1. Studio dei recettori AMPA della glia di Bergmann sul rilascio vescicolare di glutammato
La glia di Bergmann rappresenta il principale tipo cellulare gliale della corteccia cerebellare, e gioca un ruolo attivo nel controllo della trasmissione glutammatergica sulle cellule del Purkinje. Si tratta di una popolazione di astrociti radiali con il corpo cellulare nello strato delle cellule del Purkinje e i processi astrocitari che si estendono radialmente nello strato molecolare. Circa l’87% delle sinapsi glutammatergiche delle fibre rampicanti e il 65% di quelle delle fibre parallele con le cellule del Purkinje sono circondate dai processi astrocitari della glia di Bergmann (Xu-Friedman et al., 2001). L’espressione di recettori AMPA permeabili al calcio, privi della subunità GluA2, è una caratteristica distintiva della glia di Bergmann (Burnashev et al., 1992; Muller et al., 1992). I recettori si trovano localizzati sia sul corpo cellulare che lungo i processi astrocitari che abbracciano le sinapsi glutammatergiche, in particolare sulla membrana plasmatica che fronteggia il terminale presinaptico delle fibre parallele (Matsui et al., 2005). I recettori AMPA possono essere attivati dal glutammato rilasciato dalle fibre parallele e rampicanti (Clark e Barbour, 1997; Bergles et al., 1997; Balakrishnan et al., 2014), ed evocano un segnale rilevabile e transiente di Ca2+ all’interno dei processi astrocitari (Grosche et al., 1999; Beierlein e Regehr, 2006; Piet e Jahr, 2007). L’attivazione di questi recettori e la conseguente segnalazione mediata dall’entrata di Ca2+
è essenziale per mantenere le connessioni strutturali e funzionali tra le cellule gliali e le sinapsi glutammatergiche (Iino et al., 2001; Piet e Jahr, 2007; Hoogland e Kuhn, 2010; Saab et al., 2012). Ciò nonostante, l’impatto della glia di Bergmann sulla funzione delle sinpasi non è stato ancora pienamente compreso. In particolare, mentre è risaputo che l'aumento dei livelli intracellulari di calcio è in grado di innescare il rilascio di gliotrasmettitori dai processi astrocitari, non esistono ad oggi evidenze che ciò accada anche nelle cellule della glia di Bergmann.
La prima parte di questa tesi si è focalizzata sullo studio dei meccanismi che possono mediare il rilascio di gliotrasmettitori a livello della glia di Bergmann in seguito a segnali transienti di Ca2+.
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2. Interazione tra i recettori A2A e D2 e modulazione dell’omocisteina sul rilascio di glutammato dai processi astrocitari di striato
Il ruolo degli astrociti e l’importanza della funzione del network neurone- astrocita nella vulnerabilità delle patologie neurodegenerative e neuropsichiatriche sono sempre più riconosciute (Di Benedetto e Rupprecht, 2013; Sofroniew, 2015; Verkhratsky e Parpura, 2016). In particolare, sono state pubblicate prove della presenza di astrociti reattivi e di uno stato di neuroinfiammazione a livello della corteccia prefrontale in pazienti affetti da schizofrenia (Catts et al., 2014); inoltre stanno emergendo dati riguardanti una disfunzione degli astrociti a livello delle sinapsi tripartite, così come un’alterata neurotrasmissione glutammatergica nella schizofrenia o nella malattia di Parkinson, a livello dello striato (Mitterauer, 2014; Xia et al., 2014; Bernstein et al., 2015).
