RISULTATI E DISCUSSIONE
1.4 L’attivazione dei recettori AMPA provoca il rilascio vescicolare di glutammato dai processi astrocitari del cervelletto
L’inibizione dei trasportatori VGLUT per mezzo del modulatore allosterico Rose Bengal (Ogita et al., 2001) o dell’antagonista competitivo Trypan Blue (Roseth et al., 1998), oppure l’inibizione dell’H+-ATPasi vacuolare di tipo V (V-ATPasi) mediante la bafilomicina A1 (Bowman et al., 1988), prevengono il rilascio di glutammato endogeno o di trizio evocato da AMPA (Fig. 8A e B). Una pre- incubazione con Rose Bengal, Trypan Blue o bafilomicina A1 alle concentrazioni usate non ha alcun effetto sul rilascio di glutammato endogeno o trizio (dati non mostrati).
Fig.8 L’attivazione dei recettori AMPA provoca il rilascio vescicolare di glutammato dai processi astrocitari cerebellari di ratto. Effetto di Rose Bengal e Trypan Blue,
bloccanti dei trasportatori VGLUT, e della bafilomicina A1, bloccante della V-ATPasi, sul rilascio di trizio o glutammato endogeno evocato da AMPA. Le barre dei grafici rappresentano la variazione % del trizio (A) o del glutammato endogeno (B); Rose Bengal, Trypan Blue o bafilomicina A1 sono stati pre-incubati alle concentrazioni indicate per 30 minuti. I dati riportati derivano dalla media ± SEM di 3-14 esperimenti diversi eseguiti in triplicato. *p < 0.05 quando confrontato con il controllo AMPA (preincubazione in medium
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L’espressione di VGLU1 e VGLUT2 sui processi astrocitari BLBP-positivi è stata confermata mediante analisi di immunofluorescenza (Fig.9). Nello specifico, è stato stimato che circa l’80% dei processi della glia di Bergmann (BLBP-positivi) esprime VGLUT1 e che circa il 50% esprime VGLUT2 (Fig. 9E-H). Le analisi di co- espressione di VGLUT1 e VGLUT2 indicano che VGLUT2 si trova sempre sui processi BLBP-positivi che esprimono VGLUT1, mentre circa il 25% dei processi BLBP-positivi esprimono solo VGLUT1 (Fig. 9I-M). Singoli processi della glia di Bergmann che esprimono entrambi i trasportatori o solo VGLUT1 sono mostrati ad alto ingrandimento dalla Fig. 9N alla Fig. 9U. Analisi di Western Blot hanno confermato la presenza di entrambi i trasportatori nei processi astrocitari (Fig. 9V).
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Fig.9 Presenza dei trasportatori VGLUT nei processi della glia di Bergmann di ratto.
Immunofluorescenza per BLBP (A, E) e per VGLUT1 (B) e VGLUT2 (F) e la sovrapposizione d’immagini mostra co-espressione dei marcatori (C, G). Co-localizzazione di VGLUT1 e VGLUT2 con BLBP (D, H): le barre indicano la % (± SEM di 9-12 campi di tre differenti preparazioni) di processi BLBP-positivi dotati di VGLUT1 o VGLUT2 (D, H). Co-localizzazione di VGLUT1 e VGLUT2 con BLBP a livello dei processi astrocitari (I-U): le immagini rappresentano la marcatura con anticorpi anti-VGLUT1 (K, P, T), anti- VGLUT2 (J, O, S) e anti-BLBP (I, N, R); sovrapposizione delle immagini (L, Q, U). Rappresentazione grafica della co-localizzazione dei trasportatori VGLUT con i processi BLBP-positivi di cervelletto di ratto (M). In evidenza un singolo processo astrocitario che esprime sia VGLUT1 che VGLUT2 (Q) e un processo astrocitario che esprime solo VGLUT1 (U). Western Blot per VGLUT1 e VGLUT2 sulla preparazione di gliosomi cerebellari (V).
