Rotori molecolari

Alcuni fluorofori sono in grado di modificare le proprie caratteristiche ottiche in seguito a modifiche della mobilità molecolare: i più danno fenomeni di smorzamento della fluorescenza a causa della loro aggregazione (Aggregation Caused Quenching, ACQ); altri sistemi fluoroforici sono invece caratterizzati da un’emissione indotta dopo loro aggregazione (Aggregation Induced Emission, AIE).[55] I coloranti luminescenti che presentano proprietà ACQ sono caratterizzati dalla presenza di anelli aromatici che li rendono poco solubili in acqua, dove invece tendono ad aggregare, e molto solubili in solventi organici. La presenza di questi anelli aromatici favorisce la formazione di aggregati che vengono tenuti insieme da interazioni secondarie. Questi tipi di fluorofori presentano una netta diminuzione dell’intensità di fluorescenza all’aumentare della concentrazione, dal momento che gli anelli aromatici delle catene si trovano sempre a distanze minori e quindi diventa molto più probabile che ci sia un’interazione di tipo π- π. Al contrario delle molecole ACQ, le molecole AIE presentano elevata emissione di fluorescenza durante la loro aggregazione (aggregacromismo). Le molecole capaci di AIE più comuni sono dotate di gruppi con elevata inerzia, come ad esempio sistemi aromatici, legati da legami semplici che permettono di far ruotare le varie porzioni della molecola. Quando i moti intramolecolari vengono ostacolati, la dissipazione dell’energia assorbita dai fotoni incidenti in cammini non radiativi viene fortemente ostacolata e la riemissione in fluorescenza diventa più probabile [56, 57].

Una classe particolare di molecole organiche che danno fenomeni di AIE sono i rotori molecolari fluorescenti; questa classe di composti è caratterizzata dalla presenza di due gruppi: uno elettron attrattore e uno elettron donatore separati da uno spaziatore coniugato, e quindi planare, che consente una migliore circolazione degli elettroni della molecola. In questa configurazione la molecola risponde alla fotoeccitazione con un trasferimento di carica intramolecolare (Intramolecular Charge Transfer, ICT) dal gruppo donatore all’accettore. In particolare, in seguito alla fotoeccitazione la molecola assume una conformazione distorta (Twisted Intramolecular Charge Transfer, TICT) per effetto delle forze elettrostatiche date dalla separazione di carica. [58-60]

L’ipotesi dell’esistenza di un “trasferimento di carica intramolecolare ruotato” fu proposta da Grabowski basandosi sugli studi relativi all’anomala fluorescenza in soluzione del 4,4’-dimetilamminobenzonitrile (DMABN) (Figura 1.28), disciolto in solventi polari.

-30-

Figura 1.28: Eccitazione e successiva formazione dello stato TICT nella molecola DMABN

Una classe di rotori molto studiata, e tra le più promettenti per l’applicazione nella sensoristica, è quella dei derivati della julolidina, e in particolare il rotore 9-(2,2- dicianovinil)julolidina (DCVJ), che ha riscosso ampio successo in campo biologico e biomedico. [61, 62]

La formazione del TICT avviene per trasferimento fotoindotto di un elettrone dall’azoto della julolidina ad uno dei due gruppi nitrili provocando una rotazione di quest’ultimi rispetto al piano della julolidina. [63]

L’energia dello stato eccitato di singoletto della molecola nella conformazione ruotata risulta essere minore rispetto a quello della molecola planare, mentre quest’ultima presenta uno stato fondamentale energicamente più basso rispetto alla conformazione ruotata.

.

