Sovrapposizione dei due canali

Grazie all'acquisizione per la calibrazione eettuata con le microsfere viene deter- minata la funzione che stabilisce una relazione tra le coordinate dei punti nei due canali.

Vengono utilizzate due griglie, una su cui calcolare la trasformazione e un'altra su cui valutare l'incertezza associata; la prima ha una densità di punti maggiore o uguale alla seconda. Per entrambe le griglie vengono eettuate le operazioni sotto descritte, implementate con i codici MatLab riportati in A.2.

ˆ Viene creata una proiezione di massima intensità della sequenza di immagini acquisita; in questa proiezione è visibile la sferetta in tutte le diverse posizioni.

Figura 5.1: Processo di calibrazione dei due canali. L'acquisizione con le microsfere è stata eettuata solo sulla ROI di interesse; nella prima immagine è mostrata la proiezione di massima intensità della sequenza di immagini ottenute (l'immagine ha dimensioni 54.40 x 20.48 μm), la seconda immagine mostra la divisione di questa proiezione nelle parti corrispondenti ai due canali. Su queste due immagini vengono utilizzati gli algoritmi di localizzazione del software u-track e le coordinate ottenute sono mostrate nella terza immagine (i punti rossi rappresentano le coordinate degli spot rilevati nel canale rosso, i punti verdi le coordinate degli spot rilevati nel canale verde). L'ultima immagine mostra l'eetto dell'applicazione su tali punti di una funzione di trasformazione ottenuta da un'altra calibrazione di questo tipo ottenuta nella stessa sessione sperimentale.

ˆ La proiezione di massima intensità è divisa nelle parti corrispondenti ai due canali; la divisione deve tenere conto della disposizione delle nestre al momento dell'esperimento, che può variare in quanto le nestre possono essere spostate attraverso le manopole del dual view e le loro dimensioni possono essere cambiate

tramite le regolazioni sul dual view stesso e sull'optomask. L'algoritmo per la divisione tiene perciò conto della particolare disposizione delle nestre per avere le immagini che eettivamente corrispondono ai due canali.

ˆ Su ognuna delle due immagini così ricavate vengono utilizzati gli algoritmi di localizzazione di u-track. Essendo le sferette molto brillanti i parametri alfa locale e alfa ampiezza sono impostati generalmente al valore 1%; inoltre, poi- ché ad ogni spot corrisponde un'unica sferetta, non viene utilizzata la funzione che testa l'aggiunta di ulteriori gaussiane attorno ad un unico massimo, per cui il valore alfa residui non deve essere impostato e alfa distanza può essere impostato al valore 1%; il parametro di deviazione standard del prolo laterale della psf è impostato al valore 0.8.

Le coordinate dei punti della prima griglia sono utilizzate per determinare la funzione che stabilisce una relazione tra i punti nei due canali; le coordinate dei punti della seconda griglia sono utilizzate per valutare l'incertezza associata alla trasformazione tramite il calcolo della radice dell'errore quadratico medio, come discussonella sezione successiva. La funzione MatLab sviluppata per la determinazione della funzione di sovrapposizione e dell'incertezza associata è riportata in A.3. La Figura 5.1 illustra qualitativamente le fasi del processo di calibrazione.

Determinazione della funzione di sovrapposizione

Disponendo delle coordinate di N coppie di punti di controllo, di coordinate (xi, yi)

in un canale e (Xi, Yi) nell'altro, si devono determinare due funzioni f e g tali che

X = f (x, y) e Y = g(x, y). Si può formulare il problema considerando due set di triplette di dati (xi, yi, Xi)e (xi, yi, Yi)ed adoperando una procedura di t ai minimi

quadrati. Questo t può essere implementato tramite l'ausilio dell'Image Processing Toolbox di MATLAB, il quale permette di utilizzare diversi tipi di funzioni per la trasformazione.

Sono state confrontate varie trasformazioni per stabilire quale desse un risultato più accurato. In particolare si è provato ad utilizzare (in ordine di complessità) tra- sformazioni di similitudine, di anità, di proiezione, polinomiale e di media locale pesata. Le prime quattro sono trasformazioni globali, l'ultima è locale. Una trasfor- mazione globale utilizza un'unica funzione di trasformazione per l'intera immagine; se sono presenti distorsioni locali si possono ottenere risultati più accurati utilizzando funzioni diverse per diverse zone dell'immagine.

