Gli esperimenti su uorofori in vitro, senza cellule vive, sono stati eettuati nelle fasi di ottimizzazione dell'apparato sperimentale (4) e per testare alcuni reagenti anti-bleaching.
Sono stati preparati due tipi di campioni: uorofori legati al CoA in willco con ricoprimento di polilisina e uorofori biotinilati in willco con ricoprimento di strepta- vidina.
La polilisina è utilizzata per facilitare l'adesione dei uorofori grazie all'interazione elettrostatica tra la carica negativa dei uorofori (e del CoA) e la carica positiva della polilisina.
L'utilizzo di uorofori biotinilati in willco su ricoprimento di streptavidina vuole simulare una condizione più simile agli esperimenti su cellule, in cui i uorofori non sono adesi al fondo della willco. La streptavidina è una proteina tetramerica, in cui sono presenti quattro siti di legame molto stabile con la biotina, una piccola molecola organica; tale legame, con una costante di dissociazione di∼10-14M, è uno dei più forti
legami non covalenti presenti in natura.
3.2.1 Willco con ricoprimento di polilisina e uorofori adesi
Sul fondo in vetro della willco viene deposta un quantità di polilisina su ciente per ricoprirlo. Per willco con fondo in vetro di diametro 12 mm si usano tipicamente 150 µl di soluzione di polilisina (Poly-L-lysine solution; peso molecolare 150,000-300,000 dalton, soluzione 0.01%, sterile e ltrata, BioReagent; Sigma-Aldrich). La willco è poi posta in incubatore a 37°Cper un tempo minimo di 1 h; se deve essere conservataper un tempo superiore a 12 h, viene poi posta in frigorifero a 4 °C.
Dopo aver eettuato un lavaggio, nella willco è aggiunta una soluzione in PBS di uorofori CoA-Abberior Star 635p e CoA-Abberior Star 488. Per studi a singola molecola le concentrazioni di uorofori sono dell'ordine del nM, per studi bulk le concentrazioni sono dell'ordine di 10nM -1μM; dopo 30 minuti vengono eettuati 5 lavaggi con PBS.
Dopo i lavaggi viene aggiunto 1 ml di PBS per l'osservazione in assenza di reagenti anti-bleaching e 1 ml di soluzione di reagenti in PBS per l'osservazione dell'eetto di tali sostanze. La modalità di preparazione e le concentrazioni utilizzate per i reagenti anti-bleaching sono riportate nella sezione 3.2.3.
3.2.2 Willco con ricoprimento di streptavidina e uorofori bio-
tinilati
Biotinilazione dei uorofori
Un processo di biotinilazione consiste nella coniugazione della biotina ad un'altra mo- lecola. Esistono vari reagenti di biotinilazione che variano a seconda del sito a cui viene legata la biotina. Volendo realizzare una reazione di biotinilazione dei uoro- fori Abberior® STAR 635P, NHS ester e Abberior® STAR 488, NHS ester, si usa come reagente di biotinilazione il cloridrato di norbiotinammina (Norbiotinamine hy- drochloride Sigma Aldrich) in modo da sfruttare l'interazione tra il gruppo estere di NHS (N-HydroxySuccinimide) con cui sono funzionalizzati i uorofori e l'ammina a cui è legata la biotina; questi formano un legame ammidico -(C=O)-(NH)- (vedi Fig. 3.1) con eliminazione di un NHS.
Il solvente in cui si eettua la reazione è il dimetilsolfossido (Dimethyl sulfoxide - DMSO), di formula (CH3)2SO; si tratta di un solvente polare aprotico, per cui non ci
sono né accettori né donori di protoni (H+); siccome la norbiotinammina è disponi-
bile come cloridrato, mentre la forma reattiva nella reazione è l'ammina deprotonata, nella reazione è utilizzata anche una sostanza basica solubile in dimetisolfossido che non interagisca con il gruppo estere-NHS, in modo che possa accettare il protone (so- litamente insieme al cloruro, in DMSO) dalla norbiotinammina; sostanze con queste caratteristiche sono le ammine ternarie, per cui abbiamo utilizzato la trietilammina.
Figura 3.1: Schema della reazione di biotinilazione di esteri di uorofori-NHS. In alto: il cloridrato di norbiotinammina (biotina coniugata con un'ammina primaria R-NH2 con addizionato acido cloridrico HCl), reagisce con la trietilammina per
produrre norbiotinammina deprotonata. In basso è rappresentata la biotinilazione di un estere uoroforo-NHS. È riportata come esempio la struttura del uoroforo uoresceina: sono visibili gli anelli aromatici che danno alla molecola le proprietà di uorescenza e il gruppo NHS (anello pentagonale con formula C4H4NOH, che
ha formato un estere con un gruppo carbossilico -COOH dopo rilascio di H2O)
inserito tramite legame estereo nelle strutture dei uorofori per renderli reattivi con le ammine. Le reazioni avvengono in DMSO, per cui sono riportati gli stati di protonazione più probabili in tale solvente.