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Attraverso l’impiego della microscopia elettronica è stato possibile rilevare la presenza di vescicole all’interno dei processi della glia di Bergmann: nella figura 10 sono riportati singoli processi equipaggiati con piccole vescicole lisce e con alcune vescicole rivestite da clatrina, aventi un diametro approssimativamente di 30 nm e con una distribuzione casuale all’interno del citoplasma.
Questi risultati mostrano come i processi della glia di Bergmann siano dotati di vescicole per l’immagazzinamento di glutammato, e come i recettori AMPA Ca2+
- permeabili possano attivare il rilascio vescicolare del suddetto gliotrasmettitore.
Fig.10 Microscopia elettronica su gliosomi cerebellari. I gliosomi purificati sono stati
fissati, disidratati e inclusi in LX112. Le sezioni ultrasottili sono state fissate con acetato di uranile e citrato di piombo, e analizzate con microscopio elettronico FEI CM10 o Tecnai 12 G2. Vengono mostrati singoli gliosomi che contengono vescicole lisce e vescicole rivestite da clatrina (evidenziate dalle frecce) con dimensioni che si aggirano approssimativamente intorno ai 30 nm e distribuite in maniera casuale nel citoplasma. Inserto: il riquadro in alto nelle immagini è una riproduzione ad alto ingrandimento che mostra le vescicole lisce e quelle rivestite da clatrina. Scala della barra 0.205µm.
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1.5
Discussione
Questo studio fornisce la prima prova diretta che i processi della glia di Bergmann possiedono meccanismi molecolari per l’esocitosi del gliotrasmettitore glutammato, e che l’entrata di Ca2+
attraverso i recettori AMPA Ca2+-permeabili è accoppiata con il rilascio vescicolare di glutammato.
I risultati sono stati ottenuti impiegando come modello sperimentale i processi astrocitari preparati in acuto da cervelletto di ratto adulto e derivanti soprattutto da cellule della glia di Bergmann, rispecchiando quindi le caratteristiche delle cellule gliali maturate in situ. Infatti, le analisi di immunofluorescenza indicano che la preparazione di gliosomi risulta immunoreattiva per GFAP, confermando la loro origine astrocitaria, mentre mostra una contaminazione trascurabile da parte di terminali nervosi, microglia o oligodendrociti. La glia di Bergmann rappresenta una famiglia di cellule astrocitarie che oltre ad esprimere il marker specifico degli astrociti, GFAP (Roots, 1981), esprimono anche BLBP sia durante lo sviluppo che quando i processi hanno abbracciato le sinapsi (Yamada et al., 2000; Sottile et al., 2006; Koirala e Corfas, 2010). L’analisi dell’espressione di BLBP nei processi GFAP-positivi indica che i processi della glia di Bergmann rappresentano più dell’80% dei processi astrocitari isolati da cervelletto di ratto. Questa preparazione è stata dunque utilizzata per indagare sul rilascio di gliotrasmettitori e sui segnali Ca2+ della glia di Bergmann, con un’attenzione particolare al ruolo dei recettori AMPA. I principali dati che abbiamo ottenuto sono i seguenti:
I processi astrocitari possiedono recettori AMPA Ca2+- permeabili: infatti il rilascio di glutammato evocato da AMPA viene perso in assenza di Ca2+ extracellulare. Una prova diretta che il rilascio di gliorasmettitore è dovuto all’attivazione specifica dei recettori AMPA Ca2+
- permeabili a livello dei processi astrocitari è stata fornita dall’utilizzo di NASPM, un inibitore selettivo dei recettori AMPA privi della subunità GluA2 (Tsubokawa et al., 1995; Koike et al., 1997; Nilsen e England, 2007). In sua presenza si ha un’inibizione del rilascio di glutammato evocato da AMPA. Dalla letteratura è noto che i recettori AMPA Ca2+- permeabili privi della subunità GluA2 sono espressi quasi esclusivamente dalle cellule della glia di Bergmann (Burnashev et al., 1992; Muller et al., 1992).
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I risultati fin qui ottenuti mostrano quindi la presenza di questi recettori funzionali localizzati a livello dei processi astrocitari preparati da cervelletto di ratto adulto, e confermano che i gliosomi costituiscono un preparazione vitale.
