Fosforilazione della subunità GluA1 dei recettori AMPA nei gliosomi cerebrocorticali di topi Dach-SMO

Attraverso analisi di Western Blot è stato quantificato il livello della subunità GluA1 e della subunità GluA1 fosforilata sulla Serina in posizione 831 (p-Ser831) dei recettori AMPA presenti a livello dei gliosomi preparati dalla corteccia sia di topi Dach-SMO sia di topi controllo. Nei gliosomi ottenuti di topi Dach-SMO rispetto ai controlli si è potuto osservare un aumento significativo sia della subunità GluA1 (+48.2%; p <0.03; n=3; Fig. 31) sia della p-Ser831-GluA1 (+35.5 %; p <0.04; n=3; Fig. 31).

Questi risultati indicano che l’overespressione di SMO nel cervello murino porta ad un aumento delle subunità GluA1 e GluA1 fosforilata dei recettori AMPA a livello dei gliosomi di topi Dach-SMO.

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4.7

Discussione

Per quanto concerne i meccanismi che sostengono l’aumentata vulnerabilità all’eccitotossicità indotta dalla somministrazione sistemica di KA, sono state evidenziate a livello della corteccia cerebrale dei topi Dach-SMO, sia precedentemente (Cervelli et al., 2013a) sia in questo studio, le seguenti caratteristiche:

- astrogliosi reattiva e perdita di neuroni, come dimostrato dalla sovraespressione di GFAP e dalla riduzione di immunoreattività verso sinaptofisina e NeuN a livello di processi astrocitari, terminazioni nervose e sezioni cerebrali;

- stimolazione di sistemi antiossidanti sia nei neuroni che negli astrociti, come conseguenza dello stress ossidativo;

- aumentata suscettibilità a crisi epilettiche indotte dal KA, dipendenti dall’attività degli astrociti.

4.7.1 Astrogliosi reattiva nei topi Dach-SMO

L’astrogliosi reattiva si verifica in risposta a danni o patologie del SNC.

Sebbene studi recenti abbiano rivolto l’attenzione verso un ruolo degli astrociti reattivi nel limitare l’infiammazione e di proteggere i neuroni dopo un danno cerebrale, sono state attribuite agli astrociti funzioni sia nocive sia benefiche (Sofroniew, 2005; Sofroniew e Vinters, 2010; Wang e Bordey, 2008). Infatti, gli astrociti potrebbero funzionare come punto di integrazione dei segnali, in grado di riconoscere e rispondere agli stimoli ambientali e di generare risposte neuromodulatorie (Parpura et al., 2010); nello specifico, il ruolo degli astrociti nella diffusione del danno eccitotossico da glutammato durante l’ischemia è legato sia alla limitazione dell’uptake che all’attivo rilascio di glutammato (Rossi et al., 2007). I presenti dati immunoistochimici sono coerenti con una reattiva astrogliosi a livello della corteccia cerebrale dei topi Dach-SMO (vedere anche Cervelli et al., 2013b) e sono in accordo con un aumento dei processi astrocitari che contengono GFAP e con una concomitante riduzione dei terminali nervosi contenenti sinaptofisina. Inoltre è stata riscontrata una perdita neuronale, coerente con un pronunciato danno cerebrale, e con il numero maggiore di neuroni che mostrano una condensazione citoplasmatica e basofilia nucleare nella corteccia di topi Dach-SMO, in risposta a un trattamento in

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vivo con KA (Cervelli et al., 2013b). Le caratteristiche morfologiche dei neuroni

(Cervelli et al., 2013b) richiamano uno stato degenerativo ancora poco compreso, riscontrato anche in modelli di differenti condizioni patologiche, come la malattia di Huntington o il morbo di Alzheimer (Iannicola et al., 2000; Mastroberardino et al., 2002; Yang et al., 2008). La perdita neuronale misurata riflette probabilmente l’evento di eccitotossicità cronica e il danno ossidativo che si verificano durante la vita dei topi che overesprimono SMO e potrebbe contribuire ad aumentare la vulnerabilità all’eccitotossicità. Infatti, lo stress ossidativo e lo squilibrio della trasmissione glutammatergica nel network neurone-astrocita potrebbe portare ad uno sbilanciamento tra le condizioni neuroprotettive e neuro-aggressive, riducendo le risorse difensive dei neuroni e contribuendo ad aumentare la vulnerabilità al danno eccito tossico.