Il metodo di media locale pesata descritto in [21] è un metodo di interpolazione in cui ai punti di controllo di un canale corrispondono esattamente i punti di controllo dell'altro canale:

Xi= f (xi, yi)e Yi= g(xi, yi)per i = 1 ... N.

In un metodo detto di approssimazione, invece, i punti di controllo di un canale vengono trasformati in modo che siano il più vicino possibile a quelli dell'altro canale:

Xi≈ f (xi, yi)e Yi≈ g(xi, yi)per i = 1 ... N.

L'idea che sta alla base del metodo della media locale pesata è quella di ricavare la funzione di trasformazione da applicare a un generico punto utilizzando solo i punti di controllo ad esso più vicini. Per ogni punto di controllo (xi, yi) vengono

individuati gli n − 1 punti di controllo più vicini (n ≥ 6); utilizzando questi e i corrispondenti punti nell'altro canale, viene determinata una funzione polinomiale ad nparametri per ognuna delle due coordinate; ad esempio se n = 6 la funzione sarà un polinomio del secondo ordine. Per ognuna di queste funzioni viene determinato il raggio di inuenza pari alla distanza dal punto di controllo centrale del punto più lontano tra quelli utilizzati per denire la trasformazione. Dato un punto arbitrario (x, y), il valore X (e Y ) corrispondente è determinato da una media pesata di tutti i polinomi che comprendono quel punto nel loro raggio di inuenza; il peso è una

funzione decrescente della distanza ed è tale da rendere la media pesata continua e innitamente derivabile in tutti i punti[21].

Nell'implementazione utilizzata in MatLab gli n punti sono utilizzati per deter- minare un polinomio di secondo grado; quindi i punti di controllo di un canale sono trasformati esattamente nei punti di controllo dell'altro canale solo per n = 6.

Per stimare l'errore associato alla trasformazione, si trovano in letteratura due possibili metriche: l'errore di registrazione di ducia (ducial registration error - FRE) e quello di bersaglio (target registration error - TRE) [18]. Il primo è la radice dell'errore quadratico medio calcolato nei punti di controllo, il secondo è l'errore quadratico medio in punti non utilizzati per determinare la funzione di trasformazione. La radice dell'errore quadratico medio (root mean square error - RMSE) è data da:

RM SE = v u u u t M P i=1 [xi,1− f (xi,2)] 2 M , (5.1)

dove M è il numero di punti su cui si valuta la trasformazione (nel caso del FRE si ha M = N ), i pedici 1 e 2 indicano i due canali e f è la funzione che trasforma le coordinate dei punti del canale 2.

Il FRE non è adatto per valutare l'eetto di una trasformazione di interpolazione in quanto i punti di controllo di un canale vengono trasformati in modo da corrispon- dere esattamente ai punti di controllo dell'altro canale. Il TRE può essere valutato come in [21] escludendo una parte dei punti di controllo, determinando la trasforma- zione utilizzandone i rimanenti e usando gli M punti esclusi per valutare su di essi l'eetto della trasformazione con l'espressione (5.1) oppure come in [13]escludendo se- quenzialmente una coppia di punti di controllo alla volta, calcolando la trasformazione con i punti rimanenti e valutando l'eetto con l'espressione:

T RE = v u u u t N P i=1 [xi,1− fi(xi,2)] 2 N (5.2)

dove la fiè la funzione di trasformazione determinata escludendo il punto i-esimo.

Per confrontare i diversi tipi di trasformazione è stata acquisita una griglia costi- tuita da 300 punti di controllo che ricoprono le intere nestre (dimensioni 336 x 335 pixel). Su questo insieme di punti sono state calcolate le varie trasformazioni. Si è poi calcolato il FRE, secondo la formula (5.1) (M = 300) e il TRE come descritto in [13], ossia tramite l'espressione (5.2); inoltre si è vericato l'eetto della trasformazione su un'altra griglia di calibrazione costituita da 100 punti che ricoprono le intere nestre adoperando l'espressione (5.1) (M = 100).

Si sono calcolate le stesse quantità anche considerando solo i punti delle stesse griglie compresi in una tipica ROI su cui vengono acquisiti i lmati dei recettori marcati (di dimensioni 340 x 127 pixel); considerando solo tale zona la griglia di 300 punti diventa composta da 105 punti e quella composta da 100 punti diventa composta da 30 punti. I risultati sono riportati nella tabella 5.1.