E’ stato anche analizzato il rilascio di glutammato evocato da AMPA da parte dei terminali nervosi (sinaptosomi): questi sono risultati sensibili a CNQX o GYKI 52466 (Cervetto et al., 2010) e insensibili a NASPM, fornendo una prova ulteriore che la risposta NASPM-sensibile ad AMPA da parte dei gliosomi è dovuta all’attivazione dei recettori AMPA specifici espressi a livello della glia di Bergmann. Questi recettori sono attivati dal glutammato ectopico liberato al di fuori della fessura sinaptica dalle fibre parallele e rampicanti (Balakrishnan et al., 2014; Matsui e Jahr, 2003, 2004; Matsui et al., 2005), che può diffondere fino ai recettori AMPA della glia di Bergmann attraverso la volume transmission (Agnati et al., 1992, 1995, 2014). L’attivazione dei recettori potrebbe risultare importante per la modulazione della trasmissione sinaptica e per la plasticità sinaptica (Matsui e Jahr, 2003; Bellamy e Ogden, 2005; Piet e Jahr, 2007). In particolare, questi recettori sembrano avere il ruolo di sensori dell’attività neuronale e, essendo localizzati a livello dei processi astrocitari della glia di Bergmann, controllano la copertura delle sinapsi, e di conseguenza la clearance del glutammato che viene allontanato dalle sinapsi attraverso i trasportatori presenti sulle membrane dei processi astrocitari stessi (Saab et al., 2012; Buffo e Rossi, 2013). In questo studio viene proposto che i recettori AMPA della glia di Bergmann, oltre a comunicare con le sinapsi e a favorire la trasmissione sinaptica “privata” mantenendo la copertura delle sinapsi grazie ai processi astrocitari, possano costituire un nuovo bersaglio per modulare i meccanismi della trasmissione glutammatergica a livello delle sinapsi. Infatti i risultati ottenuti mostrano che i recettori AMPA sono accoppiati a segnali Ca2+ e al rilascio del gliotrasmettitore glutammato dai processi stessi; questo potrebbe rappresentare un ulteriore meccanismo attivo di modulazione dell’attività e della plasticità sinaptica da parte della glia di Bergmann. Studi precedenti avevano già ipotizzato che la glia di Bergmann potesse modulare attivamente l’attività neuronale e modificare l’eccitazione delle cellule del Purkinje mediante il rilascio di glutammato (Sasaki et al., 2012). Questo gliotrasmettitore potrebbe andare ad agire sia a livello presinaptico che postsinaptico attraverso l’attivazione di altri recettori per il glutammato.
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Il rilascio di glutammato in seguito a fotostimolazione delle cellule della glia di Bergmann induce l’attivazione dei recettori AMPA delle cellule del Purkinje e una depressione a lungo termine (LTD) delle fibre parallele sulle sinapsi delle cellule del Purkinje attraverso l’attivazione dei recettori metabotropici del glutammato (sasaki et al., 2012). I terminali nervosi delle fibre parallele sono anche dotati dei recettori ionotropici kainato o AMPA Ca2+- impermeabili (Cervetto et al., 2010; vedere anche i risultati qui riportati), che potrebbero anch’essi essere attivati dal glutammato rilasciato dai processi della glia di Bergmann. Inoltre è importante sottolineare che le fibre rampicanti comunicano con gli interneuroni, cruciali per il circuito delle funzioni cerebellari, attraverso la volume transmission (Szapiro e Barbour, 2007); i recettori AMPA della glia di Bergmann attivati dalle fibre rampicanti per mezzo della volume transmission, e il conseguente rilascio di glutammato, potrebbero essere coinvolti nella volume transmission verso gli interneuroni (Nishiyama e Linden, 2007).