-31-

Come si osserva dal diagramma di Jablonski (Figura 1.29), DCVJ ha una sola banda di emissione di fluorescenza e può assumere uno stato TICT in cui la transizione da S1 a S0 ha un salto energetico sufficientemente basso da consentire un rilassamento non radiativo. Da studi computazionali è stato dimostrato come il raggiungimento dello stato TICT viene raggiunto tramite una rotazione intramolecolare attorno al doppio legame vinilico.[64] Questo chiaramente sarebbe impedito allo stato fondamentale, ma al contrario risulta molto favorito energicamente allo stato eccitato rispetto al legame singolo C-C. Allo stato eccitato infatti il doppio legame vinilico a causa delle strutture di risonanza dovute al trasferimento di carica intramolecolari assume il carattere di un legame singolo permettendo la rotazione (Figura 1.30). [65]

Figura 1-30: Grafici dell’andamento dell’energia potenziale della DCVJ in funzione dell’angolo di torsione rispetto al doppio legame (grafico sopra, immagine a sinistra) e singolo (grafico sotto, immagine a destra) per lo stato

fondamentale (▲) ed eccitato (●)[64]

La formazione dello stato ruotato TICT è fortemente influenzata da tutta una serie di parametri relativi al mezzo in cui è disciolta/dispersa la molecola rotore. L’ingombro sterico della molecola stessa può ridurre il grado di formazione dello stato TICT, dal momento che può essere ostacolato il movimento di distorsione tra i due gruppi carichi e pertanto il fenomeno risulta meno probabile allo stato solido. Un altro parametro è

-32-

legato alla natura del solvente, in particolare alla sua costante dielettrica, poiché in solventi molto polari si possono avere interazioni tra i dipoli delle molecole di solvente che possono favorire o meno la conformazione distorta e quindi la formazione dello stato TICT. La barriera energetica tra la forma planare e ruotata può essere inoltre impedita anche con l’utilizzo di solventi a viscosità crescente e con la variazione della temperatura. [66].

Come conseguenza della forte influenza del mezzo circostante sull’emissione di fluorescenza, le molecole fluorescenti sono attualmente usate come sonde per analisi in sistemi biochimici e biologici. Le sonde fluorescenti si prestano per essere impiegate in svariati settori di ricerca fornendo informazioni sull’intorno chimico senza alterare l’ambiente circostante. Questi indicatori fluorescenti possono essere divisi in tre classi:

 Sonde intrinseche: sono il tipo di indicatore ideale, si hanno quando la molecola fluorescente è presente nel sistema che si intende rilevare (es. il triptofano nelle proteine);

 Sonde legate covalentemente: si realizzano legando l’indicatore fluorescente ad una molecola che va ad interagire col target dell’analisi;

 Sonde estrinseche: il sito di solubilizzazione di questa classe di sonde dipende dalla natura chimica della molecola che va a stabilire interazioni particolari col sistema da analizzare.

Pertanto la scelta di un indicatore fluorescente deve essere fatta in relazione alle proprietà dell’ambiente che si vuole rilevare, tenendo conto che le uniche interazioni che devono influenzare l’intensità di fluorescenza sono quelle tra la molecola e il sistema da misurare. Le tecniche analitiche basate sulla fluorescenza sono sempre più diffuse per la loro alta sensibilità e selettività e per la possibilità di avere una misura in tempo reale utilizzando rilevatori a fibre ottiche. [54, 66]

-33-

2 Scopo della tesi

Il presente lavoro di tesi si propone di sintetizzare e studiare, in soluzione e in massa, nuovi copolimeri anfifilici in grado di nanostrutturarsi mediante processi di organizzazione spontanea promossa dal ripiegamento della singola catena macromolecolare.

L’auto-assemblaggio delle macromolecole biologiche, quali proteine, enzimi, acidi nucleici, è un meccanismo altamente specializzato per produrre strutture funzionali complesse su scala molecolare e nanometrica. Ad esempio, nel sofisticato processo del ripiegamento proteico, una determinata sequenza amminoacidica lineare induce una precisa struttura tridimensionale, responsabile delle specifiche caratteristiche, e quindi delle funzioni, dell’oggetto unimolecolare. Tra i polimeri di sintesi, è noto il comportamento dei copolimeri a blocchi, in cui l’organizzazione spontanea in morfologie ben definite può essere predetta e finemente modulata in funzione dei parametri molecolari. Ciò è oggi possibile grazie alla relativa facilità di disegnare e realizzare materiali caratterizzati da natura chimica eterogenea, pesi molecolari poco dispersi e lunghezza dei blocchi controllata. [67]

