Recettori AMPA Ca 2+ permeabili sono localizzati sui processi astrocitari del cervelletto

Il rilascio di trizio o di glutammato endogeno in risposta ad AMPA viene pressoché abolito in assenza di Ca2+ extracellulare (Fig.5A e B). L’effetto di AMPA non subisce invece variazioni in presenza di DL-TBOA, un bloccante non trasportabile dei trasportatori di membrana per il glutammato (aumento % del rilascio di trizio: AMPA 50 µM, 94.8 ± 3.9; AMPA 50 µM + DL-TBOA 10 µM, 91.2 ± 5.6; n = 3), escludendo la possibilità che l’entrata di Na+ attraverso i recettori AMPA possa indurre un trasporto inverso di glutammato.

Il composto NASPM, N-Acetilspermina, un antagonista selettivo dei recettori AMPA Ca2+- permeabili privi della subunità GluA2 (Tsubokawa et al., 1995; Koike et al., 1997; Nilsen e England, 2007), è in grado di abolire il rilascio di trizio o glutammato endogeno evocati da AMPA (valore IC50 = 0.11 µM e 0.09 µM contro il

rilascio di trizio e glutammato endogeno, rispettivamente; Fig.5 C-F). Il NAPSM è risultato efficace anche quando la desensibilizzazione dei recettori AMPA viene bloccata dalla ciclotiazide, o contro la risposta all’agonista (S)-CPW 399 non desensibilizzante (Fig.5C e D). L’aggiunta di ciclotiazide, concanavalina A o degli antagonisti dei recettori ionotropici del glutammato alla concentrazioni usate, non influenzano il rilascio di trizio o di glutammato endogeno (dati non mostrati).

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Fig.5 I recettori AMPA Ca2+-permeabili sono responsabili del rilascio di glutammato dai processi astrocitari di cervelletto di ratto evocato da AMPA. (A, B) Il rilascio di

glutammato evocato da AMPA è dipendente dal Ca2+: sono mostrati gli effetti della mancanza di Ca2+ extracellulare sul rilascio di trizio (A) o di glutammato endogeno (B) evocato da AMPA. (C, D) Efficacia di NASPM sul rilascio di trizio (C) o di glutammato endogeno (D) evocato da AMPA, (S)-CPW 399 o AMPA con ciclotiazide. Relazione concentrazione-risposta del NASPM nell’inibire il rilascio di trizio (E) o di glutammato endogeno (F) evocato da AMPA (100 µM; ■). Le barre rappresentano la variazione % del rilascio di trizio o glutammato endogeno in presenza delle sostanze alle concentrazioni indicate. Il medium senza Ca2+ addizionato con EGTA (0.5 mM) è stato aggiunto 18 minuti prima dell’agonista. I dati riportati sono la media ± SEM di 3-14 diversi esperimenti eseguiti in triplicato. *p < 0.05 confrontato con l’effetto dell’agonista da solo in un medium standard; #p < 0.05 confrontato con l’effetto di AMPA + ciclotiazide.

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Una serie di esperimenti è stata condotta sui sinaptosomi purificati ottenuti in parallelo: le analisi di immufluorescenza mostrano che i terminali nervosi ottenuti dal cervelletto sono pressoché privi di contaminazione da parte della componente astrocitaria o di altre particelle di origine non-neuronale (Fig.6 A-I). La liberazione basale media di trizio nelle prime due frazioni raccolte durante la superfusione ammonta a 1.02 ± 0.23%/min (n = 3). AMPA (50 µM) provoca il rilascio di trizio, effetto che è prevenuto da CNQX (10 µM) o GYKI 52466 (30 µM), mentre non viene influenzato da NASPM (Fig.6J). Questi dati escludono la possibilità che la risposta NASPM-sensibile dei recettori AMPA dei processi della glia di Bergmann possa essere causata da una contaminazione neuronale della preparazione di gliosomi.