Un importante aspetto emerso da questo studio è che il Ca2+ che entra attraverso i recettori AMPA provoca il rilascio vescicolare di glutammato dai processi della glia di Bergmann. Ormai è noto da tempo che gli astrociti possiedono la machinery per il rilascio esocitotico di gliotrasmettitori nonché i trasportatori vescicolari per il glutammato (VGLUT), che sfruttano il gradiente protonico generato dalla pompa V-ATPasi per immagazzinare il glutammato all’interno di vescicole. Il blocco dei trasportatori VGLUT con Rose Bengal o della V-ATPasi con bafilomicina A1 hanno come conseguenza una riduzione del rilascio di glutammato dagli astrociti in seguito a stimoli di varia natura (Araque et al., 2000; Pasti et al., 2001; Montana et al., 2004; Crippa et al., 2006; Montana et al., 2006). Mentre numerosi studi sono stati eseguiti su colture di astrociti, esistono anche alcune prove in situ della presenza dei trasportatori VGLUT negli astrociti a livello dell’ippocampo, della corteccia frontale, del cervelletto o dello striato di roditori (Bezzi et al., 2004; Zhang et al., 2004; Ormel et al., 2012a,b), suggerendo che gli astrociti in diverse regioni cerebrali sono competenti per il rilascio vescicolare di glutammato. Le analisi ultrastrutturali hanno evidenziato all’interno dei processi astrocitari cerebellari la presenza di numerose piccole vescicole (rivestite o meno di clatrina) distribuite casualmente nel citoplasma, aventi un diametro di ~30 nm.
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Questi risultati sono in accordo con le caratteristiche morfologiche delle vescicole competenti per la fusione con la membrana dei gliosomi ottenuti dalla corteccia cerebrale di ratto (Stigliani et al., 2006), e differiscono invece dalla distribuzione polarizzata delle vescicole nei terminali nervosi di corteccia preparati in parallelo (Stigliani et al., 2006) o come evidenziato dall’ultrastruttura dei terminali delle fibre parallele o rampicanti (Ango et al., 2008; Ormel et al., 2012b). Attraverso analisi di immunofluorescenza è stato possibile appurare che i processi maturi BLBP-positivi della glia di Bergmann preparati da cervelletto di ratto adulto esprimono VGLUT1 e VGLUT2, ad indicare che possiedono vescicole glutammatergiche. Inoltre i dati qui riportati forniscono la prova che i trasportatori VGLUT dei processi della glia di Bergmann sono funzionali, e che il rilascio di glutammato evocato da AMPA viene abolito in presenza di bloccanti dei trasportatori o di inibitori della V-ATPasi.
Riassumendo, attraverso questo studio è stato possibile mettere in luce nuovi ruoli della glia di Bergmann rispetto a quelli finora conosciuti; in particolare, è possibile riportare le seguenti novità:
- Si possono ottenere processi funzionali della glia di Bergmann da cervelletto di ratto adulto, permettendo un’indagine funzionale di questi processi astrocitari;
- La glia di Bergmann possiede meccanismi vescicolari per il rilascio di glutammato;
- L’attivazione dei recettori AMPA Ca2+- permeabili provoca l’entrata di Ca2+ e il conseguente rilascio esocitotico di glutammato dalle cellule gliali di Bergmann.
In linea con questi risultati, è riportato in letteratura che le cellule gliali di Bergmann isolate in acuto da topo adulto esprimono componenti del complesso macromolecolare coinvolto nel rilascio vescicolare esocitotico regolato, tra cui sinapsina I, sinaptotagmina XI e XVI, sintaxina, sinapsina, rim2 e Lgi3 (una proteina che interagisce con la sintaxina e un potenziale regolatore dell’esocitosi), supportando l’ipotesi che le cellule della glia di Bergmann in vivo possiedono la machinery per il rilascio regolato di gliotrasmettitori (Koirala e Corfas, 2010).
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I dati e le figure riportati sono stati oggetto della seguente pubblicazione:
Cervetto C, Frattaroli D, Venturini A, Passalacqua M, Nobile M, Alloisio S, Tacchetti C, Maura G, Agnati LF, Marcoli M. (2015). Calcium-permeable AMPA receptors trigger vesicular glutamate release from Bergmann gliosomes. Neuropharmacology 99: 396-407.
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