Più recentemente, oltre ai fenomeni di aggregazione intermolecolare, è sorto un notevole interesse riguardo alla possibilità di produrre nanomateriali attraverso il ripiegamento di singole catene polimeriche (single-chain folding, SCF), in virtù dell’introduzione nella struttura chimica di interazioni intramolecolari di varia natura, quali legami a idrogeno, impacchettamento π-π, coordinazione metallo-legante, riconoscimento molecolare e effetti idrofobi. [68] Secondo queste strategie, attraverso l’instaurarsi di interazioni intramolecolari selettive le singole macromolecole collassano da uno stato di gomitolo statistico amorfo in entità globulari più ordinate e compatte, denominate micelle unimere. [69] L’auto-assemblaggio in nanostrutture mediante il ripiegamento della singola catena macromolecolare, stabilizzato da interazioni idrofobe, può avvenire efficacemente anche in copolimeri anfifilici statistici in cui le diverse counità con le contrapposte tendenze idrofobe e idrofile sono distribuite casualmente lungo lo scheletro polimerico principale. [70]

-34-

Il delicato bilancio delle caratteristiche di filia/fobia necessario per la formazione di micelle unimere tramite SCF può essere modulato tramite l’ingegnerizzazione chimica macromolecolare di copolimeri anfifilici grazie alle tecniche di polimerizzazione controllata/vivente. I copolimeri anfifilici, a blocchi e statistici, rappresentano piattaforme sintetiche molto versatili per una grande varietà di applicazioni, soprattutto negli ambienti in cui le superfici, e le interfacce, dei materiali polimerici vadano soggette all’attacco di molecole, proteine, cellule o organismi.[71] La (nano)organizzazione spontanea dei componenti idrofili e idrofobi dei copolimeri in diverse strutture, morfologie e topologie produce come risultato globale un insieme di caratteristiche ‘ambigue’ che interferiscono con i meccanismi di esplorazione e riconoscimento degli agenti (bio)vegetativi, impedendo o limitando fortemente la loro adesione al polimero. [41] L’impiego di polimeri anfifilici viene considerato oggi uno dei mezzi più efficaci e promettenti per applicazioni anti-(bio)vegetative in ambiente marino.

Secondo queste linee di interesse, con implicazioni significative di carattere fondamentale e potenziale applicativo, si prevede che i nuovi copolimeri anfifilici di questo lavoro, a causa dell’incompatibilità chimica tra i componenti idrofili (ossietilenici PEGMA) e i componenti idrofobi (fluoroalchilici AF e MAF), possano andare soggetti a forti effetti di segregazione intramolecolare che diano luogo a micelle unimere mediante ripiegamento della singola catena anfifilica in soluzione diluita.

Figura 2.1: Struttura dei monomeri poli(etilenglicole) metil etere metacrilato (PEGMA), 1H,1H,2H,2H- perfluoroottil acrilato (AF) e 1H,1H,2H,2H-perfluoroottil metacrilato (MAF)

Per questi copolimeri si può inoltre ipotizzare che la formazione di micelle unimere, caratterizzate da una morfologia collassata in compartimenti a diversa filia/fobia, determini la formazione spontanea di strutture ordinate su scala nanoscopica e

-35-

microscopica, degne di indagini più approfondite (diffusione dinamica della luce, assorbimento/emissione di fluorescenza, termoresponsività) in vista dell’obiettivo ultimo di produrre biomateriali funzionali innovativi, non tossici e biocompatibili, in grado di controllare l’adesione/distacco degli orgnanismi e microorganismi in ecobiologia marina e per l’industria navale nella lotta contro gli agenti biovegetativi (biofouling).

-36-

3 Risultati e discussione

In questo lavoro di tesi sono stati progettati e sintetizzati nuovi copolimeri statistici e a blocchi, caratterizzati da una natura anfifilica, con lo scopo di studiare alcune delle loro proprietà in soluzione e in superficie. In questo capitolo è stata descritta la preparazione dei copolimeri anfifilici a partire da monomeri e intermedi per la maggior parte disponibili in commercio e, successivamente la loro caratterizzazione molecolare. Per poter studiare i fenomeni di auto-assemblaggio in soluzione attraverso analisi di spettroscopia di fluorescenza, è stata anche legata covalentemente una sonda fluorescente a un copolimero statistico anfifilico.