4.7.2 Stimolazione dei sistemi antiossidanti nei topi Dach-SMO

Studi sempre più numerosi supportano l’ipotesi che lo stress ossidativo giochi un ruolo in diverse patologie neurologiche (Vergani et al., 2011; Popa-Wagner et al., 2013). I radicali liberi dell’ossigeno vengono costantemente prodotti a livello SNC sia in condizioni fisiologiche che patologiche. La maggior parte dei ROS sono costituiti dal radicale superossido e da H2O2, degradati dalla SOD e dalla catalasi,

rispettivamente. Nel presente lavoro, sia l’attività della SOD che della catalasi sono risultate stimolate nella corteccia dei topi Dach-SMO rispetto ai controlli. Questi risultati indicano chiaramente un aumento nella produzione di ROS come conseguenza di una overespressione di SMO nella corteccia cerebrale. La protezione dai ROS è anche garantita dalle MT, che agiscono come scavenger non enzimatici. Numerose prove indicano che nel SNC le MT sono up-regolate nei modelli animali di sclerosi multipla (Lanza et al.,2009), di SLA (Gong e Elliott, 2000; Uccelli et al., 2012) e di PD (Ebadi et al., 2005). Nel SNC sono presenti tre isoforme di MT che mostrano diversi pattern di espressione: MT-1 e MT-2 hanno un’azione neuroprotettiva contro i metalli pesanti e lo stress ossidativo (Hidalgo et al., 2001). Esse risultano ampiamente espresse dagli astrociti, ma sono quasi del tutto assenti in oligodendrociti e neuroni. MT-3 è abbondante invece nei neuroni e sembra avere un ruolo nell’omeostasi dello zinco, specialmente in specifiche regioni cerebrali come l’ippocampo (Aschner, 2006).

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Qui è stato mostrato che l’espressione sia delle isoforme non neuronali, MT-1 e MT- 2, che dell’isoforma neuronale MT-3 risulta marcatamente aumentata nella corteccia dei topi Dach-SMO rispetto ai controlli. La diretta relazione tra l’overespressione di SMO e l’aumento dei livelli di tutte le isoforme di MT potrebbe essere un tentativo di proteggere il cervello dallo sbilanciamento ossidativo causato dall’aumento dei livelli di H2O2 e di altre specie ossidanti. E’ degno di nota il fatto che MT-1/MT-2

agiscono come un unico sistema antiossidante che viene espresso in maniera coordinata. Le MT potrebbero inoltre agire come molecole antiinfiammatorie che riducono l’attivazione e il reclutamento cerebrale di monociti/macrofagi e cellule T, e contrastano l’attivazione della microglia (Penkowa, 2006); è interessante sottolineare che un aumento nel numero di cellule della microglia è stato riportato a livello della corteccia dei topi Dach-SMO (Cervelli et al., 2013b). Tutti insieme, i risultati presentati in questo lavoro confermano che uno sbilanciamento nel catabolismo delle PA nella corteccia cerebrale dei topi Dach-SMO si traduce in una condizione di stress ossidativo sia nei neuroni che negli astrociti. La generazione dei prodotti dell’ossidazione della Spm, quali H2O2 e 3-AP, che spontaneamente si

converte in acroleina, porta ad un aumento dello stress ossidativo che potrebbe contribuire alla vulnerabilità al KA. In linea con quanto riportato finora, evidenze sostanziali indicano che lo stress ossidativo generato durante eccito tossicità da KA può contribuire alla morte neuronale (Zhang e Zhu, 2011; Cervelli et al., 2013b).

Si potrebbe speculare che i topi adulti che overesprimono SMO si trovino in una condizione cronica per quanto concerne l’attivazione del metabolismo della Spm (e la conseguente produzione di H2O2 e stress ossidativo). Si potrebbe dedurre che in

questa condizione l’attivazione cronica dei meccanismi di difesa serva a mantenere l’equilibrio tra le molecole ossidanti e antiossidanti. Perciò, perfino un piccolo danno ossidativo potrebbe rivelarsi critico e il sistema antiossidante potrebbe essere sopraffatto, producendo uno shift verso le molecole ossidanti, che potrebbero portare ad un accumulo nel tempo di danni alla cellula (Birbe net al., 2012; Poljsak et al., 2013). Al contrario, durante un’acuta generazione dei prodotti dell’ossidazione della Spm, H2O2 e 3-AP, quale si verifica nel corso di un’ischemia cerebrale (o durante

trattamenti in vitro in acuto con H2O2 e 3-AP), l’ammontare degli agenti necessari

per causare citotossicità potrebbe essere più alto (Ivanova et al., 1998; Wood et al., 2006b).

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In realtà, l’attivazione cronica del metabolismo delle PA potrebbe essere più rappresentativo , rispetto a insulti ossidativi acuti, delle condizioni patologiche croniche che coinvolgono l’attivazione di meccanismi ossidativi.

4.3 I processi astrocitari esprimono recettori AMPA e rilasciano glutammato in