grado di emettere fluorescenza in seguito ad una eccitazione. A una lunghezza d’onda specifica si ottiene l’assorbimento massimo di uno dei due coloranti, definito donatore. Quest’ultimo, eccitato, può emettere in fluorescenza secondo il suo spettro tipico di emissione. Se lo spettro di emissione del donatore si sovrappone in maniera consistente a quello di assorbimento dell’altro fluoroforo (accettore), il donatore eccitato non emette in maniera radiativa ma trasferisce l’energia per risonanza all'accettore, che emetterà un quanto luminoso alla sua lunghezza d'onda caratteristica. Il trasferimento di energia avviene attraverso interazioni dipolo-dipolo a lungo raggio. Secondo tale principio, il fluoroforo eccitato può essere inteso come un dipolo oscillante, in grado di trasferire energia ad un secondo dipolo che abbia una simile frequenza di risonanza. Il trasferimento di energia per risonanza non è sensibile al tipo di solvente in cui si trova il campione, ma dipende esclusivamente dalla distanza tra le molecole, e non dalle caratteristiche del mezzo da attraversare. [76, 77]
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In questo studio, inizialmente, è stata verificata la sovrapponibilità dello spettro di emissione di fluorescenza del JCBF con lo spettro di assorbimento del EtBr, requisito necessario per il fenomeno FRET (Figura 3.32).
Figura 3.32: Spettro di assorbimento UV-Vis (blu) dell’EtBr in soluzione acquosa e spettro di emissione di
fluorescenza (nero, λecc= 405 nm) di una soluzione di JCBF in acqua con la zona di sovrapposizione spettrale
Verificato tale requisito, sono state preparate soluzioni acquose a diversa concentrazione di terpolimero PEGMA74-co-AF25-co-JCBF1 e EtBr, come riportato in Tabella 3.18
Tabella 3.18: Concentrazione delle varie soluzioni acquose preparate
PEGMA74-co-AF25-JCBF1 [mg/mL] JCBF [M] EtBr [M] BiancoJ 2,75 7,99*10-5 - BiancoE - - 7,08*10-5 BiancoE’ - - 7,95*10-4 Sol J:E 2,75 7,99*10-5 7,08*10-5 Sol J:E’ 2,75 7,99*10-5 7,95*10-4
Le analisi di spettroscopia di fluorescenza sono state condotte eccitando le soluzioni alla lunghezza d’onda di 405 nm, assorbimento massimo di JCBF.
In Figura 3.33 sono confrontate le curve di emissione di fluorescenza tra il BiancoJ e quelle di Sol J:E e Sol J:E’.
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Figura 3.33: Spettri di emissione di fluorescenza (λecc = 405 nm) delle soluzioni acquose BiancoJ, Sol J:E e Sol J:E’
Dalla Figura 3.33 si può osservare che l’intensità di emissione della soluzione acquosa BiancoJ, non può essere registrata in quanto maggiore del fondo scala dello strumento. Confrontando le curve di emissione di fluorescenza di BiancoJ, Sol J:E e Sol J:E’ (Figura 3.33), si nota che nelle soluzioni dove è presente l’EtBr avviene una diminuzione di intensità di emissione in corrispondenza del massimo caratteristico del rotore molecolare JCBF (510 nm). In particolare nella soluzione acquosa Sol J:E, dove JCBF e EtBr sono presenti in un rapporto stechiometrico, si registra un’intensità di emissione a 510 nm intorno a 600 u.a., che diminuisce fino a ~10 u.a. nella soluzione Sol J:E’, dove il rapporto tra JCBF e EtBr è 1:10. In quest’ultima, inoltre, si rileva una emissione di fluorescenza seppur debole a 607 nm, massimo di emissione caratteristico del bromuro di etidio. Un aspetto da considerare è che le strutture auto-assemblate sono sistemi dinamici e quindi non è possibile quantificare con esattezza il numero di molecole di EtBr, inglobate nelle catene macromolecolari ripiegate. Probabilmente, anche se è stata preparata una soluzione in eccesso di EtBr, le molecole di tale colorante, intercalate nei sistemi auto-assemblati, sono in difetto rispetto a quelle libere e alle molecole di JCBF. Questo potrebbe spiegare il motivo per cui nello spettro di emissione di fluorescenza della soluzione Sol J:E (JCBF:EtBr = 1:1) non sia presente il massimo a 607 nm. Ulteriori studi di spettroscopia di fluorescenza su soluzioni acquose a diverso rapporto di concentrazione dei fluorofori potrebbero essere utili a osservare un
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 420 470 520 570 620 670 In ten sità (u .a) Lunghezza d'onda (nm) Sol J:E' BiancoJ Sol J:E
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aumento più significativo dell’intensità di emissione in corrispondenza del massimo dell’EtBr dopo il FRET.
In figura 3.34 sono confrontati gli spettri di emissione di fluorescenza della soluzione acquosa di BiancoE’, eccitata alla lunghezza d’onda del massimo di assorbimento (520 nm) del EtBr, e della soluzione acquosa Sol J:E’ eccitata alla lunghezza d’onda del massimo di assorbimento (405 nm) del JCBF.
Figura 3.34: Spettri di emissione di fluorescenza della soluzione acquosa Sol J:E’ (λecc = 405 nm) e della soluzione
acquosa BiancoE’ ((λecc = 520 nm)
Dalla Figura 3.34 è stato possibile osservare che sia lo spettro della soluzione acquosa BiancoE’, eccitato a 520 nm, che lo spettro della soluzione acquosa Sol J:E’, eccitata a 405 nm, presentano un massimo di emissione a 607 nm, relativo al bromuro di etidio. Da questi risultati è possibile supporre che l’EtBr sia a una distanza tale dal rotore molecolare, legato covalentemente al polimero, da poter assorbire l’energia emessa a 510 nm da JCBF e riemetterla in fluorescenza a 607 nm. Dalla Figura 3.34 si nota anche che l’intensità di emissione a 607 nm della soluzione acquosa Sol J:E’ è maggiore rispetto a quella registrata nello spettro di emissione della soluzione acquosa BiancoE’. Questo è dovuto al fatto che, come riscontrato nelle analisi di spettroscopia di fluorescenza di soluzioni acquose contenenti PEGMA77-co-AF23 e il colorante (Paragrafo 3.8), le molecole di EtBr aumentano significativamente la propria intensità di fluorescenza quando si trovano inglobate nelle strutture auto-assemblate, rispetto a quando sono libere in soluzione.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 430 480 530 580 630 680 730 In ten sità (u .a) Lunghezza d'onda (nm) BiancoE' Sol J:E'
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Dalle analisi condotte è stato possibile constatare che un certo numero di molecole di EtBr si trovano a una distanza di almeno 10 Å con i sistemi auto-assemblati poiché è stato riscontrato un trasferimento di energia per risonanza tra i due fluorofori. Studi di spettroscopia di fluorescenza a diverse temperature su tali soluzioni acquose potrebbero essere un proseguimento del lavoro di tesi, utile a spiegare il fenomeno di aggregazione delle singole catene ripiegate del copolimero anfifilico.