Gli astrociti esprimono recettori e canali in grado di percepire l’ambiente extracellulare: l’espressione di GPCRs e di canali ionici ligando-dipendenti è stata ampiamente documentata (Porter e McCarthy, 1997; Perea et al., 2009; Nedergaard e Verkhratsky, 2012; Fuxe et al., 2015a,b). All’interno del network neurone-astrocita, i processi astrocitari funzionano come sensori dei trasmettitori liberati nell’ambiente extracellulare – attivati dai neurotrasmettitori e dai gliotrasmettitori mediante una comunicazione di tipo volume transmission (Agnati et al., 1986, 1995; Agnati e Fuxe, 2000; Vizi, 2000; Kiss e Vizi , 2001; Syková e Nicholson, 2008; Hirase et al., 2014; Fuxe et al., 2015a, b; Scholkman, 2015). I processi astrocitari modulano attivamente l’attività neuronale attraverso la clearance del glutammato, la regolazione del volume extracellulare e la copertura delle sinapsi (Xie et al., 2013; Marcoli et al., 2015), nonchè rilasciando gliotrasmettitori (Montana et al., 2006; Bergersen e Gundersen, 2009; Santello e Volterra, 2009; Parpura e Verkhratsky, 2012; Martín et al., 2015).
Esistono sempre più prove dell’espressione sia del recettore D2 per la dopamina (Bal et al., 1994; Miyazaki et al., 2004) che del recettore A2A per l’adenosina (Matos et al., 2013) da parte degli astrociti adulti dello striato. Dati in
vivo indicano che i recettori D2 astrocitari sono coinvolti in patologie associate a
neuroinfiammazione, andando a modulare la risposta immune e aumentando la resistenza dei neuroni dopaminergici della substantia nigra ai danni neurotossici
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(Shao et al., 2013), mentre i recettori A2A astrocitari sembrano coinvolti nella protezione dalla neurotossicità (Yu et al., 2008).
Dall’altro lato, i recettori A2A risultano up-regolati nella schizofrenia (Kurumaji e Toru, 1998; Boison et al., 2012) e una loro disfunzione, con alterazione dell’omeostasi del glutammato, è stata ipotizzata rilevante in questa patologia (Rial et al., 2014; Matos et al., 2015).
Sia i recettori A2A che i recettori D2, così come la formazione di eterodimeri A2A-D2 a livello dello striato, sono stati per lungo tempo oggetto di numerosi studi che hanno condotto a una nuova prospettiva del meccanismo molecolare coinvolto nella schizofrenia così come nella patofisiologia della malattia di Parkinson e nella discinesia indotta dai farmaci, fornendo nuovi bersagli per i farmaci antipsicotici o anti-parkinson (Soriano et al., 2009; Fuxe et al., 2014, 2015b; Guidolin et al., 2015). Nonostante una maggiore attenzione verso i recettori A2A e D2, e il cambiamento da una visione neurocentrica a una visione sostanzialmente astrocentrica delle funzioni neuronali e delle patologie neuropsichiatriche (Robertson, 2002; Pereira e Furlan, 2010; Parpura e Verkhratsky, 2012; Rial et al., 2014), la presenza di questi recettori e di possibili eterodimeri anche a livello delle cellule gliali nello striato ha ricevuto finora scarsa attenzione.
Viste le prove presenti in letteratura è possibile ipotizzare che i recettori A2A e D2, se espressi dagli astrociti striatali (in particolare sui processi astrocitari che rilasciano glutammato), possano influenzare il rilascio di glutammato e interferire l’uno con l’altro nel controllo del rilascio di questo gliotrasmettitore.
E’ stato inoltre dimostrato che sia i modulatori extracellulari che quelli citoplasmatici sono in grado di esercitare un controllo allosterico sui GPCRs (Kenakin e Miller, 2010). In particolare, diversi studi hanno riportato che l’omocisteina (Hcy) può modulare i recettori D2 agendo a livello intracellulare come un antagonista allosterico (Agnati et al., 2006b, 2008a). Hcy è un amminoacido contenente zolfo che viene prodotto durante il metabolismo della metionina, e un accumulo di Hcy è stato correlato con numerose disfunzioni neurologiche. E’ degno di nota che il farmaco anti-parkinson L-dopa va ad aumentare la sintesi cellulare di Hcy, portando ad una conseguente iperomocisteinemia nei ratti. L’effetto della L- dopa sull’omocisteina plasmatica viene accentuato in condizioni di un metabolismo compromesso di questo amminoacido, come per esempio nel caso di carenza da folati (Miller et al., 2003).
