Utilizzando le due diverse polarizzazioni (parallela e perpendicolare al piano di in- cidenza, come de nito nella sezione 1.2.2) per la luce di eccitazione si sono notate
dierenze di intensità nell'emissione. Si è voluto veri care se tali dierenze fosse- ro dovute solo alla diversa intensità dell'onda evanescente all'interfaccia per le due polarizzazioni (gra co 1.13) o se potessero esserci contributi dovuti ad una direzio- ne preferenziale di orientamento dei dipoli dei uorofori, per essere più sicuri del confronto dei risultati su uorofori adesi al vetro con quelli in cellule vive.
Sono state eseguite delle misure su campioni costituiti da uorofori Abberior Star 635p adesi al fondo di willco con ricoprimento di polilisina utilizzando una concentrazione di uoroforo di 5 nM per poter visualizzare le singole molecole.
Mediante microscopia TIRF ho acquisito lmati composti da 500 fotogrammi; per l'eccitazione è stato utilizzato il laser a 635 nm impostando una lunghezza di pene- trazione dell'onda evanescente di 110 nm. Le misure sono state eseguite selezionando le due diverse polarizzazioni per l'onda evanescente.
Dalla formula (1.3), utilizzando per gli indici di rifrazione i valori dell'acqua e del vetro, si ricava un valore dell'angolo di incidenza pari a 68.73°; per tale valore ci si aspetta un rapporto tra le intensità dell'onda evanescente all'interfaccia nel ca- so di polarizzazione perpendicolare e parallela pari a 0.797 (vedi anche il gra co in Fig. 1.13). Essendo la uorescenza emessa direttamente proporzionale all'intensità di eccitazione, se si trascurano le dierenze nella polarizzazione dell'emissione e le dierenze di trasmittività all'interfaccia per le diverse polarizzazioni ad angoli diversi ci si aspetta un rapporto simile anche tra il segnale rivelato utilizzando le due diverse polarizzazioni.
Per determinare l'intensità di emissione nei due casi ho utilizzato il software u- track (descritto nella sezione 5.1) mediante il quale sono stati individuati gli spot corrispondenti ai singoli uorofori e sono state ricostruite le loro tracce di intensità lungo il lmato. È stata poi ricavata l'intensità media di ogni traccia per ricavare il segnale medio emesso dal singolo uoroforo e in ne i segnali dei vari uorofori sono stati mediati ricavando una misura dell'intensità per i due casi. Ho ottenuto un rapporto tra le intensità pari a 0.724±0.009. Questo valore è signi cativamente minore del valore sopra riportato di 0.797, e ciò potrebbe far pensare ad un angolo medio fra il piano dell'interfaccia ed il dipolo di eccitazione del uoroforo inferiore a 45º; tuttavia, gli eetti trascurati dovuti alla polarizzazione nell'emissione porterebbero anch'essi ad una diminuzione di tale rapporto, e la loro stima va oltre gli scopi di questa tesi, per cui siamo propensi a concludere che eetti diversi dalla dierenza di intensità di eccitazione abbiano impatto minimo.
4.4 Sovrapposizione delle nestre dei due canali
Per poter confrontare le immagini acquisite nelle due nestre e poter in particolare cercare le colocalizzazioni (come verrà illustrato nella sezione 5.2.2 a pagina 66), è necessario disporre di una relazione tra le coordinate delle particelle rievate nei due canali.
A tale scopo, vengono utilizzate delle microsfere (TetraSpeck Fluorescent Micro- spheres) che presentano quattro picchi di eccitazione/emissione dal range del blu a quello del rosso: 360/430 nm , 505/515 nm , 560/580 nm e 660/680 nm; consideran- do le larghezze dei picchi di eccitazione ed emissione, e fenomeni di trasferimento di energia fra uorofori diversi, la uorescenza può essere praticamente eccitata ovunque nello spettro del visibile, ed osservata a qualsiasi lunghezza d'onda maggiore di quel- la di eccitazione. Le sferette possono quindi essere visualizzate simultaneamente in entrambi i canali. Esse risultano particolarmente adatte anche per le caratteristiche di brillantezza e fotostabilità che permettono di avere un'incertezza di localizzazione piccola (dell'ordine dei nm) e quindi una calibrazione più accurata.
Figura 4.6: In alto sono mostrate le immagini acquisite mentre una singola sferetta si trova nelle due posizioni all'estremità superiore sinistra e all'estremità inferiore destra del campo di vista (sono le sole posizioni cercate manualmente come spiegato nel testo); si può osservare come la sferetta sia visibile in entrambi i canali. In basso è mostrata la proiezione di massima intensità di un lmato in cui in ogni fotogramma la sferetta si trova in una diversa posizione del campo di vista. Questo tipo di lmato è utilizzato per la calibrazione delle due nestre.
Per tale calibrazione si utilizza una willco contenente la sferette a densità molto bassa in quanto si vuole far in modo da avere una sola sferetta nel campo di vista quando si acquisiscono le immagini.
Vengono utilizzate le sferette di dimensione 0.5µm. La sospensione fornita dalla ditta, a densità 1.5 · 109 particelle/ml, viene diluita 10 volte in acqua. 5µL della
sospensione sono applicati sul vetrino della willco facendo spargere bene la goccia. Si aspetta che la goccia si asciughi, si sciacqua e si aggiunge acqua sul campione asciutto per l'osservazione.
La willco contenente le sferette viene conservata a 2 − 6◦C, ricoperta di carta
stagnola per essere protetta dalla luce, ed è utilizzata prima di ogni esperimento a due colori.
Al momento della calibrazione, le sferette vengono eccitate utilizzando il laser a 488 nm. Si cerca una zona della willco in cui sia presente una sola sferetta e tra- mite un controllo automatico dei movimenti del tavolino portaoggetti viene acquisito un lmato in cui in ogni fotogramma l'immagine delle sferetta è spostata, in modo da ricoprire tutto il campo di vista di interesse. Questo può essere fatto sfruttan- do il tavolino portaoggetti motorizzato e la modalità Mark & Find del software di acquisizione LAS AF (Leica Application Suite for Advanced Fluorescence), la quale permette di memorizzare la posizione attuale del campione e di richiamarla per ef- fettuare un'acquisizione; possono essere memorizzate molteplici posizioni in modo da registrare sequenzialmente immagini corrispondenti a posizioni diverse.
Per poter acquisire l'immagine della sferetta in centinaia di posizioni senza dover spostare manualmente il campione, è stata creata un'applicazione tramite il software MatLab (riportata nella sezione A.1) la quale riceve in input il le in cui LAS AF memorizza le coordinate di due posizioni e scrive in un le analogo, leggibile dalla funzione Mark & Find, le coordinate di un numero a piacere di punti posizionati secondo una griglia; la griglia è costruita in modo che le due posizioni fornite in input rappresentino rispettivamente il punto all'estremità superiore sinistra e il punto all'estremità inferiore destra. In questo modo è su ciente spostare il campione solo in due posizioni (quelle in cui la sferetta è visualizzata nell'angolo superiore sinistro e nell'angolo inferiore destro del campo di vista), memorizzarle, utilizzare l'applicazione per scrivere molto velocemente le coordinate di tutti gli altri altri punti e tramite la modalità Mark & Find acquisire una sequenza di immagini. Nella Figura 4.6 è riportata la proiezione di massima intensità di un lmato acquisito secondo questa procedura.