Fig.6 Terminali nervosi da cervelletto di ratto: contaminazione trascurabile da parte di processi astrocitari, microglia o oligodendrociti, e risposta ad AMPA.

Immunofluorescenza per il marker neuronale MAP2 (A, D, G), il marker astrocitario GFAP (B), il marker degli oligodendrociti RIP (E) e il marker della microglia integrina-αM (H): le immagini mostrano una contaminazione trascurabile dei terminali nervosi purificati da parte delle frazioni non neuronali. I grafici indicano la % di particelle positive (% ± SEM di 5 campi non sovrapposti ottenuti da tre differenti preparazioni): MAP2 (C, F, I; barra piena) e GFAP, RIP o integrina-αM (C, F, I; barra vuota), rispettivamente. (J) Inefficacia di NASPM e efficacia di CNQX e GYKI 52466 sul rilascio di trizio evocato da AMPA. Le barre rappresentano la variazione % di trizio in presenza delle diverse sostanze alle concentrazioni indicate. I dati riportati derivano dalla media ± SEM di tre diversi esperimenti eseguiti in triplicato. *p < 0.05 rapportato con l’effetto di AMPA.

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Processi astrocitari isolati e delle micro-aree contenenti ~15-30 gliosomi sono sono stati analizzati mediante tecniche di imaging del calcio. Quando i gliosomi vengono stimolati con AMPA (50 µM) si osservava un aumento nella concentrazione di Ca2+ intragliosomiale, espressa come rapporto F340/F380.

Le figure 7B e 7C mostrano una tipica risposta dell’aumento del Ca2+ intracellulare evocata da AMPA ottenuto da un singolo processo astrocitario e da una micro-area durante perfusione con AMPA (50 µM) e successivamente con una soluzione 35 mM di K+; la variazione nella concentrazione di Ca2+ intracellulare in risposta alla depolarizzazione (35 mM K+) applicata alla fine di ogni esperimento conferma l’integrità della preparazione di gliosomi. E’ da riportare una risposta del Ca2+ ad alte concentrazioni di K+ da parte delle cellule della glia di Bergmann in situ (Shao e McCarthy, 1997). Inoltre, questi risultati confermano dati precedenti che mostrano come i processi astrocitari isolati in acuto da cellule della glia mature siano capaci di rispondere alla depolarizzazione (Paluzzi et al., 2007; Yaguchi e Nishizaki, 2010; Heinrich et al., 2012). Questa caratteristica è condivisa anche dalle colture di astrociti adulti, mentre le colture di astrociti ottenuti da roditori neonati non sono in grado di rispondere alla depolarizzazione (Paluzzi et al., 2007). I segnali Ca2+ indotti da AMPA venivano inibiti da NASPM (10 µM; Fig.7D).

Considerando tutti i risultati qui riportati, è possibile affermare che i recettori AMPA localizzati sulla membrana esterna dei processi astrocitari recuperati da cervelletto di ratto adulto sono Ca2+-permeabili (e privi della subunità GluA2).

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Fig7. Misura del calcio intracellulare in singoli gliosomi e in micro-aree di gliosomi. Le

immagini a fluorescenza mostrano i gliosomi caricati con fura-2AM; le regioni di interesse (ROI) sono evidenziate dai riquadri numerati (A). Una tipica risposta del Ca2+ a AMPA 50 µM e a K+ 35mM in un singolo gliosoma (B) e in una micro-area (C). Le lineette nere indicano il periodo di contatto della preparazione con le diverse sostanze le sostanze. (D) I segnali Ca2+ indotti da AMPA sono inibiti da NASPM 10 µM. I valori dell’aumento della concentrazione del Ca2+ intracellulare sono espressi come rapporto F340/F380. I dati riportati derivano dalla media ± SEM di 25 misurazioni in micro-aree di tre diversi esperimenti; *p < 0.05 rispetto a AMPA da solo in un medium standard.

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1.4 L’attivazione dei recettori AMPA provoca il rilascio vescicolare di