Poiché le trasformazioni di similitudine, di anità, di proiezione e polinomiale sono in ordine di generalità crescente, cioè ognuna include quelle precedenti, si vede che l'accuratezza della trasformazione aumenta come atteso. Le due nestre possono avere un disallineamento meccanico che potrebbe essere corretto semplicemente con una rototraslazione, tuttavia si vede come la trasformazione di similitudine che include rototraslazione e anche riscalamento risulta poco accurata; ciò è dovuto al fatto che la trasformazione deve anche correggere eetti causati da aberrazioni cromatiche.

Trasf. FRE

(nm) TRE(nm) TRE'(nm) FRE(nm)R TRE(nm)R TRE'(nm)R

similitudine 66 66 75 44 45 43 anità 20 20 24 11 12 12 proiezione 18 18 22 9 10 12 polin (gr2) 14 12 18 8 8 11 polin (gr3) 12 12 16 7 8 10 m.l.p 4 7 20 3 6 105

Tabella 5.1: Errore di sovrapposizione dato dai diversi tipi di trasformazione (simi- litudine, anità, proiezione, polinomiale di grado 2 e 3, media locale pesata). Le trasformazioni sono state calcolate tramite l'acquisizione di una griglia costituita da 300 punti di controllo che ricoprono tutto il campo di vista. Il FRE è stato calco- lato dalla formula 5.1 tramite l'espressione 5.2. Il TRE' è stato calcolato tramite l'espressione 5.1 dove gli M punti sono 100 punti di controllo che ricoprono tutto il campo di vista derivanti dall'acquisizione di un'altra griglia di calibrazione. FRER,

TRER e TRE'R sono le analoghe quantità calcolate considerando solo una tipica

ROI su cui vengono acquisiti i lmati dei recettori marcati.

Considerando FRE e TRE la trasformazione più accurata è risultata la media locale pesata. Valutando l'eetto sulla seconda griglia questa trasformazione ha dato però un errore di sovrapposizione maggiore rispetto ad una polinomiale; tale errore è risultato particolarmente elevato sulla valutazione nella ROI. La trasformazione di media locale pesata è stata calcolata considerando n = 12. Si è valutato allora l'errore di sovrapposizione dato dalla media locale pesata sulla seconda griglia (considerando la ROI) variando n (tabella 5.2).

n TRE'_ROI(nm) 12 105 13 84 14 31 15 12 16 10 17 10 20 10 23 5 25 9 30 10 35 10 40 10

Tabella 5.2: Errore di sovrapposizione della trasformazione di media locale pesata al variare del numero n di punti su cui viene vengono calcolati i polinomi che vengono mediati. L'errore è valutato su una griglia diversa da quella usata per la calibrazione ed entrambe le griglie comprendono punti solo nella ROI. Il minimo a n=23 è da attribuire alle particolari coppie di griglie utilizzate, e non può essere considerato come numero ottimale in generale.

Aumentando n da 12 no a 23 l'errore diminuisce no a 5 nm per poi crescere ancora all'aumentare di n no a un valore di 10 nm, pari a quello dato da una trasformazione polinomiale.

Questo comportamento è probabilmente dovuto al fatto che, utilizzando n troppo piccolo, i polinomi risultanti dal t possono essere mal condizionati, cioè passare per i punti di controllo ma avere grosse oscillazioni o comunque comportamenti troppo

incostanti al di fuori di essi (infatti l'eetto è visibile valutando la trasformazione su una griglia formata da punti in posizioni diverse); allo stesso tempo, se n diventa grande il metodo non è più locale e infatti il risultato diventa equivalente a quello di una trasformazione polinomiale globale.

Dal momento che il metodo di media locale pesata può dare risultati poco atten- dibili, si è deciso di utilizzare una trasformazione polinomiale di terzo grado che è risultata la più accurata tra le altre. Inoltre, poiché i risultati migliorano se le griglie comprendono solo punti compresi in una ROI, la calibrazione è stata eettuata ac- quisendo le immagini per le griglie solo in una ROI, e ho acquisito tutti i lmati nel corso dell'esperimento nella medesima zona.