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Dunque i dati a favore di un ruolo dell’omocisteina come modulatore allosterico dei recettori D2 potrebbero avere non solo un’importanza a livello teorico ma anche un impatto sullo sviluppo di nuovi farmaci per il PD (Agnati et al., 2006b, 2008a,b; Agnati et al., 2010; Fuxe et al., 2010). In aggiunta è stato anche riportato che Hcy, mentre modula i processi di riconoscimento/decodificazione del recettore D2, non interferisce con l’interazione recettore-recettore A2A-D2 (Agnati et al., 2006b, 2008a,b; Agnati et al., 2010; Fuxe et al., 2010).
Nella seconda parte di questa tesi si è andati quindi a valutare la presenza dei recettori A2A e D2 e la loro co-espressione a livello dei processi astrocitari di striato; è stata rivolta particolare attenzione a una possibile interazione funzionale dei due recettori nel controllo della trasmissione glutammatergica, nonché alla possibilità che i due recettori possano formare un eterodimero A2A-D2.
Inoltre, allo scopo di fare chiarezza sulla presenza di meccanismi allosterici anche a livello degli astrociti, si sono andati a valutare gli effetti di una possibile interferenza dell’omocisteina nell’interazione A2A-D2 e quindi sul rilascio di glutammato dai processi astrocitari striatali.
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3. Rilascio di esosomi dai processi astrocitari
Esistono sempre più prove indicanti che le vescicole extracellulari (ECVs) posso comportarsi come carrier di segnali per la comunicazione intercellulare nel SNC (Cocucci et al., 2009; Agnati et al., 2010). Infatti, la comunicazione nel SNC attraverso ECVs è ormai per lo più accettata come una modalità di comunicazione non sinaptica, la cosiddetta roamer-type volume transmission, contribuendo perciò al ruolo dello spazio extracellulare nel diffondere e codificare i segnali nel cervello. E’ stato recentemente ipotizzato che gli esosomi, vescicole (30-100 nm di diametro) rilasciate nello spazio extracellulare subito dopo la fusione dei corpi multivescicolari con la membrana plasmatica (Thery et al., 2002), possano avere diversi ruoli fisiologici a livello del SNC (Bellingham et al., 2012). Inoltre, gli esosomi potrebbero contribuire alla patogenesi di diversi disturbi, per esempio veicolando peptidi associati alla neuro degenerazione come β-amiloide, APP e cistatina C nella malattia di Alzheimer (Rajendran et al., 2006; Ghidoni et al., 2011; Ghidoni et al., 2008), o trasferendo acidi nucleici come mtDNA, mRNA, miRNA (Guescini et al., 2010; Valadi et al., 2007) che possono essere coinvolti in patologie neurodegenerative (Junn e Mouradian, 2012). Nel SNC gli esosomi vengono liberati da diversi tipi cellulari: diversi studi hanno dimostrato che colture neuronali (Smalhei, 2007; Faure et al, 2006; Fevrier e Raposo, 2004; Simons e Raposo, 2009), o gliali, di microglia o astrociti (vedi Guescini et al, 2012; 2014) sono in grado di liberare esosomi. In aggiunta, sono state fornite prove sul fatto che gli esosomi sono in grado di modulare l’attività delle cellule che li ricevono, sia in vitro (Bhatnagar et al., 2007; Blanc et al, 2007; Griffiths et al., 2007; Guescini) che in vivo (Johnst, 2006; Iero et al., 2008; Li et al., 2006).
Lo scopo di questo lavoro preliminare è stato quello di mettere a punto un metodo per verificare se esosomi potessero essere rilasciati da processi astrocitari derivanti da cellule gliali cresciute e maturate in vivo, e successivamente di iniziare una caratterizzazione sia del corredo proteico delle microvescicole isolate e purifcate, sia di andare a valutare se queste possiedono i requisiti fisici per poter essere classificate come esosomi.
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