La reazione viene quindi realizzata preparando una soluzione di Norbiotinamine hydrochloride e Triethylamine (Sigma Aldrich) in DMSO con rapporto in moli 1:1.5. Questa soluzione viene poi aggiunta a soluzioni dei due uorofori in DMSO. La reazio- ne è realizzata in modo che il rapporto tra uoroforo e Norbiotinamine hydrochloride sia 1:1 in moli.
L'esito della reazione è controllato mediante HPLC-MS, high performance liquid chromatography-mass spectrometry, realizzato con un cromatografo Dionex Ultimate 3000 HPLC interfacciato con spettrometro di massa ABSciex API 3200 Q-TRAP. Preparazione delle willco.
La streptavidina lio lizzata (Streptavidin lyophilized, IBA) viene dissolta in PBS a concentrazione 10 mg/ml. Circa 150 μl sono aggiunti nella willco che è poi posta in incubatore per 12 ore.
Successivamente la willco viene lavata 4 volte e si aggiunge una soluzione in PBS di uorofori Abberior Star 635p e Abberior Star 488 biotinilati. Per realizzare una condizione di bulk vengono utilizzate concentrazioni rispettivamente di 200nM e 10μM (come spiegato nella sezione 6.2.2); dopo 30 minuti vengono eettuati 5 lavaggi con PBS e viene aggiunto 1 ml di PBS per l'osservazione in assenza di reagenti anti- bleaching e 1 ml di soluzione 1mM di trolox in PBS per l'osservazione del suo eetto.
3.2.3 Soluzioni di reagenti anti-bleaching
Acido ascorbico
L'acido ascorbico (L-Ascorbic acid, Sigma Aldrich) è stato testato in esperimenti condotti su cellule vive.
È stata perciò preparata una soluzione in terreno DMEM/F-12 Starvation a concentrazione 100 mM, come indicato in[37, 2]. Il pH della soluzione è stato riportato al valore siologico di 7.5 tramite l'aggiunta controllata di NaOH.
Nella willco contenente le cellule è aggiunto 1ml di questa soluzione per l'osserva- zione al microscopio.
Propil gallato
Il propil gallato (NPG, Sigma Aldrich) è stato prima testato in vitro per i motivi illustrati in 6.2.2. È stata scelta una concentrazione di 5μM tale da poter diminuire il photobleaching ma non in ciare la vitalità cellulare, secondo quanto riportato in letteratura [41, 28].
Per gli esperimenti in vitro, un giorno prima del suo utilizzo, viene preparata una soluzione di NPG in PBS a una concentrazione di 700 μM. La soluzione è agitata tutta la notte (o.n.) a temperatura ambiente e viene protetta dalla luce ricoprendo la falcon che la contiene con carta stagnola.
Il giorno dell'osservazione la soluzione è diluita in PBS no ad una concentrazione di 5μM e nella willco contenente i uorofori viene aggiunto 1 ml di quest'ultima soluzione.
Per l'utilizzo in esperimenti su cellule vive, la prima soluzione e la successiva diluizione sono preparate in terreno DMEM/F-12 Starvation.
Trolox
Analogamente al propil gallato, il 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (chiamato commercialmente Trolox, Sigma-Aldrich) è stato testato prima in vi- tro ed è stata individuata in letteratura una concentrazione e cace per diminuire il photobleaching ma non in ciare la vitalità cellulare [33]. Tale concentrazione è 1mM. Negli esperimenti sul photobleaching in vitro, un giorno prima del suo utilizzo, viene preparata una soluzione di trolox in PBS a una concentrazione di 1mM. La soluzione è agitata o.n. a temperatura ambiente. Per l'osservazione nella willco contenente i uorofori viene aggiunto 1 ml della soluzione.
Per l'utilizzo in esperimenti su cellule vive, la soluzione di trolox è preparata in terreno DMEM/F-12 Starvation. Dopo avere agitato la soluzione o.n., il giorno successivo la soluzione è illuminata con una lampada UV (Spectroline ENF 260C/FE, 6W) a 254 nm per 20 minuti per velocizzare la formazione del trolox-chinone e rendere il reagente potenzialmente e cace anche sul blinking. L'irraggiamento avviene mentre la soluzione si trova in una provetta falcon posta a circa 15 cm dalla lampada.
In esperimenti su cellule vive, al momento dell'osservazione nella willco viene ag- giunto 1 ml della soluzione di trolox a concentrazione 1mM in terreno DMEM/F- 12 Starvation più 7μl della soluzione di NPG a concentrazione 700 μM in terreno DMEM/F-12 Starvation, per avere delle concentrazioni nali per i due reagenti rispettivamente di circa 1mM e 5μM.
Negli esperimenti sulla formazione del trolox-chinone (sezione 6.3), per le misure di assorbanza è stato utilizzato lo spettrofotometro a due fasci Jasco V 550 (JASCO Europe, Cremello, Italy) misurando lo spettro da 200 a 400 nm con larghezza di banda di 1 nm e passo di 0.5 nm.